全 文 ：浙江大学学报牗农业与生命科学版牘　31牗6牘牶689～ 693牞2005
Journal of Zhejiang University牗Agric. & Life Sci.牘
文章编号牶1008-9209牗2005牘06-0689-05
　　收稿日期牶2005-02-00
基金项目牶浙江省科技厅项目牗G20040049牘及浙江省自然科学基金项目牗6301007牘牣
作者简介牶施曼玲牗1969—牘牞女牞福建福鼎人牞博士牞副教授牞从事植物病毒与分子生物学研究.
通讯作者牶周雪平牞男牞教授牞博士生导师牞主要从事植物病毒学研究. Tel牶0571-86971680牷E-m ail牶zzhou @z ju. edu. cn牣
芜菁花叶病毒两分离物的 CP基因及HC-Pro 基因的比较
施曼玲1牞2牞周雪平1
牗1. 浙江大学生物技术研究所牞浙江杭州 310029牷2. 杭州师范学院生命科学学院牞浙江杭州 310012牘
摘　要牶芜菁花叶病毒杭州分离物牗HZWT牘和昆明分离物牗YNQC牘在 7 种寄主上的致病性相似牣利用
IC-RT-PCR对两分离物的 CP 和 HC-P ro 基因进行 PCR扩增牞扩增产物克隆后进行序列测定牞CP 基因
序列长度均为 864 个核苷酸牞编码 288 个氨基酸牷HC-P ro 基因序列长度均为 1374 个核苷酸牞编码 458
个氨基酸牣两分离物的 CP 和 HC-Pro 基因的核苷酸同源率分别为 99. 3%和 94. 5%牞氨基酸同源率分
别为 100%和 98. 7%牣HZWT 和 YNQC 的 CP 基因与已报道的 TuMV 其他分离物的核苷酸序列同源
率为 89. 2%～ 99. 3%牞氨基酸同源率分别为 88. 5%～ 99. 7%牷HC-Pro 基因与 TuMV 其他分离物的核
苷酸序列同源率分别为 80. 6%～ 97. 0%牞氨基酸同源率分别为 95. 0%～ 99. 6%牣
关　键　词牶芜菁花叶病毒牷HC-Pro 基因牷CP 基因牷青菜牷乌塌菜
中图分类号牶S432. 41　　　文献标识码牶A
SH I M an-ling1牞2牞ZHOU Xue-ping 1(1. I nstitute o f Biotechnology牞Zhe jiang University牞Hangzhou
310029牞China牷2.Coll. of Li f e Science牞Hangz hou Teachers′College牞Hangzhou 310012牞China)
Comparisons of CP gene and HC-Pro gene of two Turni p mosaic virus isolates牣 Journal o f Zhejiang
Unive rsity牗Agric. &L ife Sci.牘牞2005牞31牗6牘牶689-693
Abstract牶The pathogenicity o f Turni p mosaic virus牗TuM V牘 iso lates HZWT collected from H angzhou
and YNQC f rom Kunming we re similar in tested seven ho sts. CP and HC-Pro genes of two iso lates w ere
then amplified by IC-RT-PCR. The PC R products w ere cloned and determined. CP genes o f the tw o
iso lates we re all composed o f 864 nucleo tides encoding a polypeptide o f 288 amino acids牷HC-Pro gene s
o f the tw o isolates w ere composed of 1374 nucleo tides encoding a polypeptide of 458 amino acids.
Nucleotide sequence identity o f CP and HC-P ro genes between HZWT and YNQC we re 99. 3% and
94. 5%牞respectiv ely牞w hile amino acid identitie s of tho se between HZWT and YNQC were 100% and
98. 7%牞respectiv ely. CP genes o f HZWT and YNQC have 89. 2%-99. 3%牗nucleo tides牘 and 88. 5%-
99. 7%牗amino acids牘 sequence identitie s with o the r repor ted TuMV isolates牞while HC-Pro genes of
tw o iso lates have 80. 6%-97. 0%牗nucleo tides牘 and 95. 0%99. 6%牗amino acids牘sequence identities w ith
o the r repor ted TuMV iso lates.
