全 文 :书西北植物学报!
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"
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#$
#&!(#&&
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!!
文章编号$
#""")*"!+
"
!"#$
#
"%)#&!)"
收稿日期$
!"#$)")"&
%修改稿收到日期$
!"#$)"&)#
基金项目$国家&十二五科技支撑专题"
!"#!,-."#,"$
#
作者简介$郭
!
娟!女!硕士研究生!主要从事林木遗传育种林业生物技术方面的研究(
/)0123
$
4
56
7
518#$!$$**
!
#$9:60
"
通信作者$樊军锋!研究员!主要从事林木遗传育种方面的研究(
/)0123
$
;18
7
;!<
!
#$9:60
美洲黑杨遗传差异的
!"#$
和
%!&!!"
分析
郭
!
娟#!樊军锋#"!梁
!
军!
"
#
西北农林科技大学 林学院!陕西杨陵
!#""
%
!
中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所!北京
#"""%#
#
摘
!
要$采用
=>-?
和
/=@)==>
分子标记对美洲黑杨
A)%
及与其有亲缘关系的
*
个美洲黑杨品种进行遗传差异
分析!比较两种分子标记在遗传差异性分析中的适用性!为美洲黑杨的鉴别提供准确的分子技术依据(结果表明$
"
#
#以
=>-?
标记筛选出
!#
对引物组合!共扩增出
!<&
条谱带!多态性条带
!"%
条!多态性比率
&!9!遗传相似
系数为
"9+*<#
"
"9&%!
("
!
#以
/=@)==>
标记筛选出
#&
对引物!共扩增出
<
条谱带!多态性条带
%
条!多态性
比率
<"9!B
!遗传相似系数为
"9****
"
"9&!
("
$
#对
=>-?
和
/=@)==>
以及两者混合数据形成的
$
个遗传相
似矩阵进行相关性分析结果显示!
=>-?
和
/=@)==>
分别同综合数据之间呈显著相关"
!C""<**!
!
C"9<$"<
#(
"
*
#聚类分析发现!两种分子标记的聚类结果有一定差异!
=>-?
聚类结果同综合数据分析的结果一致!说明
=>-?
标记更适用于杨树亲缘关系较近材料的遗传差异分析(
关键词$美洲黑杨%
=>-?
%
/=@)==>
%遗传差异
中图分类号$
D&<%
文献标志码$
-
()*)+,-.,//)0)*-)#*12
3
4,45/1&
2
3*34.)*#&-.)4
64,*
7
!"#$1*8%!&!!"910:)04
EFGH518
#
!
I-JH58;K8
4
#
"
!
LA-JEH58
!
"
#M63K
4
K6;I6NKOPN
Q
!
J6NPRSKOP-TIF82UKNO2P
Q
!
V18
4
328
4
!
=R118W2!#""
!
MR281
%
!@RK>KOK1N:RA8OP2P5PK6;I6NKOP/:636)
4Q
!
/8U2N680K8P18X?N6PK:P268
!
@RKMR28KOK-:1XK0
Q
6;I6NKOPN
Q
!
,K2
7
28
4
#"""%#
!
MR281
#
#;4+01-+
$
,6PR=>-?18X/=@)==>01NYKNOSKNK5OKXP61813
Q
O2O
4
K8KP2:X2;;KNK8:K6;+#$
%
&&()*+$,)*(
U1N2KP2KO28:35X28
4
#")*+$,)*(9:U9
)
L5W
*"
A)%
+
++
#
18X*U1N2KP2KONK31PKXP62P9
"
#
#
A8=>-?1813
Q
O2O
!
#
Z
N20KN
Z
12NOSKNKO:NKK8KX18X!<&[18XOSKNK10
Z
32;2KX
!
6;SR2:R!"%[18XOSKNK
Z
63
Q
06N
Z
R2:9@RK
Z
KN)
:K8P1
4
K6;
Z
63
Q
06N
Z
R2:[18XOS1O&!9
K8KP2:O20231N2P
Q
:6K;;2:2K8PON18
4
KX;N60"9+*<#P6"9
&%!9
"
!
#
A8/=@)==>1813
Q
O2O
!
#&
Z
N20KNOSKNKO:NKK8KX18X<[18XOSKNK10
Z
32;2KX
!
