全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(3): 550−555 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2008AA10Z154)和北京市自然科学基金项目(6092010)资助。
*通讯作者(Corresponding authors): 姚磊, E-mail: yaolei@baafs.net.cn; 吴才君, E-mail: wucj12@126.com
Received(收稿日期): 2013-07-16; Accepted(接受日期): 2013-12-10; Published online(网络出版日期): 2014-01-16.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20140116.1702.016.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.00550
HC-Pro 基因片段介导的高抗 TuMV
叶艳英 1,2 曾 钢 1 曹鸣庆 1 马荣才 1 吴才君 2,* 姚 磊 1,*
1 北京市农林科学院 / 农业生物技术研究中心, 北京 100097; 2 江西农业大学农学院, 江西南昌 330045
摘 要: 芜菁花叶病毒(turnip mosaic viruses, TuMV)是侵染重要经济作物的主要病毒之一, 寄主范围十分广泛, 尤其是
对十字花科作物的危害最为严重。为了获得对 TuMV持久稳定的高度抗性, 本研究以 TuMV HC-Pro基因的 453 bp保守
序列为靶标, 构建了植物表达 RNAi 载体 pBBBTu-HC-Pro, 并转化了 TuMV 的天然宿主拟南芥。对转基因拟南芥用北
京地区流行的 TuMV强致病株 BJ-C4进行了抗病接种鉴定。鉴定的 13个单拷贝转基因株系中有 4个对 TuMV的 BJ-C4
株表现出高度抗性, 抗性比对照提高约 80%以上, 且抗性可以稳定遗传。经半定量和荧光定量 PCR方法检测, 在高抗转
基因植株体内几乎检测不到病毒的累积, 抗病效果明显。该载体在利用基因工程抗 TuMV育种中具有广阔的应用前景。
关键词: 芜菁花叶病毒; HC-Pro; 基因片段; RNAi; 抗性
HC-Pro Gene Segment Mediated Hyper-Resistance to Turnip mosaic virus
YE Yan-Ying1,2, ZENG Gang1, CAO Ming-Qing1, MA Rong-Cai1, WU Cai-Jun2,*, and YAO Lei1,*
1 Beijing Ago-Biotechnology Research Center, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing 100097, China; 2 College of Agronomy,
Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China
Abstract: TuMV (turnip mosaic virus) with broadest known hosts, is one of the most major viruses in important economic crops,
especially for cruciferous plants. In order to get durable and stable high resistance to TuMV, in this study, a 453 bp segment of
TuMV HC-Pro gene was chosen as the target to construct pBBBTu-HC-Pro, and transformed into Arabidopsis thaliana, the
TuMV nature host. Transgenic plants were inoculated with TuMV strain BJ-C4, which has high pathogenicity and is mainly epi-
demic in Beijing area. In 13 investigated transgenic lines, four lines showed hyper-resistance to TuMV. The resistance was en-
hanced 80%, and inherited to progenies. Semi-quantitative RT-PCR and quantitative PCR results revealed that the accumulation of
virus was hardly to detect in highly resistant transgenic plants, indicating the resistance is prominent. The plasmid pBBBTu-
HC-Pro should have broad applicability in crop breeding of TuMV resistance engineering.
Keywords: Turnip mosaic virus; HC-Pro; Gene segment; RNAi; Resistance
芜菁花叶病毒(turnip mosaic viruses, TuMV)属马铃薯
Y病毒科(Potyviridae)马铃薯 Y病毒属(Potyvirus)。TuMV
寄主范围十分广泛, 能够侵染 43 科 156 属超过 318 种植
物[1-2]。TuMV 是危害十字花科作物最大的病毒病。感染
病毒后的作物还容易感染霜霉病和软腐病 , 造成复合侵
染, 直接影响产量和商品价值[3]。近年来, 在我国油菜主
产区病毒病发生有日益流行加重趋势。据调查发病田块发
病率一般为 20%~30%, 重的发病率在 50%以上, 造成油
菜籽产量的重大损失[4]。感病油菜不仅产量降低, 而且产
油率和种子萌芽率也明显降低, 品质下降[5-6]。我国白菜
因该病毒危害平均每年造成 5%的产量损失, 有些年份减
产 10% 以上, 病害严重的地块几乎绝收[6]。TuMV主要是
靠蚜虫以非持久性的方式传播, 据报道目前至少有 89 种
蚜虫参与 , 而采用杀虫剂不可能很快杀死全部蚜虫以阻
止病毒的传播, 不但效果不明显, 还易造成环境污染[7]。
因此寻求新的抗病方法成为一项迫切的任务。
基因工程技术的发展为植物病毒病的防治提供了一
条崭新的途径。1986 年 Abel 等[8]首次将烟草花叶病毒
(TMV)的外壳蛋白(CP)基因导入烟草, 培育出抗 TMV 的
烟草植株。在植物抗病毒基因工程中, 利用病毒的 CP 基
因最早获得成功, 也是至今应用最为广泛的一种策略。也
有许多利用病毒的其他序列进行抗病毒的研究报道 , 但
相比之下要少些。HC-Pro蛋白(helper component protease)
是 TuMV 的 10 个蛋白产物中的一员, 因最初被发现是蚜
虫传毒的辅助成分而得名; 它具有蛋白酶活性, 参与多聚
蛋白翻译后的水解加工过程[2]。病毒在植物体内的长距离
第 3期 叶艳英等: HC-Pro基因片段介导的高抗 TuMV 551


