全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 42(3): 267-273(2012)
收稿日期: 2011-10-18; 修回日期: 2012-02-27
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(30971895; 31011130031);新世纪优秀人才支持计划(NCET-07-0520);教育部博士学科点基金
(200804340006)
通讯作者: 李向东,教授,博士,主要研究方向为植物病毒学; E-mail: xdongli@sdau. edu. cn
共同第一作者: 王 洁(1984 - ),女,山东商河人,博士研究生,主要研究方向为植物病毒学;
刘金亮(1978 - ),男,山东安丘人,博士,副教授,主要研究方向为植物病毒学。
HC-Pro 3 个参与抑制 RNA沉默氨基酸位点的鉴定
王 洁1#, 刘金亮2#, 阴 筱1, 高 瑞3, 刘红梅3, 李向东1*, 刘焕庭4
( 1山东农业大学植物保护学院, 泰安 271018; 2吉林大学植物科学学院, 长春 130062; 3山东农业大学生命科学学院, 泰安 271018;
4Scottish Structural Proteomics Facility (SSPF), University of St Andrews, North Haugh, St Andrews, KY16 9ST, Scotland)
摘要:马铃薯 Y病毒属病毒编码的辅助成分-蛋白酶(helper component-proteinase,HC-Pro)是第一个被鉴定的 RNA 沉默抑
制因子。 本研究通过定点突变的方法获得了马铃薯 A病毒(Potato virus A,PVA)HC-Pro的 3 个突变体, 利用农杆菌共浸
润的方法分析了这些突变对 HC-Pro抑制 RNA沉默活性的影响。 与野生型 HC-Pro处理相比,Phe6、Asn11缺失突变体的处
理中绿色荧光减弱,而 Ile250 -Gly251 -Asn252( IGN)基序中的 Ile 和 Gly 分别突变为 Asp 和 Glu 的处理中观察不到绿色荧光。
该结果表明 Phe6、Asn11和 IGN250 3 个位点均参与调控 HC-Pro的抑制 RNA沉默活性。
关键词: HC-Pro; 定点突变; 抑制 RNA沉默; 农杆菌共浸润
Identificaion of three amino acid sites from Potato virus A HC-Pro invovlved in sup-
pression of RNA silencing　 WANG Jie1, LIU Jin-liang2, YIN Xiao1, GAO Rui3, LIU Hong-mei3,
LI Xiang-dong1, LIU Huan-ting4 　 ( 1College of Plant Protection, Shandong Agricultural University, Tai’an 271018, Chi-
na; 2College of Plant Science, Jilin University, Changchun 130062, China; 3College of Life Sciences, Shandong Agricultural
University, Tai’an 271018, China; 4Scottish Structural Proteomics Facility, University of St Andrews, North Haugh, St An-
drews, KY16 9ST, Scotland)
Abstract: The helper component-proteinase (HC-Pro) encoded by potyviruses is the first identified RNA si-
lencing suppressor. In the study, three mutants of Potato virus A (PVA) HC-Pro were obtained via site-di-
rected mutagenesis and analyzed for their activities on RNA silencing via agroinfiltration. Compared with that
of wild type HC-Pro, the treatment with deletion mutants of amino acids Phe6 and Asn11 resulted in reduced
green fluorescence, while treatment with substitution mutant of Ile250 -Gly251 -Asn252 motif to Asp250Glu251Asn252
resulted in no fluorescence. These results suggested that amino acids Phe6, Asn11 and motif Ile250 -Gly251 -Asn252
are involved in modulating the RNA silencing suppression activity of HC-Pro.