1068
4
SR2:R%
[18XOSKNK
Z
63
Q
06N
Z
R2:9@RK
Z
KN:K8P1
4
K6;
Z
63
Q
06N
Z
R2:[18XOS1O<"9!B18XPRK
4
K8KP2:O20231N2P
Q
:6K;)
;2:2K8PON18
4
KX;N60"9****P6"9&!9
"
$
#
@RK:6NNK31P2686;PRK
4
K8KP2:O20231N2P
Q
01PN2W1068
4
PRK
=>-?
!
/=@)==>18XPRK:60[281P268X1P1SKNKX2;;KNK8P
!
6;SR2:RPRK:6NNK31P268[KPSKK8=>-?18XPRK
:60[281P268X1P1
"
!C"9<**!
#!
/=@)==>18XPRK:60[281P268X1P1
"
!C"9<$"<
#
SKNKO2
4
82;2:18P3
Q
:6NNK)
31PKX9
"
*
#
M35OPKN1813
Q
O2OOR6SKXPR1PPRKNKS1OX2;;KNK8:K[KPSKK8PRK
4
K8KP2:O20231N2P
Q
1OOKOOKX[
Q
=>-?18X/=@)==>01NYKNO
!
[5PPRKNKO53PO6;=>-?18XPRK:60[281P268X1P1SKNK:68O2OPK8P
!
SR2:R
OR6SKXPR1P=>-?01NYKNOSKNK06NKK;;K:P2UK28
4
K8KP2:X2;;KNK8:K1813
Q
O2O6;:36OK#$
%
&&(328KO9
<)
3
=5084
$
#$
%
&&()*+$,)*(
%
=>-?
%
/=@)==>
%
4
K8KP2:X2;;KNK8:K
!!
遗传差异的分析与评价是杂种优势育种和杂交
育种成功的基础!和传统的基于表现型的分析方法
相比!基于
.J-
分子标记的分析技术更具优势,#-!
其直接从
.J-
分子水平检测基因组的遗传变异!
不受组织.发育时期及环境的影响!且信息量大.多
态性高,!-(近年来!多种分子标记已在杨树中广泛
应用!如
>-?.
,
$
-
.
-IL?
,
*
-
.
==>
,
+
-等!在这些标记
中!基于
?M>
的
.J-
标记在实践中具有操作简便
的优势,#-(
=>-?
又称相关序列扩增多态性"
OK)
5K8::K)NK31PKX10
Z
32;2KX
Z
63
Q
06N
Z
R2O0
#是由
L2
和
D52N6O
开发的以全基因组为靶标!检测开放阅读框
与其上游的启动子或内含子之间序列多态性的一种
新的分子标记技术,-(由于标记简便.快速.不需预
知物种的序列信息!目前已应用于植物的遗传多样
性分析.种质鉴定.遗传连锁图谱的构建和基因定位
等多方面的研究,&-(
/=@)==>
"
KW
Z
NKOOKXOK
5K8:K
P1
4
[1OKXO20
Z
3KOK
5K8:KNK
Z
K1P
#又称基于表达序
列标签微卫星!搜索
/=@
中微卫星!根据微卫星两
侧的已知序列来设计引物!扩增基因组中的外显子
片段,<-(它具有开发简单.快捷.信息量大.通用性
好等优点(目前已在植物遗传图谱构建.比较作图
和遗传多样性评价等方面广泛应用,%)#!-(
=>-?
和
/=@)==>
分子标记在杨树中的研究较少!结合
=>-?
和
/=@)==>
两种分子标记研究杨树的遗传
差异还未见报道(
美洲黑杨"
#$
%
&&()*+$,)*(
#种质资源丰富!
树干通直!是黑杨派中最具栽培利用价值的树
种,#$-(自上世纪
&"
年代引入中国以后!杨树育种
研究得到了迅速发展!但由于引进的无性系数量较
少!遗传基础较窄,#*-!杂交育种形成的品种或无性
系间亲缘关系较近!在形态上难以区分(本试验采
用
=>-?
和
/=@)==>
两种分子标记对美洲黑杨品
种进行遗传差异分析!比较两种分子标记在分析美
洲黑杨品种的遗传差异性中的适用性及其分析效
力!为美洲黑杨的鉴别提供科学.准确的分子依据(
#
!
材料和方法
>9>
!