Key words牶Turnip mosaic virus牷HC-Pro gene牷CP gene牷Brassica narinosa牷Brassica chinensis
浙 江 大 学 学 报牗农业与生命科学版牘
　　芜菁花叶病毒牗Turnip mosaic v irus牞
TuMV牘为马铃薯 Y 病毒属牗Potyvirus牘的成
员牞TuMV 寄主范围很广牞由蚜虫以非持久性
方式传毒牞可侵染 43科 318种双子叶植物及部
分的单子叶植物牞其分布遍及世界各地牣TuMV
在我国绝大部分省市均有发生牞其危害严重牞尤
其是在十字花科蔬菜上牞给农业生产带来巨大
的经济损失牣
TuMV 是正单链 RNA 病毒牞易变异牣一些
研究表明 TuMV 基因组常因分离物的地理来
源及寄主的不同而表现出差异犤1 ～ 5犦牣其外壳蛋
白基因牗coat pro tein牞CP牘和 HC-Pro牗helper
component-pro teinase牘与蚜虫传毒 、寄主病症
表现 、病毒在植物细胞间的长距离移动密切相
关犤6 ～ 11犦牣为了解我国不同地理区域来源的
TuMV 基因组的变异情况牞我们对分别采自浙
江杭州和云南昆明的 T uMV 两分离物的致病
性及 CP 和 HC-Pro 基因进行了比较牣
1　材料与方法
1. 1　病毒分离物
2004年 5月牞分别在浙江杭州呈现花叶症
状的乌塌菜牗Brassica narinosa牘和云南昆明呈
现花叶的青菜牗B rassica chinensis牘上采得
TuMV 的两分离物 HZWT 和 YNQC牣
1. 2　寄主反应
采用 常 规摩 擦 接 种 方法 接 种 青 菜
牗Brassica chinensis牘、 大 白 菜 牗Brassica
pek inensis牘、牛心甘蓝牗B rassica oleracea牘、萝
卜牗Raphanus sativus牘、雪 里 蕻牗Brassica
j uncea牘、心叶烟牗Nicotiana g lutinosa牘和昆诺
藜牗Chenopodium quinoa牘等植物牣
1. 3　IC-RT-PCR扩增 CP和HC-Pro 基因
根据已发表的 TuMV 基因序列牞设计并合
成CP和HC-Pro基因的特异性引物牣CP基因
5引物为 5-GCAGATGAAACGCTTGACGCAG-
3牞3引物为 5-TACAACTTCATAACCCCTT牤
GAACGC-3牣HC-Pro基因的 5引物为 5-A T
GAGCTCGCASSDGGMGCCAACT TYTGGA
AAG-3牞3引物为 5-T TGTCGACA TGAG T
G TCCTCCCA T TCTGT TCC3牣
按文献报道犤12犦的方法进行免疫捕获反转
录 PCR牗IC-RT-PCR牘牞将 TuMV 多抗血清 100
倍稀释牞用于样品中的病毒捕捉牣捕捉的病毒粒
子和 3引物经72 ℃变性 2 min牞用 M-MLV反
转录酶牗Promega牘合成 cDN A 第一链牣取 5 μL
反转录产物为模板牞进行 PCR扩增牞扩增条件
为牶94 ℃预变性 2 min牞94 ℃变性 45 s牞50 ℃
牗CP基因牘或 53 ℃牗HC-Pro 基因牘退火 45 s牞
72 ℃延伸 1. 5 min牞共 35循环牞最后 72 ℃下延
伸 10 min牣PCR产物经 Q IA quick 胶纯化试剂
盒牗Qiagene牘纯化后牞分别连接到pGEM-T easy
牗Promega牘上牞连接产物转化 E. coli DH5α牞提取
重组质粒牞通过 PCR 扩增和酶切筛选阳性
克隆牣
1. 4　CP和HC-Pro 基因的序列测定与分析
用 ABI PRISM TM 3730 DNA 测序仪进行
基因序列测定牣测序结果用 NCBI牗National
Center for Biotechnolo gy Informat ion牘和DNA
Star软件进行分析牣
2　结果与讨论
2. 1　寄主反应
TuMV 两分离物 HZWT 和 YNQC 在 3
科牗十字花科 、茄科和藜科牘的 7种指示作物上
的寄主反应几乎相同牞致病力无差异牗表 1牘牣
表 1　病毒分离物在寄主上的反应
T ab le 1 　Sym ptom s indu ced in differen t h ost s by the tw o
TuMV isolates
寄主植物
症　　状
TuMV-HZWT TuMV-YNQC
青菜 B rassica chinensis SM SM
大白菜 B rassica pekinensi s LA LA
牛心甘蓝 B rassica o leracea LA牞Y LA牞Y
萝卜 R aphanus sa tivus SM SM
雪菜 B rassica juncea SM SM
心叶烟 Nicotiana g lut inosa LN LN
