<i>in vitro</i> Screening and Identification of Mutants with Weak Alkali-tolerance of <i>Vaccinium uliginosum</i> Linn.-文献传递-植物通论文库

摘要：以笃斯越桔组培苗为试验材料,建立了EMS诱变体系,采用EMS诱变与NaHCO₃共同胁迫处理的方法,筛选耐弱碱候选突变体,并进行了相关生理指标的鉴定,以明确其突变体株系的耐弱碱能力。结果显示:(1)0.4% EMS浸泡笃斯越桔茎段4 h为较适宜的诱变剂量,存活率达46.7%;在含0.1% EMS的培养基中处理3 d,存活率达50.0%;EMS浸泡处理后,NaHCO₃适宜剂量为8 mmol·L^-1,经3次交替培养后,筛选出2株候选耐弱碱突变体。(2)相关生理指标鉴定表明,2株候选突变体的SOD和POD活性及游离脯氨酸含量显著高于对照,MDA含量显著低于对照。研究表明,该研究获得的笃斯越桔候选突变体具有一定的耐弱碱能力。

Abstract:In this study,the tissue culture seedlings of Vaccinium uliginosum Linn.were used as material,the EMS mutation system has been established,the alkali-resistance mutants were screened by using EMS and NaHCO₃ combinative stress method,and identified with some physiological indexes.The results showed that:(1)0.4% EMS immersion the stem 4 h was the suitable mutation concentration,survival rate could reach 46.7%;when 0.1% EMS was applied into the medium 3 days,survival rate could reach 50%;the suitable concentration of NaHCO₃ was 8 mmol·L^-1,after three times alternating culture,two candidate mutants have been screened;(2)Identification of physiological index showed the activities of SOD,POD and proline content which significantly higher than those in control,the content of MDA which significantly lower than those in control.The study showed the mutants have some ability in weak alkali-tolerance.

全文：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
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基金项目$吉林省科技支撑计划重点项目"
!"#!"!&#
#
作者简介$宋春艳"
#(()
#!女!在读硕士研究生!主要从事果树生物技术研究
2*34/5
$
("&%!"&!$
!66
,783
"
通信作者$宗成文!博士!副教授!主要从事果树遗传育种研究
2*34/5
$
981
:
7;<1
:
=<1
!
45/
>
?1,783
笃斯越桔耐弱碱突变体的离体筛选与鉴定
宋春艳!宗长玲!郑美香!谭智文!宗成文"
"延边大学农学院!吉林延吉
#%%""!
#
摘
!
要$以笃斯越桔组培苗为试验材料!建立了
2@A
诱变体系!采用
2@A
诱变与
B4CDE
%
共同胁迫处理的方法!
筛选耐弱碱候选突变体!并进行了相关生理指标的鉴定!以明确其突变体株系的耐弱碱能力结果显示$"
#
#
",$F
2@A
浸泡笃斯越桔茎段
$;
为较适宜的诱变剂量!存活率达
$+,-F
&在含
",#F2@A
的培养基中处理
%G
!存活率
达
&","F
&
2@A
浸泡处理后!
B4CDE
%
适宜剂量为
3385
(
H
)#
!经
%
次交替培养后!筛选出
!
株候选耐弱碱突变
体"
!
#相关生理指标鉴定表明! 株候选突变体的
AEI
和
JEI
活性及游离脯氨酸含量显著高于对照!
@IK
含量
显著低于对照研究表明!该研究获得的笃斯越桔候选突变体具有一定的耐弱碱能力
关键词$笃斯越桔&
2@A
处理&耐弱碱突变体&鉴定
中图分类号$
L%#(
M
&
&
L%$$
M
#!
文献标志码$
K
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#
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%
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H
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7?5S?R<
!
S=8741G/*
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#
ZG<1S/T/74S/818T
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JEI41G
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1/T/741S5
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S;<781S<1S8T@IK=;/7;0/
:
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/741S5
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$
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45[45/*R<0/0S417<3?S41S
&
/G<1S/T/74S/81
!!