移动和维持复制也与其有关[9]。HC-Pro还是 RNA沉默的
抑制因子[10]。尽管马铃薯 Y 病毒中李痘病毒(plum pox
virus)利用 HC-Pro 基因片段抗病毒已有成功的报道[11], 但
利用 HC-Pro 基因片段抗 TuMV 的报道较少。因为病毒的
沉默抑制因子在与植物的防御系统对抗中扮演重要的角色,
我们选择 TuMV 的 HC-Pro 为靶标进行抗病毒研究。试验
以 TuMV的 HC-Pro的保守区段 453 bp为目的片段构建植
物表达RNAi载体, 并转化TuMV的天然宿主拟南芥, 以验
证利用 HC-Pro基因片段构建的载体对 TuMV的抗性。
1 材料与方法
1.1 试验材料
野生型拟南芥 Col-0购自 Arabidopsis Biological Re-
source Center。北京地区 TuMV 主要的流行强致病株系
BJ-C4 (HQ446217) [12]由中国农业科学院蔬菜花卉研究所
提供。BJ-C4的 cDNA克隆为本实验室前期构建并保存。
大 肠 杆 菌 (Escherichia coli) DH5α 菌 株 、 农 杆 菌
(Agrobacterium tumefacieus) GV3101:pMP90 由本实验室
保存。RNAi载体 pHannibal [13]由 CSIRO的 Peter Water-
house 博士惠赠。植物表达双元载体 pBBBasta 由地中海
大学的 Christophe Robaglia博士惠赠。
高保真酶 Fast pfu DNA Polymerase、Easy Taq酶和分
子量标记购自全式金公司。质粒小提试剂盒、胶回收试剂
盒、PCR 纯化试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司。
M-MLV 反转录酶、定量 PCR 试剂、限制性内切酶和
Klenow Fragment购自 TaKaRa公司。T4 DNA连接酶购自
Promega公司。TRIzol提取液购自 Invitrogen公司。引物
由上海捷瑞生物工程有限公司合成 , 由上海生工生物工
程技术服务有限公司测序。
1.2 目的基因片段的克隆
比对 GenBank 登录的 122 个 TuMV 株系序列, 根据
TuMV 不同株系间的保守性 , 选取 HC-Pro 基因的第
841~1293位核苷酸序列共 453 bp 的保守片段为靶点, 构
建RNAi载体。模板为BJ-C4的 cDNA克隆。根据 pHannibal
载体上的酶切位点设计引物 HC-Pro F和 HC-Pro R (表 1,
下画线部分为添加的酶切位点 EcoR I、Xba I和 Kpn I、
Cla I), 用高保真酶Fast pfu DNA Polymerase进行PCR扩增。
扩增程序为 94℃ 5 min; 94℃ 45 s, 52℃ 30 s, 72℃ 1 min,
35个循环; 72℃延伸 7 min。PCR产物经琼脂糖电泳纯化
后回收。