昆诺藜 Chenopodium quinoa SC SC
　　注牶LA牶隐症带毒牷LN牶局部枯斑牷SC牶系统褪绿斑牷
SM牶系统花叶牷Y牶黄化牣
690 第 3 1卷　
施曼玲牞周雪平牶芜菁花叶病毒两分离物的 CP 基因及 HC-Pro 基因的比较
2. 2　CP 和 HC-Pro 基因的 IC-RT-PCR 扩增
及序列测定
利用 IC-RT-PCR扩增两分离物的 CP 和
HC-Pro 基因牞PCR扩增产物大小分别为 0. 85
kb 和1. 5 kb牞与预期的 CP 和HC-Pro 基因大
小相吻合牣
CP 和 HC-Pro 基因克隆后测得两分离物
的CP 基因全长均为 864 个碱基牞编码 288 个
氨基酸牷HC-Pro 基因全长均为 1374个碱基牞
编码 458个氨基酸牣两分离物 CP 基因的核苷
酸同源率为 99. 3%牞氨基酸同源率为 100%牷
HC-Pro 基因的核苷酸同源率为 94. 5%牞氨基
酸同源率为 98. 7%牣从 CP 和 HC-P ro 基因的
核苷酸和氨基酸的同源性比较结果来看牞从浙
江杭州乌塌菜上获得的分离物 HZWT 与从云
南昆明青菜上获得的分离物 YNQC 具有高度
的同源性牣比较 HZWT 和 YNQC 两分离物发
现牞HC-Pro 基因核苷酸序列比 CP 基因变
异大牣
将两分离物的 CP 和 HC-Pro基因序列与
GeneBank 上登录的 TuMV 别分离物相比牞存
在一定程度的差异牣与来源于亚洲牗中国杭州 、
山东牞日本和韩国牘牞大洋洲牗新西兰牘牞美洲牗加
拿大 、美国和巴西牘牞欧洲牗捷克和西班牙牘和非
洲牗肯尼亚牘等国家分离自不同寄主的有代表性
的 TuMV 分离物作比较牞HZWT 和 YNQC 与
它们的 CP 基因核苷酸序列的同源性为
89. 2%～ 99. 3%牞编码的氨基酸序列同源性为
88. 5%～ 99. 7%牗表 2牘牷HC-Pro 基因的核苷酸
序列同源性为 80. 6%～ 97. 0%牞编码的氨基酸
序列同源性为 95. 0%～ 99. 6%牗表 3牘牣HC-P ro
基因核苷酸序列相对于 CP 基因而言更易变
异牞从两分离物与别分离物的比较分析也证明
这一点牣如 HZWT 与 NZ290牗新西兰牞大白菜牘
和 CZE1牗捷克牞甘蓝牘两分离物的 CP 基因核
苷酸同源性分别为 96. 9%和 92. 8%牞而 HC-
Pro 同源性只有 86. 3%和 82. 5%牷YNQC 与
NZ290和 CZE1的 CP基因核苷酸同源性分别
为 96. 5%和 93. 2%牞但 HC-Pro 同源性只有
86. 2%和 82. 9%牣
表 2　TuMV 不同分离物 CP 基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性比较
Table 2　Percentage nucleotide or amino acid sequence identi ties of the CP genes of HZWT and YNQC w ith other TuMV isolates
分离物 寄主 来源 HZWT YNQC
nt牤% aa牤% nt牤% aa牤% 基因库登录号
HZWT 乌塌菜 中国杭州 - - 99牣3 100 AJ831810
YNQC 青　菜 中国云南 99. 3 100 - - AB831818
HBI2 大白菜 中国杭州 97. 5 99. 0 97. 6 99. 0 AB180022
Ka1J 大白菜 日　本 98. 5 99. 3 98. 1 99. 3 AB093624
CA7 大白菜 韩　国 98. 8 99. 7 98. 6 99. 7 AF103786
NZ290 大白菜 新西兰 96. 9 97. 9 96. 5 97. 9 AB093612
GA7 芥　菜 韩　国 89. 2 88. 5 89. 9 88. 5 AF103787
B5 芥　菜 中国浙江 99. 3 99. 7 99. 1 99. 7 AJ488152
Rape 油　菜 中国杭州 98. 3 99. 0 97. 9 99. 0 AF320127
SD2 油　菜 中国山东 97. 7 98. 6 97. 3 98. 6 AF539408
PRT1 甘　蓝 葡萄牙 91. 0 96. 5 91. 1 96. 5 AF434725
CZE1 甘　蓝 捷　克 92. 8 97. 9 93. 2 97. 9 Y09144
R5 萝　卜 中国杭州 91. 4 96. 5 92. 1 96. 5 AJ307039
SD4 萝　卜 中国山东 97. 3 98. 3 97. 0 98. 3 AF539410
JPN1 萝　卜 日　本 91. 0 95. 8 91. 7 95. 8 AF434724
DEU2 萝　卜 德　国 94. 2 97. 9 94. 1 97. 9 AF434722