试验材料
从西北农林科技大学渭河试验站"表
#
#采集
+
个美洲黑杨品种的
#
年生枝条进行室内水培!待其
发出嫩叶(
>?@
!
.A#
提取与检测
采用改良的
M@-,
法,#+)#&-提取美洲黑杨嫩叶
中的基因组
.J-
(
"9的琼脂糖凝胶电泳和核酸
检测仪对基因组
.J-
进行浓度和纯度的检测!将
.J-
稀释到
+"8
4
+
#
L
!
(!"]
保存备用(
>?B
!
!"#$
与
%!&!!"
分析
=>-?
引物序列参照王源秀等,-!采用其中
%
条正向引物和
<
条反向引物"表
!
#!反应体系与程
序参照谭碧癑等,#<-的方法(
/=@)==>
引物序列参
照张亚东等,#%-和宋跃朋等,!"-!反应程序参照张亚
东,#%-的方法!反应体系为
!"
#
L
!包括
!^ -.
%
_1O)
PKN_2W
"康为世纪#
"
#
L
!
#"
#
063
+
L
的正反向引物
各
#
#
L
!模板
#
#
L
"
+"8
4
#!
>J1OK)INKK 1`PKN&
#
L
(引物均由上海生工生物工程股份有限公司合
成(
?M>
扩增产物用
的非变性聚丙烯酰胺凝胶
电泳!采用银染法染色,!#-!照相分析(
>9C
!
数据分析
利用人工读带法!电泳图上可重复的.清晰的条
带记为&
#
!同一位置无带或弱带记为&
"
!建立原始
数据矩阵(利用软件
J@=V=)
Z
:!9#
计算各品种间
的遗传相似系数"
E=
#!然后采用
F?E_-
进行聚
类分析!并构建树状聚类图(利用
@I?E-
软件对
两种标记进行
_18PK3
相关性检测(
表
>
!
试验材料
@1[3K#
!
L2OP6;KW
Z
KN20K8P01PKN213O
品种
a1N2KP
Q
遗传背景
EK8KP2:[1:Y
4
N658X
来源
GN2
4
28
A)%
杨
#")*+$,)*(9:U9
)
L5W
*"
A)%
+
++
#
美洲黑杨
#")*+$,)*(
意大利
AP13
Q
陕林
$
号
#")*+$,)*(9:39
)
=L)$
*
A)%
杨"
#
#
^
美洲黑杨"
$
#
#")*+$,)*(9:U9
)
L5W
*"
A)%
+
++
#"
#
#
^#")*+$,)*(
"
$
#
陕西省林业科学研究院
=R118W2-:1XK0
Q
6;I6NKOPN
Q
创新杨
#
号
#")*+$,)*(9:39b28OR2
7
2)3
南抗
#
号"
#
#
^
帝国杨"
$
#
#")*+$,)*(9:39J18Y18
4
)#
"
#
#
^#")*+$,)*(9:U9A0
Z
KN21)#
"
$
#
中国林业科学研究院
MR28KOK-:1XK0
Q
6;I6NKOPN
Q
南抗
#
号
#")*+$,)*(9:39J18Y18
4
)#
A)%
杨"
#
#
A^)$
杨"
$
#
#")*+$,)*(9:U9
)
L5W
*"
A)%
+
++
#"
#
#
^
#")*+$,)*(9:U9
)
c1NU1NX
*"
A)$
+
+#
#"
$
#
中国林业科学研究院
MR28KOK-:1XK0
Q
6;I6NKOPN
Q
北抗
#
号
#")*+$,)*(9:39,K2Y18
4
)#
"
#)!&
+
%!
#
南抗
#
号"
#
#
^.#&+
杨"
$
#
#")*+$,)*(9:39J18Y18
4
)#
"
#
#
^#")*+$,)*(9:39#&+
"
$
#
中国林业科学研究院
MR28KOK-:1XK0
Q
6;I6NKOPN
Q
$
%
期
!!!!!!!!!!!!!
郭
!
娟!等$美洲黑杨遗传差异的
=>-?
和
/=@)==>
分析
表
@
!
鉴别美洲黑杨的
!"#$
引物
@1[3K!
!
=>-?