表 1 研究中所用引物序列
Table 1 Primers used in this study
引物名称
Primer name
引物序列
Sequence of primer
引物用途
Usage of the primer
HC-Pro F 5-cggaattctctagaGTTAGCAAGTTACAGGGTGAC-3 构建 RNAi载体 Construct RNAi plasmid
HC-Pro R 5-ggggtaccatcgatGACGTGATATC CAGTTGACAGT-3 构建 RNAi载体 Construct RNAi plasmid
CP F 5-AAAGCGTAACCAAGACCGACCAT-3 抗病性鉴定 Detect resistance to TuMV
CP R 5-TCCATCCAAGCCGAACAAAT-3 抗病性鉴定 Detect resistance to TuMV
SAND F 5-AAGGCAGGAAATCACCAGGTTGTC-3 内参引物 Reference gene
SAND R 5-TTAACGCATATGGAAGGGGAAGAC-3 内参引物 Reference gene

1.3 RNAi载体的构建
用 Cla I和 Xba I分别酶切 pHannibal载体和 HC-Pro
目的基因片段, 经纯化回收后 4℃连接过夜。连接产物经
热击转化大肠杆菌。挑取克隆, 提取质粒并用 Xba I 和
EcoR I 酶切验证 , 获得含反向片段的中间载体
pHannibal+HC-Pro(–)。
用 Kpn I和 EcoR I分别酶切 HC-Pro目的基因片段和
连入反向片段的 pHannibal+HC-Pro(–)中间载体。酶切产
物经纯化回收后 4℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌,
挑取克隆, 提取质粒并用 Xba I和 EcoR I双酶切验证, 获
得同时含反向和正向片段的中间载体 pHannibal+HC-Pro-
RNAi。
pHannibal 的发卡结构两端各含有 1 个 Not I 酶切位
点。把含发卡结构的中间载体 pHannibal-HC-Pro-RNAi用
Not I酶切, 再用 Klenow和 dGTP在酶切片段的黏性末端
补 2个碱基G, 产物以 1%琼脂糖凝胶电泳纯化, 回收含发
卡结构的 Not I目的片段备用。
用 Xma I 酶切植物表达双元载体 pBBBast, 再用
Klenow在黏性末端补 2个碱基 C, 产物经 1%琼脂糖凝胶
电泳, 回收载体片段, 再与含发卡结构的 RNAi 片段连
接。所得质粒用 Mlu I酶切验证, 获得植物表达 RNAi质
粒 pBBBTu-HC-Pro (图 1)。

图 1 载体 pBBBTu-HC-Pro 的 T-DNA 区段结构示意图
Fig. 1 Sketch of the T-DNA region of pBBBTu-HC-Pro vector
552 作 物 学 报 第 40卷