Key words: HC-Pro; site-directed mutagenesis; RNA silencing suppression; agroinfiltration
中图分类号: S432. 41; Q78　 　 　 　 　 文献标识码: A　 　 　 　 　 文章编号: 0412-0914(2012)03-0267-07
　 　 RNA 沉默是植物防御病毒侵染的一种机制,
而编码 RNA 沉默抑制因子是病毒在进化过程中
形成的一种反防御策略[1]。 马铃薯 Y病毒属病毒
编码的辅助成分-蛋白酶 ( helper component-pro-
teinase,HC-Pro)是第一个被鉴定的 RNA沉默抑制
因子[2]。 HC-Pro 可能通过抑制 siRNA 的产生,结
合并阻碍 siRNA整合入 RISC,与 AGO1 作用干扰
RISC剪切同源 mRNA,或者是影响 DNA的甲基化
等抑制 RNA沉默[3 ~ 6]。 HC-Pro 也可能通过调节依
赖于钙调素的调节系统抑制植物的 RNA沉默[7]。
HC-Pro抑制 RNA 沉默的能力和病毒的致病
力、协生能力相关[8, 9]。 分析 HC-Pro 参与抑制
RNA沉默的氨基酸,有助于深入了解病毒的致病
机理。 目前,用来鉴定 RNA 沉默抑制因子并分析
　
植物病理学报 42 卷
其功能、作用机制的方法主要有转基因植株杂交和
嫁接实验、沉默逆转实验及农杆菌共浸润实验
等[10 ~ 15]。
马铃薯A病毒(Potato virus A,PVA)HC-Pro的
第 6位氨基酸为苯丙氨酸(Phe6),这在大多数马铃
薯 Y病毒属病毒的 HC-Pro 中都是保守的;第 11 位
的天冬酰胺(Asn11)是推定的糖基化位点;250-252
位的异亮氨酸-甘氨酸-天冬酰胺(Ile-Gly-Asn,IGN)
属于 RNA结合区域 B(RNA binding domain B),在
病毒基因组复制及长距离运输中起作用[16, 17]。 为
了明确 HC-Pro结构对抑制 RNA沉默功能的影响,
本文针对上述 3 个位点设计引物,通过定点突变技
术获得了突变体,并利用农杆菌共浸润法分析突变
对 HC-Pro抑制 RNA沉默活性的影响。
1　 材料与方法
1. 1　 材料
农杆菌菌株 C58C1(含 pGV2260 质粒)、含有
gfp基因的质粒 pAGFP、转录后形成发夹结构的质
粒 pAhpGFP、阴性对照 pAGUS、含 PVA HC-Pro基
因的质粒 pAHC 均由芬兰赫尔辛基大学的
Valkonen教授惠赠[18, 19]。 QuikChange © XL Site-
Directed Mutagenesis Kit购自 Stratagene公司,突变
引物由上海博尚公司合成,探针合成试剂盒购自
Promega公司,GFP抗血清由本实验室制备。
1. 2　 方法
1. 2. 1 　 突变位点选择与突变引物设计 　 选择
PVA HC-Pro的 Phe6、Asn11和 I250G251N 进行突变。
突变引物名称及序列见表 1。 利用设计的引物,通
过 PCR可以把 Phe6 和 Asn11缺失、Ile250和 Gly251分
别替换为天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)。
1. 2. 2　 质粒 DNA的定点 PCR突变　 参考突变试
剂盒说明,以 pAHC 质粒为模板进行 PCR 扩增。
反应体系为 10 × PCR Buffer 2. 5 μL,dNTP (10
mmol / L each) 0. 5 μL,突变引物(50 ng / μL)各
1． 25 μL,5 ng 模板 DNA,Quick Solution 1. 5 μL,
Pfu Turbo DNA 聚合酶 0. 5 μL,加 ddH2O 至 25. 0
μL。 以试剂盒提供的 4. 5 kb质粒为对照。 反应程
序为 95℃ 3 min;95℃ 50 s,58℃ 50 s,68℃ 18
min,22 个循环;72℃延伸 10 min。 PCR结束后,在
每一个反应体系中加入 0. 5 μL DpnⅠ,充分混匀
后,于 37℃酶切 1 h。
1. 2. 3　 突变产物的转化和突变质粒的测序　 每个
反应取感受态细胞 XL10-Gold 30 μL 放置冰上融
化;加 2 μL β-巯基乙醇,冰上静置 10 min,每隔 2
min轻轻搅拌一次;加 6 μL DpnⅠ处理的 PCR 产