笃斯越桔"
!"##$%$&&($
)
$%*+& H/11,
#属杜
鹃花科"
2R/747<4<
#越橘属"
!"##$%$&
#植物!在中
国主要分布于黑龙江)吉林)内蒙古)辽宁等地区*#+
其果可生食!酸甜可口!汁液丰富!为果酒)果醋)果
酱)果汁及提取天然食用色素的原料!内含有大量对
人体有益的有机酸!人体必需的游离氨基酸!各种维
生素富含花色素苷)类黄酮等化合物!具有防治冠
心病)抑制癌细胞)防止衰老)减缓视疲劳等功效*!*$+
笃斯越桔原生地土壤多为沼泽土!其次是泥炭
沼泽土)草甸沼泽土!在草甸暗棕壤上也有分布但数
量极少土壤适宜
C
为
$,-
"
&,&
*
&*+
+
其大多为
喜酸性植物!但经栽培发现与蓝莓比较其在弱酸性
土壤中也有少数分布*-+!通过诱变处理诱导出耐弱
碱的候选突变体株系!使其后代经组培快繁及鉴定
后!成功筛选耐弱碱突变体!这样就能创造出适宜弱
盐碱环境的新种质资源!为以后种质资源的创新和
利用)优良新品种的培育奠定了一定的基础
突变体的筛选常用化学试剂进行诱变诱导并结
合组培快繁技术!如把材料接种到培养基诱变剂中
和直接浸泡于诱变剂中共同培养在效果上有很大不
同*-+突变体的鉴定一般分为常规的鉴定和分子鉴
定常规的鉴定可以通过形态差异与生理生化指标
的测定进行初步鉴定分子水平一般利用
IBK
分
子标记技术对耐盐突变体进行筛选和鉴定**(+目
前已被广泛应用到与盐胁迫有关的遗传和生理研究
过程*#"+
本研究拟通过建立适宜的
2@A
诱变体系!并
结合
B4CDE
%
共同胁迫笃斯越桔组培苗!在组培快
繁的基础上!筛选耐弱碱候选突变体株系!并通过相
关生理指标的鉴定!证明其突变体株系具有一定的
耐弱碱能力
#
!
材料和方法
=,=
!
试验材料
以采自吉林省长白山区的笃斯越桔"
!"##$%$,
&&($
)
$%*+& H/11,
#优株!采用宗长玲*#+的方法
获得的组培苗为试材
=,>
!
试验方法
=9>9=
!
?.$
浸泡处理对笃斯越桔组培苗成活率和
增殖生长的影响
!
将装蒸馏水的三角瓶高压灭菌后
冷却至室温!然后在无菌条件下用一次性注射器吸
取甲基磺酸乙酯"
>
53!
2@A
#!
经微过滤器注射到以上蒸馏水三角瓶中!温度为室
温"
2@A
在
%"]
时的半衰期为
!&,(;
#!使其体积
浓度百分比分别为
",%F
)
",$F
)
",&F
!之后把预
培养的长势良好的笃斯越桔茎段剪取
#
"
!73
浸泡
在以上三角瓶溶液中"不加
2@A
的三角瓶为对
照#!在振荡培养箱培养每隔
%
)
$
)
&
)
+
和
-;
取出
部分茎段!之后用无菌蒸馏水冲洗
%
"
&
次!洗去残
留的
2@A
!将继代培养试管苗剪成
#
"
!73
!接种
于经预备实验优选出继代培养基"改良
@AM",&
3
:
(
H
)#
OQM",!3
:
(
H
)#
Z^ KM%"
:
(
H
)#蔗糖
M+,&
:
(
H
)#琼脂#中!
C&,!
!每个处理培养基接
种
&
瓶!每瓶接种
$
丛!每丛接种
%
株!每个处理重
复
%
次
%"G
后统计茎段的存活率和增殖倍数培
养条件$培养温度"
!&_!
#
]
!光照度
#&""
"
!"""
5P
!光照时间
#$;
%
G
"下同#
=9>9>
!
?.$
施入处理对于笃斯越桔茎段成活率和
增殖生长的影响
!
在无菌的条件下通过过滤灭菌向
培养基中加入
","&F
)
",#F
和
",!F2@A
!每个处
理培养基接种
&
瓶!每瓶接种
$
丛!每丛接种
%
株!
每个处理重复
%
次将组培苗的茎段剪成
#
"
!
73
!接种于上述配好的不同浓度的
2@A
培养基中
"以不加
2@A
的培养基为对照#!之后
%
)
&
和
-G
转
接没经处理的继代培养基!培养
%"G
后统计茎段的
存活率和增殖倍数
=9>9@
!
A*BCD
@
胁迫对笃斯越桔组培苗生长的影
响及耐弱碱突变体筛选
!