1.4 拟南芥的遗传转化及阳性苗的筛选
利用电击法将 pBBBTu-HC-Pro 载体转入农杆菌
GV3101:pMP90, 采用农杆菌介导的花序浸渍法侵染拟南
芥[14]。将收获的拟南芥 T0代种子播于盛有营养土的培养
托盘中, 置 22℃(昼)/18℃(夜)及光照周期为 16 h (光)/8 h
(暗)的人工气候室。待幼苗长出两片子叶后喷洒浓度为
0.1%~0.2%的商业 Basta除草剂筛选阳性苗。
经喷洒 2~3次 Basta 除草剂筛选后, 从能够继续生长
且长势良好的植株用小量快速法 [15]提取植物基因组
DNA。用引物 HC-Pro F和 HC-Pro R进行 PCR扩增检测。
反应条件为 94℃ 5 min; 94℃ 45 s, 52℃ 30 s, 72℃ 30 s,
35个循环; 72℃ 7 min。PCR产物经 1%琼脂糖凝胶电泳
检测, 扩增出目的基因片段的为转基因阳性苗。
转基因 T1代苗自交留种, 对 T2幼苗喷洒 0.1%~0.2%
Basta除草剂后统计存活率。存活/死亡比约为 3∶1, 初步
确定为单拷贝植株, 并单株自交留种。继续筛选后代至不
分离株系即为纯合株系。
1.5 转基因植株的抗病鉴定
将 T3代单拷贝纯合株系播种, 待幼苗长至 8~10片莲
座叶时期摩擦接种 TuMV 的 BJ-C4 株系。接种液按病叶
鲜重／磷酸缓冲液体积(pH 7.0)约 1 g 10 mL–1比例配制。
每个株系接种 12~16株, 每株接种 2片较大叶片。以非转
基因野生型拟南芥 Col-0作为对照接种。接种 2 min后立
即用清水冲洗叶片。在人工气候室中网罩隔离观察, 约 20 d
后进行抗病鉴定及病情指数统计。病情等级划分为 0级(完
全无症状); 1 级(1~2 片未接种叶花叶或发黄, 能抽薹); 3
级(3~4片未接种叶花叶或发黄, 能抽薹); 5级(5~6片未接
种叶花叶或发黄, 影响抽薹); 7 级(多数叶片花叶或发黄,
不能抽薹); 9级(大部分叶片枯死, 植株濒临死亡)。
1.6 半定量和相对定量检测病毒的累积
接种后约 20 d, 选取各株系未接种叶片分别提取总
RNA, 用 M-MLV反转成 cDNA。分别以 TuMV-CP的 196
bp片段为检测对象, 以拟南芥 SAND基因(AT2G28390)的
298 bp片段为内参进行半定量和荧光定量分析。SAND上
游引物跨过内含子(表 1, 一条下画线是外显子 a, 2条下画
线是外显子 b), 以避免因基因组 DNA 污染所造成的影
响。反应程序为 94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 57℃ 30 s, 72℃
30 s, 30个循环; 72℃ 7 min。PCR产物经 1.2%琼脂糖凝
胶电泳检测。荧光定量 PCR的反应以稀释 40倍的 cDNA
为模板, SYBR-green I作荧光指示剂, 反应程序采用两步
法扩增。扩增条件为 95℃ 30 s; 95℃ 5 s, 57℃ 30 s, 72℃
30 s, 40个循环。每个株系样品 3次重复, 取平均值。
2 结果与分析
2.1 RNAi载体的构建
利用引物 HC-Pro F和 HC-Pro R以 TuMV BJ-C4株系
的 cDNA克隆为模板, PCR扩增 481 bp的目的带。纯化的
PCR 产物经双酶切后按先反向后正向的顺序插入
pHannibal载体。
用 Xba I 和 EcoR I 分别双酶切 pHannibal+HC-Pro-
RNAi、连入反向片段的 pHannibal+HC-Pro(–)和 pHannibal
空载体验证。将 pHannibal+HC-Pro-RNAi 载体酶切成
5001、1723和 6 bp, 连入反向片段的 pHannibal+HC-Pro(–)
载体切成 5001 bp和 1264 bp, pHannibal空载体切成 5001 bp
和 823 bp。酶切结果显示质粒构建正确(图 2)。

图 2 双酶切验证 pHannibal+HC-Pro-RNAi 载体
Fig. 2 Results of pHannibal+HC-Pro-RNAi by double
digestion
M: 1 kb plus分子量标记; 1: pHannibal+HC-Pro-RNAi; 2: 连入反
向片段的 pHannibal+HC-Pro(–); 3: pHannibal空载体。
M: 1 kb plus marker; 1: pHannibal+HC-Pro-RNAi; 2: pHanni-
bal+HC-Pro(–); 3: pHannibal vector.

用 Not I酶切 pHannibal+HC-Pro-RNAi中间载体, 获
得含正反向片段的 RNAi发卡结构片段。将该片段插入植
物表达双元载体 pBBBast, 获得植物表达 RNAi 载体
pBBBTu-HC-Pro。
植物表达载体 pBBBTu-HC-Pro进行 Mlu I酶切检测。
pBBBast 载体本身有一个 Mlu I 酶切位点, 连接的目的
RNAi 片段的 CaMV 启动子上另有一个 Mlu I 酶切位点,
酶切后显示 2 条带的为阳性克隆。因是单酶切位点插入,
根据酶切条带大小可判断插入是与标记基因同向连接或
反向连接(图 1)。同向连接酶切条带为 542 bp和 9889 bp,
反向连接条带为 3935 bp和 6494 bp。结果显示 RNAi结
构已经连入植物表达载体, 并且为反向连接(图 3)。
2.2 转基因拟南芥的筛选和鉴定
播种转化的拟南芥 T0 代种子。幼苗经喷洒 2~3 次
Basta 除草剂后非转基因苗不能继续生长, 逐渐枯黄死亡;
转基因苗叶片保持绿色, 长势茁壮。共获得 60 株除草剂
抗性植株。提取 T1 代转基因苗的叶片基因组 DNA 进行
PCR 验证, 共有 26 株为 PCR 阳性苗。部分幼苗的 PCR
鉴定结果见图 4。阳性苗自交留种, 后代经除草剂鉴定有
约 13个株系符合 3∶1分离比, 初步认定为单拷贝插入株
系。T2代继续分株自交留种, 后代经除草剂鉴定, 获得纯
合株系。
2.3 转基因株系的抗病接种鉴定
将 T3代 13个单拷贝的纯合株系与野生型 Col-0同时
进行抗病接种鉴定。接种后 20 d左右, 对照野生型 Col-0