物,轻轻搅拌使之混匀,放置冰上 30 min;42 ℃水
浴热激 45 s,迅速放置冰上;2 min 后加入 800 μL
不含抗生素的 LB 液体培养基,37℃ 225 ~ 250 r /
min培养 1 h;菌液涂在含有 250 mg / L硫酸链霉素
的 LB固体培养基上,于 37℃培养。
挑取 2 ~ 3 个单菌落,液体 LB 培养基中培养
至对数生长期,提取质粒送上海博亚公司测序,验
证是否引入了预期突变。
1. 2. 4　 农杆菌共浸润分析　 采用冻融法将 pAG-
FP、pAhpGFP、pAGUS、pAHC及 3 个突变体(pAH-
Cmut)分别转化到农杆菌 C58C1 中。 挑取在 LB 平
板上长出的单菌落,接种于 5 mL 含有 100 mg / L
壮观霉素、100 mg / L 羧苄霉素和 100 mg / L 利福
霉素的 LB培养基培养 24 h。 取 50 μL 培养的菌
液加至 5 mL含 10 mmol / L 2-(N-吗啉) -乙基磺酸
(MES)和 20 μmol / L 乙酰丁香酮(AS)及上述 3
种抗生素的 LB培养基中,28 ℃振荡培养过夜。 离
心收集菌体并重新悬浮于农杆菌菌体重悬溶液
(10 mmol / L MgCl2,10 mmol / L MES,0. 1 mmol / L
AS)中,调整浓度使其 OD600 =0. 6,28℃ 静置 3 h。
Table 1　 Mutagenic primers used to generate the three mutants
Primer name Sequence
F6Del-F 5′-CAACAGGGGATGTTTGGCGAGGATTCAATCG-3′
F6Del-R 5′-CGATTGAATCCTCGCCAAACATCCCCTGTTG-3′
N11Del-F 5′-CTGGCGAGGATTCCGAACCTTTTTAGAG-3′
N11Del-R 5′-CTCTAAAAAGGTTCGGAATCCTCGCCAG-3′
I250DG251E-F 5′-CAGAAAACTTGCCGACGAGAATCTCATAGTTAC-3′
I250DG251E-R 5′-GTAACTATGAGATTCTCGTCGGCAAGTTTTCTG-3′
862
　
　 3 期 　 　 王 洁,等: HC-Pro 3 个参与抑制 RNA沉默氨基酸位点的鉴定
参考 Voinnet 等[15]的方法,选取 5 到 6 周龄 4 ~ 5
片真叶的本氏烟(Nicotiana benthamiana)植株进行
农杆菌共浸润试验。
本研究设如下处理:①含 pAGFP 的农杆菌
(OD600为 0. 6)单独浸润;②含 pAGFP和 pAhpGFP
的农杆菌(OD600均为 0. 6,等体积混合,下同)共浸
润;③含 pAGFP、pAhpGFP 和 pAGUS 的农杆菌共
浸润作为阴性对照;④含 pAGFP、 pAhpGFP 和
pAHC的农杆菌共浸润作为阳性对照;⑤含 pAG-
FP、pAhpGFP和 pAHCmut的农杆菌共浸润。 每个
处理均将浸润后的植株放置 23℃光照培养箱中培
养(16 h光照 / 8 h黑暗)。 每个处理浸润 5 株本氏
烟,每株 3 片叶。 浸润后 48 h 开始观察结果,用
Model SB-100 P / F 手提式紫外灯照射本氏烟叶
片,观察绿色荧光产生情况。 试验重复 2 次。
1. 2. 5 　 Western blotting 检测 GFP 的表达量 　 注
射后第 4 d 和第 6 d 分别从每个处理的 5 株植株上
各选取一注射叶片,参考 Wang 等[20]的方法进行
Western blotting检测。 将 0. 3 g 叶片液氮研磨后
加入 0. 2 mL的蛋白提取液(40 mmol / L Tris-HCl,
pH 6. 8,5% SDS,8 mol / L 脲, 0. 1 mmol / L ED-
TA,10 mmol / L β-巯基乙醇,5 mmol / L PMSF),离
心后上清中加入等体积的 2 ×上样缓冲液,经 12%
的 SDS-PAGE分离后,用转印电泳槽转移蛋白至
硝酸纤维素膜上,在含 0. 5%脱脂牛奶的 TBS缓冲
液( 20 mmol / L Tris-HCl, pH 7. 5, 150 mmol / L
NaCl)中封闭 1 h,TBST(TBS + 0. 05% Tween-20)
缓冲液洗膜后,在含有 GFP兔来源抗血清(1∶ 500)