在无菌的条件下通过过滤
灭菌向培养基"改良
@AM",&3
:
(
H
)#
OQM",!
3
:
(
H
)#
Z^ KM%"
:
(
H
)#蔗糖
M+,&
:
(
H
)#琼脂!
C&,!
#中加入不同剂量")
$
)
+
)

)
#"
和
#!3385
%
H
#的
B4CDE
%
!将长势良好的组培苗茎段接种于含
不同浓度
B4CDE
%
的培养基中!每个处理接种
%"
株接种
%"G
后按照盐害分级标准调查盐害指数
和盐害率!
"
级$无盐害症状&
#
级$轻度盐害&
!
级$
中度盐害&
%
级$重度盐害&
$
级$极重度盐害&
&
级$
植株叶全部枯死*#+
盐害率"
F
#
`
受害株数%总株数
a#""F
盐害指数
`
*
#
"代表级值
a
株数#+
a#""
%"最
高级值
a
总株数#
将长势良好的组培苗茎段经
",$F 2@A
渗泡
处理
$;
后!接种于上述实验筛选出的含适宜剂量
B4CDE
%
"
3385
%
H
#的培养基中培养
%"G
后!转接
至上述不含
B4CDE
%
的培养基中培养
%"G
!如此交
替
%
次培养筛选候选耐弱碱突变体!然后将筛选出
的候选突变体植株进行相关生理指标的鉴定
=,>,E
!
候选耐弱碱突变体的鉴定
!
AEI
活性参照
张志良*##+的
B^ Q
"氯化硝基四氮唑蓝#法测定!
JEI
活性参照张志良*##+的愈创木酚法测定!丙二
醛"
@IK
#含量采用硫代巴比妥酸法"
Q^ K
#
*
#!
+测
定!游离脯氨酸含量采用茚三酮比色法*#!+进行测
定分别比较候选耐弱碱突变体株系与对照植株之
间各个生理指标的含量的差异是否达到显著水平
"
-
#
","&
#!以鉴定经上述筛选出的候选突变体株
系是否具有了一定的耐弱碱能力
#(
&
期
!!!!!!!!!!!!!
宋春艳!等$笃斯越桔耐弱碱突变体的离体筛选与鉴定
=,@
!
统计方法
采用
AJAA##,&
与
2P7<5
统计软件包对实验结
果进行方差分析和显著性测验
!
!
结果与分析
>9=
!
笃斯越桔
?.$
化学诱变体系的建立
>9=9=
!
?.$
浸泡处理对笃斯越桔组培苗成活率和
增殖生长的影响
!
如表
#
所示!不同
2@A
浓度及
相应处理时间对笃斯越桔茎段存活状况有很大影
响!
2@A
浓度与处理时间呈负相关其中!
",%F
2@A
处理笃斯越桔茎段时间为
%
"
&;
时!增殖倍
数与对照相比差异不显著&处理时间为
+
"
-;
时!
笃斯越桔茎段与对照相比增值倍数较高且长势好!
颜色为深绿色"图版
$
!
K
#!这说明
",%F 2@A
对
笃斯越桔茎段的生长有一定的促进作用在
",$F
2@A
浸泡茎段
$;
时!存活率为
$+,-F
!约达半致
死剂量!增殖倍数显著高于其它处理!同时组培苗长
得更高!叶片变得更大"图版
$
!
^
#!为诱变处理的
适宜剂量&随着处理时间的进一步延长!这种促进作
用转变为抑制作用!即植株有变矮和叶片有变小的
趋势!叶片也逐渐变得狭窄"图版
$
!
D
"
2
#当浓
度增大至
",&F
时!组培苗全部死亡
>9=9>
!
?.$
施入处理对笃斯越桔茎段成活率和增
殖生长的影响
!
如表
!
所示!在培养基中加入不同
浓度
2@A
对笃斯越桔茎段存活状况有很大影响!
其中!
","&F2@A
对笃斯越桔茎段诱变
&
和
-G
转
接正常培养基!达到略微褐变死亡!但未达到半致死
剂量!植株叶片浅绿色且茎细弱"图版
$
!
N
#随着
2@A
浓度继续提高!组培苗存活率开始明显下降
",#F 2@A
诱变
%G
转接正常培养基!存活率为
&"F
!已经达到半致死剂量!植株叶片浓绿色且茎粗
壮"图版
$
!