554 作 物 学 报 第 40卷


芥后得到了高抗TuMV的株系。鉴定的13个独立的单拷贝
转基因株系中有4个表现出高抗TuMV。在接种后的高抗
转基因植株体内几乎检测不到病毒的累积; 其他株系则
表现出对TuMV的不同程度的抗性。这应该是因不同的转
化插入位点效应所致[16]。外源基因在受体基因组中的插
入方式、转基因的甲基化状况、转基因的拷贝数等都对外
源基因的表达效率有影响。转基因植株的抗病性与转基因
的拷贝数的关系目前还存在着争议。Goodwin等[17]认为转
基因植株的抗病性与外源基因的拷贝数有关。但Nomura
等[18]研究表明植株的抗病性与转基因的拷贝数关系不大,
含单个拷贝和多个拷贝的转基因植株都有表现高度抗病
的株系。本研究只对推测的单拷贝转基因株系进行了抗病
鉴定。在获得的T1代植株中从分离比看存在多个多拷贝株
系(数据未显示); 其抗病性情况有待以后进一步确定。
现在新的抗病毒方法在不断涌现, 利用 amiRNA 策
略抗 TuMV 也已经获得成功[19]。但由于 amiRNA 技术只
是利用相对较短的 21-nt 病毒保守序列, 为了防止因病毒
的变异引起的抗性丢失 , 研究者建议可针对同一种病毒
同时共表达多个 amiRNAs[19]。当前利用病原体介导的抗
性(PDR)仍是抗 RNA 病毒最有效的策略, 且商业化的转
基因抗病毒作物也已经面向市场[20]。许多研究实验证明
病毒自身基因介导的转基因抗性取决于靶区域的同源性
高低而非整个序列[21]。Nomura等[18]把 TuMV-CP基因转
入拟南芥, 发现转基因株对 17 种 TuMV 分离物表现出广
谱抗性。转入序列与这 17种 TuMV分离物序列的同源性
至少为 86.6%, 且 CP 基因 3′端 380 个核苷酸的同源性超
过了 95.5%。我们选取的 HC-Pro基因 453 bp的保守区域
与 GenBank 已登录的全部 254 个 TuMV 的该段序列同源
性为 79%~100%, 其中同源性≥87%的占 48.8%。我们构
建的抗病毒植物表达载体 pBBBTu-HC-Pro 获得了高抗
TuMV 的结果, 因序列具有较高的同源性, 推测对多数的
TuMV株系应具有广谱性抗性, 实际效果需进一步验证。

致谢: 感谢 Peter Waterhouse 博士和 Christophe Robaglia
博士惠赠 RNAi 载体 pHannibal 和植物表达双元载体
pBBBasta。
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书讯：
《水稻无融合生殖育种论文集》
编著：陈建三
出版：中国科学技术出版社 出版时间：1992年 2月
简介：本书汇集水稻无融合生殖遗传与育种方面论文和短文 39篇，涉及无融合生殖的细胞学、遗传学、统
计学、胚胎学方面的研究成果以及生产利用效果。水稻无融合生殖是不经过雌雄性细胞杂交而产生无性生
殖胚的过程。研究材料为西非长花药野生稻和亚洲栽培稻。长野与栽培稻杂交 F3和 F2代选育出粳稻 84-15
和籼稻 30-27，正反交均能在 F2 代产生组群分离和固定杂种，选育出无需年年制种又能多次利用的杂交水
稻，揭示了植物无性生殖遗传规律，是一个植物快速固定杂种优势育种的新途径。本书可供科研人员、科
技工作者、大专院校师生及各级技术推广干部阅读。
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