的 TBST中孵育 1 h,洗膜,加入碱性磷酸酯酶标记
的羊抗兔 IgG(1∶ 2 500)TBST 缓冲液中继续孵育
1 h,洗膜后用显色底物 BCIP / NBT显色。
1. 2. 6　 Northern blotting 检测 GFP mRNA 及 siR-
NA的积累量分析　 注射后第 6 d 采集注射区域叶
片,按照 Invitrogen公司 TRIzol 试剂盒说明书进行
植物总 RNA 的提取,总 RNA 溶解后加入等体积
的 4 mol / L LiCl4 分离大分子量和小分子量 RNA,
- 20℃沉淀过夜,离心后沉淀为大分子量 RNA
(high-molecular-weight, HMW),上清液加等体积
异丙醇,沉淀为低分子量 RNA ( low-molecular-
weight, LMW)。 利用常规的甲醛凝胶电泳及测定
RNA的 OD260,检测 RNA的质量和浓度。
参考 Streit 等[21]的方法,利用 Northern blot-
ting检测 GFP mRNA 的积累量。 取 10 ~ 20 μg
HMW RNA 经甲醛凝胶电泳分离,利用 20 × SSC
将 HMW RNA 转移到带正电荷的尼龙膜上(Hy-
bond N + , Amersham / Pharmacia),经过紫外交联,
80℃烤膜 30 min 后,4℃保存备用。 利用 Promega
公司 Prime-a-GeneTM labeling System 方法合成
〔a-32P〕dCTP-标记的 GFP 约 800 bp 的 DNA 片段
作为探针,42℃预杂交,将探针加入新鲜及预热杂
交液,杂交 10 ~ 12 h,经洗膜液 I(2 × SSC,0. 2%
SDS 20 min)和洗膜液 II(0. 2 × SSC,0. 2% SDS 20
mL,10 min ×2)漂洗后,将膜置于铺上保鲜膜的磷
屏上,压紧,室温显色 48 h,扫描磷屏。
参照 Pall等[22]的方法进行 siRNA电泳及转移
后膜的处理,10 ~ 20 μg LMW RNA中加入适量的
6 ×上样缓冲液,100℃变性 5 ~ 10 min,15%聚丙烯
酰胺变性凝胶电泳分离,EB染色观察后,利用转印
电泳槽转移 RNA 至不带电荷的尼龙膜上 (Hy-
bond-NX, Amersham / Pharmacia)。 EDC 60℃交
联 1 h,于 -20℃保存备用。 除了杂交温度是 37℃
外,其他杂交过程与 mRNA相同。
2　 结果与分析
2. 1　 突变质粒的验证
用于突变的质粒 pAHC 浓度 100 ~ 150 ng /
μL,A260 / A280均大于 1. 8。 序列测定结果表明,设
计的位点均发生了预期的突变。 这 3 个突变体分
别为 Phe6 和 Asn11缺失 ( ΔF6 和 ΔN11), Ile250和
Gly251分别替换为 Asp和 Glu( IGN突变为 DEN)。
2. 2　 农杆菌共浸润结果
浸润 48 h 后,单独浸润含 pAGFP 农杆菌(处
理①)本氏烟叶片能够观察到绿色荧光。 96 h 时,
单独浸润 pAGFP 的叶片已经观察不到明显的荧
光;用含 pAGFP 和 pAhpGFP(处理②),以及用含
pAGFP、pAhpGFP和 pAGUS(处理③)的农杆菌共
浸润的本氏烟叶片中一直观察不到绿色荧光;用含
pAGFP、pAhpGFP 和 pAHC(处理④)的农杆菌共
浸润的本氏烟叶片中绿色荧光一直很强。 经定量
PCR检测,用 pAHC 和 3 个突变体处理的叶片中
HC-Pro的表达无差异。 与野生型 HC( pAHC)相
比, pAHC-ΔN11 抑制 RNA 沉默的活性降低,
pAHC-ΔF6 的抑制活性进一步降低(图 1-A)。 共
浸润后第 6 d,pAHC抑制 RNA沉默的活性基本不
变,而 pAHC-ΔF6 和 pAHC-ΔN11 抑制 RNA 沉默
的活性开始减弱(图 1-B)。 这说明 HC-Pro的 Phe6
和 Asn11对于抑制 RNA沉默不是必需的,但这 2 个
氨基酸的缺失可以降低其抑制活性。 用含 pAHC-
DEN农杆菌共浸润的叶片与阴性对照叶片相似,
962
　
植物病理学报 42 卷
Fig. 1　 Activities of PVA HC-Pro and three mutants on RNA silencing suppression
A: 4 days after infiltration; B: 6 days after infiltration.