DEU5 莴　苣 德　国 97. 7 98. 3 97. 3 98. 3 AF188979
CZE2 辣　根 捷　克 97. 9 99. 0 97. 6 99. 0 AB188971
691　第 6期
浙 江 大 学 学 报牗农业与生命科学版牘
表 3　TuMV 不同分离物 HC-Pro基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性比较
Table 3　Percentage nucleotide or amino acid sequence identit ies of the HC-P ro genes of HZWT and
YNQC with other TuMV isolates
分离物 寄主 来源 HZWT YNQC
nt牤% aa牤% nt牤% aa牤% 基因库登录号
HZWT 乌塌菜 中国杭州 - - 94. 5 98. 7 AJ831794
YNQC 青　菜 中国云南 94. 5 98. 7 - - AB831804
Tu-3 大白菜 日　本 96. 7 99. 3 94. 8 99. 3 AB105134
2J 大白菜 日　本 95. 8 98. 9 94. 5 98. 5 AB093622
NZ290 大白菜 新西兰 86. 3 98. 0 86. 2 97. 8 AB093612
C42J 油　菜 日　本 96. 4 98. 9 95. 0 98. 9 AB093625
DMJ 萝　卜 日　本 96. 1 98. 7 94. 6 98. 3 AB093623
HRD 萝　卜 中国杭州 81. 2 96. 1 80. 9 96. 1 AB093627
ITA 7 萝　卜 意大利 81. 9 95. 0 80. 6 95. 0 AB093600
CHN12 芜　菁 中　国 93. 6 98. 0 94. 3 98. 0 AY090660
CDN1 芜　菁 加拿大 84. 8 98. 0 85. 0 98. 0 AB093610
USA1 甘　蓝 美　国 92. 9 98. 9 92. 0 98. 5 AB093609
CZE1 甘　蓝 捷　克 82. 5 95. 6 82. 9 95. 6 AB093608
KEN1 甘　蓝 肯尼亚 97. 0 99. 6 95. 1 99. 1 AB093605
BZ1 甘　蓝 巴　西 84. 1 97. 4 83. 8 97. 2 AB093611
图 1　TuMV 分离物的 CP 基因的核苷酸序列进化树
Fig牣1 　Phylogenetic t ree of the nucleot ide s equence of CP
gene of T uMV isotates
　　构建了 CP和 HC-Pro 基因的系统进化树
牗图 1牞图 2牘牞根据 CP 和 HC-Pro 基因核苷酸
序列系统发育树分析结果牞TuMV 分离物几乎
可划分为两个分支牞两分支之间的 CP 核苷酸
图 2　TuMV分离物的 HC-Pro 基因的核苷酸
序列进化树
Fig牣2　Phylogenet ic t ree of th e nucleot ide sequence of HC-
Pro gene of TuMV isotates
692 第 3 1卷　
施曼玲牞周雪平牶芜菁花叶病毒两分离物的 CP 基因及 HC-Pro 基因的比较
同源率约 90%牞HC-P ro 核苷酸同源率约
82%牣HZWT 与 YNQC 同属于较大的分支牞它
们的寄主绝大多数是十字花科芸苔属植物牗CP
核苷酸同源率都 >94%牞HC-P ro 核苷酸同源
率都>84%牘牞而另一较小分支的寄主几乎为萝
卜牗CP 核苷酸同源率约 90%牞HC-P ro 核苷酸
同源率约 81%牘牞这与陈烔等人提出的 TuMV
分离物可划分为 2个分支的实验结论相似犤5犦牣
但也有例外牞来自中国山东的萝卜分离物 SD4
的 CP 序列与 HZWT 和 YNQC同源性分别高
达 97. 3%和 97. 0%牞均属于较大分支牣因此
TuMV 基因组的变异除寄主选择外还可能与
其它因子相关牣从系统关系树看牞TuMV 总体
上变异不大牣HZWT 和 YNQC 分别采自浙江
杭州和云南昆明牞两地地理距离较远牞而其
HC-Pro 基因同源性均较高牞这也反映了
TuMV 变异不大这一趋势牣
References牶
犤1犦　Tomimu ra K牞Spark J牞Kati s N牞et al牣Compari sons of
the genetic s t ru cture of populat ions of T urnip mosaic
virus in w es t and east Eu rasia犤J犦牣Virology牞2004牞330
牗2牘牶408-423牣
犤2犦　 Tan Z牞Wada Y牞C hen J牞et al牣Inter-and int ralin eage