C
#而
",!F 2@A
处理笃斯越桔植株
叶片淡黄且枯萎"图版
$
!
Z
#另外!对于转接天数
的观察发现!同一浓度转接
%G
的组培苗的存活率
及增殖倍数与转接
&
和
-G
相比有显著差异!而转
接
&
和
-G
无显著差异
>9>
!
A*BCD
@
胁迫对笃斯越桔组培苗生长的影响
及耐弱碱突变体筛选
由表
%
可以看出!笃斯越桔幼苗盐害率随着盐
摩尔浓度的增加而增加!当
B4CDE
%
摩尔浓度达
+
3385
(
H
)#时!植株全部受害!低级盐害株比例较
高而当
B4CDE
%
的摩尔浓度提高到

"
#"3385
(
H
)#时!几乎所有植株都不能正常生长!
3385
(
H
)#
B4CDE
%
处理达到
-G
时处理植株的生长情况
见图版
$
!
Y
!说明
3385
(
H
)#
B4CDE
%
处理已完
全抑制了植株的生长而筛选真正的耐盐突变体!
选择压力必须达到足以抑制绝大多数个体的正常
生长!因此根据宗长玲*#+实验结果确定笃斯越桔组
表
=
!
不同
?.$
浓度及浸泡时间下笃斯越桔的存活率和增殖生长情况
Q4V5<#
!
2TT<7S8TX4R/8?02@A7817<1SR4S/81041GSR<4S3<1SS/3<81S;<0?RX/X45
R4S<41G3?5S/
5/74S/818TS;<0;88SS/
8T!.&($
)
$%*+&
2@A
浓度
D817<1SR4S/818T2@A
%
F
处理时间
QR<4S3<1SG?R4S/81
%
;
平均苗高
KX:
<0;88S;:
;S
%
73
存活率
A?RX/X45R4S<
%
F
平均增殖倍数
KX:
<3?5S/
5/74S/81R4S<
",%
% &,&< #"","4 %,!7
$ &,G #"","4 %,%7
& &,(G #"","4 %,%7
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- +,!7 #"","4 %,&V
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:
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:
$ ","
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","T ","
:
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:
","T ","
:
+ ","
:
","T ","
:
- ","
:
","T ","
:
Db ) &,G #"","4 %,!7
!!
注$不同字母表示不同浓度)时间梯度胁迫之间在
","&
水平存在显著性差异&下同
B8S<
$
I/TT:
1/T/741SG/TT&
Q;<043<40V<58=,
!(
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
表
>
!
培养基中加入
?.$
对于笃斯越桔茎段存活率和增殖生长的影响
Q4V5!
2TT<7S08T2@A/1341G3?5S/
5/74S/818T!.&($
)
$%*+&
2@A
浓度
D817<1SR4S/818T2@A
%
F
处理时间
QR<4S3<1SG?R4S/81
%
;
平均苗高
KX:
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%
73
存活率
A?RX/X45R4S<
%
F
平均增殖倍数
KX:
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5/74S/81R4S<
","&
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& $,&4 (","V #,%V
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",!
% !,"< +,"< ",#G
& ","T ","T ","<
- ","T ","T ","<
Db ) $,!7 #"","4 #,!V
表
@
!
A*BCD
@
胁迫对笃斯越桔继代苗的生长影响
Q4V5<%
!
Z1
.
?R
>
740<8T0?V7?5S?R)
$%*+&?1G%
0SR<00
B4CDE
%
浓度
D817<1SR4S/818TB4CDE
%
%"
3385
(
H
)#
#
盐害最高级别
C/
:
;<0SG<
:
R<<8T045S/1
.
?R
>
级值
c45?<
株数
B8,
盐害最低级别
H8=<0SG<
:
R<<8T045S/1
.
?R
>
级值
c45?<
株数
B8,
盐害指数
A45S/1
.
?R
>
/1G盐害率
A45S/1
.
?R
>
R4S/8
%
F
" " " " %" ",""T "7
$ ! - " #" ",#< +-V
+ % + # ",%(G #""4
$ $ # % ",&%7 #""4
#" & $ % & ",-(V #""4
#! & #" % # ",+4 #""4
图
#
!
候选耐弱碱突变体
AEI
)
JEI
活性及丙二醛)脯氨酸含量差异比较
d/
:
,#
!
Q;!
JEI41GS;<781S<1S08T@IK
!