072
　
　 3 期 　 　 王 洁,等: HC-Pro 3 个参与抑制 RNA沉默氨基酸位点的鉴定
一直没有观察到荧光,说明 IGN 位点的突变使
HC-Pro抑制 RNA沉默的活性完全丧失。
2. 3　 Western blotting分析结果
为了确定注射叶片中 GFP 的表达情况,利用
Western blotting分析了注射后 4 d 和 6 d 的 GFP
表达情况。 结果显示,共浸润后第 4 d 用含 pA-
GUS或者 pAHC-DEN 农杆菌共浸润的本氏烟叶
片中检测不到 GFP,而用含 pAHC 农杆菌共浸润
的本氏烟叶片中 GFP 表达量很高,用含 pAHC-
ΔN11 和 pAHC-ΔF6 农杆菌共浸润的本氏烟叶片
中 GFP的表达量分别是 pAHC的 65%和 47% (图
2-A、B)。 在共浸润后第 6 d,用 pAHC共浸润的叶
片中 GFP的含量稍有下降(野生型的 97% ),用含
pAHC-ΔN11 和 pAHC-ΔF6 共浸润的本氏烟叶片
中 GFP的表达量下降到野生型的 52%和 45% (图
2-A、B)。 这与上面试验中观察到的绿色荧光的强
度变化情况一致。
2. 4　 GFP mRNA及 siRNA的积累量分析
注射后第 6 d 取注射叶片区域提取植物总
RNA,利用 Northern blotting 分别检测 GFP mRNA
和 siRNA的积累量。 结果显示:用 pAHC 共浸润
的本氏烟叶片中检测到了大量的 GFP mRNA;在
用 pAHC-ΔF6 或 pAHC-ΔN11 共浸润的本氏烟叶
片中能检测到少量的 GFP mRNA;用 pAGUS 和
pAHC-DEN共浸润的本氏烟叶片和阴性对照均没
有检测到 GFP mRNA(图 3-A)。 在共浸润的本氏
烟叶片中均能检测到 GFP siRNA 的积累,但是积
累量有所不同,用 pAHC 共浸润的本氏烟叶片中
GFP siRNA 积累量最少,用含 pAHC-ΔN11 和
pAHC-ΔF6 农杆菌共浸润的本氏烟叶片中 GFP
siRNA积累量相对较多,而用含 pAGUS 和 pAHC-
DEN农杆菌浸润的本氏烟叶片中 GFP siRNA 量
最多(图 3-B)。
3　 结论与讨论
HC-Pro N末端主要与病毒的蚜传有关,C 末
端具有蛋白酶活性,并影响病毒的移动,中间区域
与病毒移动、基因组扩增和抑制 RNA 沉默有
关[8, 11, 23, 24]。 大多数马铃薯 Y 病毒属病毒 HC-
Pro的 N末端都有一个 Phe,该氨基酸在抑制 RNA
沉默过程中的作用还未得到研究。Asn11是推定的
Fig. 2　 Western blotting analysis of GFP expressed in co-infiltrated tissues 4 and 6 days
after infiltration (A) and gray values were calculated by Gel-Pro analyzer software (B)
172
　
植物病理学报 42 卷
Fig. 3　 Accumulation of GFP mRNA (A) and siRNA (B) in Nicotiana
benthamiana leaves 6 days after agroinfiltration
糖基化位点,其缺失可能影响 HC-Pro 与糖基的结
合。 本研究通过农杆菌共浸润的方法证明 PVA
HC-Pro N末端 Phe6和 Asn11缺失 HC-Pro仍有抑制
RNA沉默活性,这表明 Asn11的糖基化修饰和 Phe6
对于 HC-Pro抑制 RNA 沉默不是必需的。 Varrel-
mann等[11]发现李痘病毒(Plum pox virus,PPV)
HC-Pro 第 9 位氨基酸后插入五肽导致其抑制
RNA沉默活性的丧失。 本试验中 N 末端的 Phe6
和 Asn11的缺失使 HC-Pro 抑制 RNA 沉默活性分
别下降了 53%和 35% ,说明 HC-Pro N末端也参与
抑制 RNA沉默的调控。 本研究的结果还表明,影
响病毒基因组扩增的 IGN 突变为 DEN 后, HC-
Pro抑制 RNA 沉默活性的完全丧失,说明 HC-Pro
抑制 RNA沉默和基因组扩增的功能是部分重叠
的。
结合双链 RNA (dsRNA)或 siRNA 是 HC-Pro
等抑制因子抑制 RNA 沉默的共同策略[4, 5]。 HC-
Pro能够结合并捕获双链 siRNA,通过阻止 RNA