recombinan ts are common in natural population s of
Turnip mosaic vi rus 犤J犦牣J牣Gen牣Virol牞 2004牞85牶
2683-2696牣
犤3犦　Tomimu raK牞Gibb s A J牞 Jenner C E牞 et al牣Th e
ph ylogeny of Tu rnip mosaic vi ru s牷com pari sons of 38
genomic sequ ences reveal a Eurasian origin and a recent
emergence in eas t Asia犤J犦牣Mol牣Ecol牣牞2003牞12
牗8牘牶2099-2111牣
犤4犦　 Chen J牞Chen J P牞Adams M J牣Variation betw een
Turnip mosaic virus i solates in Zhejiang Province牞
China and evidence for recombination 犤J犦牣 J牣
Phytopathol牣牞2002牞150牶42-145 牣
犤5犦　 S an chez F牞Wang X牞Jen ner C E牞et al牣St rains of
Turnip mosa ic vi rus as defined by the m olecular
analy si s of the coat protein gene of the vi rus犤J犦牣Virus
Research牞2003牞94牶33-43牣
犤6犦　C ronin S牞Verchot J牞Haldem an-cahill R牞et a l牣Long-
distance movemen t factor牶a transp ort fun ction of the
poty vi rus helper component p roteinase犤J犦牣The Plant
Cell牞1995牞7牶549-559牣
犤7犦　Kasschau K D牞Carrington J C牣Requi rement for HC-
P ro processing du ring genome ampli ficat ion of tob acco
etch potyvirus犤J犦牣Virology牞1995牞209牶268-273牣
犤8犦　Blanc S牞Ammar E D牞S andra G L牞et a l牣Mu tat ions in
the potyvi rus helper comp onent protein牶 ef fects on
interactions w ith vi rions and aphid stylets犤J犦牣J牣Gen牣
Virol牞1998牞79牶3119-3122牣
犤9犦　 Nakashima H牞Sako N牞H ori K牣Nucleot ide sequen ces
of the helper component-proteinase gen es of aphid
t ran smis sible and nont ran smissible isolates of tu rnip
mosaic virus犤J犦牣Archives of Virology牞1993牞131牶17-
27牣
犤10犦　Pirone T P牞 Blanc S牣 Helper-dependent vector
t ran smis sion of plan t vi ruses犤J犦牣Annual Review of
Phytopathology牞1996牞34牶227-247牣
犤11犦　 Rojas M R牞Zerbini F M牞Alli son R F牞et a l牣Cap sid
protein and helper component-proteinas e fu nct ion as
poty vi rus cell-to-cell movement p roteins犤J犦牣Virology牞
1997牞237牶283-295牣
犤12犦　 JIANG Jun-xi牞CHEN Zheng-xian牞LI Gui-xin牞et a l
牗蒋军喜牞陈正贤牞李桂新牞等牘牣 Identif icat ion of
path ogen of maize dw arf mosaic disease in 12 p rovin ces
in C hina and pathogenicity assay 犤J犦牣 Acta
Phytopathologica Sinica牗植物病理学报牘牞 2003牞 33
牗4牘牶307-312牣牗in Chinese牘
693　第 6期