R85/1培苗耐
B4CDE
%
变异体的适宜剂量为
3385
(
H
)#
!最后选出的耐弱碱突变体
!
株!即突变体
#
和
突变体
!
"图版
$
!
b
)
H
#
>,@
!
耐弱碱突变体的鉴定
将
!
种候选耐弱碱植株和对照植株进行
AEI
)
JEI
活性以及丙二醛"
@IK
#)游离脯氨酸含量测
定!通过
AJAA
软件进行单因素方差分析!分别对两
种突变体与对照植株进行邓肯差异性检验比较"
-
#
","&
#!结果如图
#
所示由图
#
可知!
!
个经诱
变处理的突变体植株
AEI
)
JEI
活性显著高于对
照!
@IK
含量显著低于对照!游离脯氨酸含量显著
高于对照!这说明诱变处理以及弱碱
B4CDE
%
胁迫
%(
&
期
!!!!!!!!!!!!!
宋春艳!等$笃斯越桔耐弱碱突变体的离体筛选与鉴定
对笃斯越桔的组培苗产生了一定的影响在弱碱胁
迫下突变体植株细胞内可以启动保护酶防御系统!
抑制膜质的过氧化作用!产生了清除
@IK
的能力
或者使
@IK
的生成减少!并积累更多的脯氨酸!以
增强对弱碱环境引起的渗透胁迫的抵抗能力!对通
过诱变获得的候选耐弱碱突变体株系鉴定提供了可
靠的依据
%
!
讨
!
论
张兰*#%+采用
",#F
"
",!F 2@A
浸泡和
","#F
2@A
加入培养基中诱变与
B4D5
共同胁迫苹果砧木
组培苗!成功获得了耐盐植株高胡静等*#$+使用
2@A
诱导百合愈伤组织时发现随着
2@A
浓度的增
加其存活率降低!且低浓度的
2@A
促进植株分化
以及再生本实验研究
2@A
浸泡法以及施入法时
也得到低浓度"体积浓度百分比#的
",$F 2@A
浸
泡越桔茎段和
",#F 2@A
施入培养基中对组培苗
的生长有促进作用!但随着
2@A
浓度的增加其存
活率降低!这可能与低浓度的
2@A
对细胞呼吸强
度及细胞色素氧化酶活性有刺激作用!而较高浓度
2@A
则表现抑制效应有关另外!本研究中发现除
了浓度外!其处理时间的影响也很大本实验采用
两种处理方式与
B4CDE
%
共同作用!其中
2@A
浸
泡的效果!植株长势更好!这与刘艳萌*#&+研究结果
相一致
e8GR/
:
8
等*#++在离体条件下也采用
2@A
处理花梗获得菊花突变材料因此本实验选择
2@A
与弱碱共同胁迫处理!筛选耐弱碱突变体
孙振元等*#-+利用
B4CDE
%
对毛白杜鹃进行离
体耐弱碱突变体的筛选和鉴定!得到了
3385
%
H
剂量的
B4CDE
%
对其组培苗达到了半致死效应!在
本实验中适宜笃斯越桔组培苗半致死剂量的
B4C*
DE
%
浓度"摩尔浓度#也为
3385
%
H
利用
2@A
与
B4CDE
%
共同胁迫植株筛选耐弱碱突变体报道
较少!筛选笃斯越桔耐弱碱突变体更加罕见!因此本
实验利用较低的选择压力
2@A
与
B4CDE
%
共同胁
迫!成功筛选出
!
株突变体!对于笃斯越桔植株耐碱
方面的研究具有一定的创新意义为了进一步确定
其突变体的可能性!本实验也通过常规方法鉴定了
其生理指标
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)
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以及游离脯氨酸的水
平!得到的结论与刘艳萌*#&+对草莓离体诱变耐盐突
变体生理指标的鉴定相一致!但是本研究仅得到较
少的笃斯越桔侯选突变体株系及其初步的生理鉴
定!今后应深入开展相关笃斯越桔耐盐碱分子水平
方面的的研究!随着
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及
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技术的不断成熟!其在耐盐碱的离体诱变和突变体
的筛选上有十分广阔应用前景
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宋春艳!等$笃斯越桔耐弱碱突变体的离体筛选与鉴定

in vitro Screening and Identification of Mutants with Weak Alkali-tolerance of Vaccinium uliginosum Linn.

笃斯越桔耐弱碱突变体的离体筛选与鉴定

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