沉默复合体的形成来抑制 RNA 沉默,因此,HC-
Pro抑制 RNA沉默的能力与其结合 siRNA的能力
相关[3, 4]。 本研究中,用含 pAHC农杆菌共浸润的
本氏烟叶片中绿色荧光强,GFP mRNA 表达水平
高,但 GFP siRNA 积累量最低;用含 pAHC-ΔN11
及 pAHC-ΔF6 农杆菌共浸润的本氏烟叶片中绿色
荧光强度和 GFP mRNA 积累量较野生型 HC-Pro
低,但明显高于 pAGUS 和 pAHC-DEN 处理,相应
地,siRNA 的积累量高于野生型 HC-Pro 处理,低
于 pAGUS 和 pAHC-DEN 处理,这可能与 HC-Pro
结合 siRNA能力下降有关。
目前,HC-Pro抑制 RNA沉默活性的强弱与病
毒致病力间的关系还不清楚。 虽然增强 HC-Pro
抑制 RNA沉默活性的突变并不总是提高病毒的
致病力,但降低 HC-Pro 抑制 RNA 沉默活性的突
变往往引起病毒致病力的下降[9, 10]。 本研究结果
增强了人们对 HC-Pro 功能的了解,有助于病毒致
病机理研究和弱毒突变体的获得。
参考文献
[1] 　 Kasschau K D, Carrington J C. A counterdefensive
strategy of plant viruses: suppression of posttranscrip-
tional gene silencing [J] . Cell, 1998, 95(4): 461 -
470.
[2] 　 Anandalakshmi R, Pruss G J, Ge X, et al. A viral
suppressor of gene silencing in plants [J] . Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1998, 95(22): 13079 -13084.
[3] 　 Shiboleth Y M, Haronsky E, Leibman D, et al. The
conserved FRNK box in HC-Pro, a plant viral suppres-
sor of gene silencing, is required for small RNA bind-
ing and mediates symptom development [ J ] . J.
Virol. , 2007, 81(23): 13135 -13148.
[4] 　 Lakatos L, Csorba T, Pantaleo V, et al. Small RNA
binding is a common strategy to suppress RNA silen-
cing by several viral suppressors [ J ] . EMBO J. ,
2006, 25(12): 2768 -2780.
[5] 　 Merai Z, Kerenyi Z, Kertesz S, et al.
272
　
　 3 期 　 　 王 洁,等: HC-Pro 3 个参与抑制 RNA沉默氨基酸位点的鉴定
Double-stranded RNA binding may be a general plant
RNA viral strategy to suppress RNA silencing [J] . J.
Virol. , 2006, 80(12): 5747 -5756.
[6] 　 Zhang X, Du P, Lu L, et al. Contrasting effects of
HC-Pro and 2b viral suppressors from Sugarcane mo-
saic virus and Tomato aspermy cucumovirus on the
accumulation of siRNAs [ J] . Virology, 2008, 374
(2): 351 -360.
[7] 　 Anandalakshmi R, Marathe R, Ge X, et al. A calm-
odulin-related protein that suppresses posttranscriptional
gene silencing in plants [ J ] . Science, 2000, 290
(5489): 142 -144.
[8] 　 González-Jara P, Atencio F A, Martínez-García B,
et al. A Single amino acid mutation in the plum pox
virus helper component-proteinase gene abolishes both
synergistic and RNA silencing suppression activities
[J] . Phytopathology, 2005, 95(8): 894 -901.
[9] 　 Yambao M L, Yagihashi H, Sekiguchi H, et al. Point
mutations in helper component protease of clover
yellow vein virus are associated with the attenuation of
RNA-silencing suppression activity and symptom ex-
pression in broad bean [J] . Arch. Virol. , 2008, 153
(1): 105 -115.
[10] Torres-Barcelo C, Martin S, Daros J A, et al. From
hypo- to hypersuppression: effect of amino acid substi-
tutions on the RNA-silencing suppressor activity of the
Tobacco etch potyvirus HC-Pro [ J] . Genetics, 2008,
180(2): 1039 -1049.
[11] Varrelmann M, Maiss E, Pilot R, et al. Use of pen-
tapeptide-insertion scanning mutagenesis for functional
mapping of the plum pox virus helper component pro-
teinase suppressor of gene silencing [ J] . J. Gen.
Virol. , 2007, 88: 1005 -1015.
[12] Llave C, Kasschau K D, Carrington J C. Virus-enco-
ded suppressor of posttranscriptional gene silencing tar-
gets a maintenance step in the silencing pathway [ J] .
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(24): 13401
-13406.
[13] Pruss G J, Nester E W, Vance V. Infiltration with
Agrobacterium tumefaciens induces host defense and
development-dependent responses in the infiltrated zone
[J] . Mol. Plant Microbe Interact. , 2008, 21 (12):
1528 -1538.
[14] Tenllado F, Barajas D, Vargas M, et al. Transient
expression of homologous hairpin RNA causes interfer-
ence with plant virus infection and is overcome by a vi-
rus encoded suppressor of gene silencing [ J] . Mol.
Plant Microbe Interact. , 2003, 16(2): 149 -158.
[15] Voinnet O, Rivas S, Mestre P, et al. An enhanced
transient expression system in plants based on suppres-
sion of gene silencing by the p19 protein of tomato
bushy stunt virus [J] . Plant J. , 2003, 33(5): 949 -
956.
[16] Urcuqui-Inchima S, Maia I G, Arruda P, et al. Dele-
tion mapping of the potyviral helper component-pro-
teinase reveals two regions involved in RNA binding
[J] . Virology, 2000, 268(1): 104 -111.
[17] Cronin S, Verchot J, Haldeman-Cahill R, et al. Long-
distance movement factor: a transport function of the
potyvirus helper component proteinase [ J ] . Plant
Cell, 1995, 7(5): 549 -559.
[18] Kreuze J F, Savenkov E I, Cuellar W, et al. Viral
class 1 RNase III involved in suppression of RNA si-
lencing [J] . J. Virol. , 2005, 79(11): 7227 -7238.
[19] Savenkov E I, Valkonen J P. Potyviral helper-compo-
nent proteinase expressed in transgenic plants enhances
titers of Potato leaf roll virus but does not alleviate its
phloem limitation [J] . Virology, 2001, 283(2): 285
-293.
[20] Wang J, Zhu X P, Gao R, et al. Genetic and serolo-
gical analyses of elongation factor EF-Tu of paulownia
witches’ -broom phytoplasma (16SrI-D) [ J] . Plant
Pathol. , 2010, 59(5): 972 -981.
[21] Streit S, Michalski C W, Erkan M, et al. Northern
blot analysis for detection and quantification of RNA in
pancreatic cancer cells and tissues [J] . Nat. Protoc. ,
2009, 4(1): 37 -43.
[22] Pall G S, Hamilton A J. Improved northern blot me-
thod for enhanced detection of small RNA [ J] . Nat.
Protoc. , 2008, 3(6): 1077 -1084.
[23] Kasschau K D, Carrington J C. Long-distance move-
ment and replication maintenance functions correlate
with silencing suppression activity of potyviral HC-Pro
[J] . Virology, 2001, 285(1): 71 -81.
[24] Plisson C, Drucker M, Blanc S, et al. Structural cha-
racterization of HC-Pro, a plant virus multifunctional
protein [J] . J. Biol. Chem. , 2003, 278(26): 23753
-23761.
责任编辑:于金枝
372