Z
N20KNO;6N#")*+$,)*(2XK8P2;2:1P268
正向引物
I6NS1NX
Z
N20KNO
名称
J10K
序列
=K
5K8:K
"
+d)$d
#
反向引物
>KUKNOK
Z
N20KNO
名称
J10K
序列
=K
5K8:K
"
+d)$d
#
_/# @E-E@MM---MMEE-@- /_! E-M@EME@-ME--@@@EM
_/! @E-E@MM---MMEE-EM /_$ E-M@EME@-ME--@@E-M
_/$ @E-E@MM---MMEE--@ /_* E-M@EME@-ME--@@@E-
_/* @E-E@MM---MMEE-MM /_ E-M@EME@-ME--@@EM-
_/< @E-E@MM---MMEE@EM /_& E-M@EME@-ME--@@M--
_/% @E-E@MM---MMEE@-E /_#* E-M@EME@-ME--@@M-E
_/#" @E-E@MM---MMEEM-@ G.$ MM----MM@----MM-EE-
_/## @E-E@MM---MMEE@M@ =-* @@M@@M@@MM@EE-M-M---
.M# @---M--@EEM@-M@M--E
!
!
结果与分析
@9>
!
引物筛选及扩增多态性分析
选用)
A)%
杨*与)北抗
#
号*对
&!
对
=>-?
引
物组合和
!!
对
/=@)==>
引物进行扩增能力和扩增
多态性筛选(
=>-?
引物中!条带清晰.具有多态性
的引物组合有
$!
对%
/=@)==>
引物中!条带清晰.
具有多态性的引物有
#&
对(筛选出的引物对
+
个
品种进行
?M>
扩增!
$!
对
=>-?
引物中!
#
对引物
可以把
+
个美洲黑杨品种完全区分开!
#
对引物组
合共扩增出
!<&
条谱带!多态性条带
!"%
条!多态性
比率
&!9!每个引物扩增的条带在
"
!#
条!平
均为
#$9&
条!扩增片段集中在
#""
"
#"""[
Z
(图
#
!
-
为
_/%
+
=-*
和
_/%
+
/_$
的电泳图谱(
#&
对
/=@)==>
引物!共得到
<
条谱带!多态性条带
%
条!多态性比率
<"9!B
!每对引物扩增条带在
!
"
#"
条!平均
+9#
条!扩增片段集中在
#""
"
$+"
[
Z
%图
#
!
,
为
c,)#
的电泳图谱!其中
+
对引物可以
把
+
个美洲黑杨品种完全区分开(表
$
结果表明$
=>-?
和
/=@)==>
分子标记都表现出较高的多态
性!其中
=>-?
扩增出的多态性位点远多于
/=@)
==>
!但多态性比率略低于
/=@)==>
(说明
=>-?
标记每对引物组合揭示的信息量较高(
@9@
!
遗传相似性分析
根据统计的条带建立
"
!
#
矩阵!利用
J@)
=V=
Z
:)!9#
计算出各品种间的遗传相似系数(基于
=>-?
的
+
个美洲黑杨品种之间的遗传相似系数在
"9+*<#
"
"9&%!
之间!平均相似系数为
"9+<&
!
变幅为
"9!!##
(基于
/=@)==>
的各品种间的遗传
相似系数在
"9****
"
"9&!
之间!平均相似系数
为
"9+<"<
!变幅为
"9!&!<
(
!
种分子标记结果均
表明美洲黑杨品种间的遗传差异较小(可以看出!
种标记的结果相近!但
=>-?
标记的遗传相似系数
范围较
/=@)==>
的小(
图
#
!
+
个美洲黑杨
=>-?
"
-
#和
/=@)==>
"
,
#扩增结果
_
#
9.L!"""
%
_
!
9+"[
Z
31XXKN
%
#
"
+
编号同表
#
I2
4
9#
!
-0
Z
32;2:1P268NKO53PO6;+#")*+$,)*(U1N2KP2KOS2PR=>-?
Z
N20KNO
"
-
#
18X/=@)==>
Z
N20KNO
"
,
#
_
#
9.L!"""
%
_
!
9+"[
Z
31XXKN
%
#
"
+2OPRKO10K1O@1[3K#
*
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
$$
卷
@9B
!
品种聚类分析
按照
F?E_-
法进行聚类分析!绘制品种的树
状图(基于
=>-?
聚类分析"图
!
!
-
#!当遗传相似
系数为
"9+%
时!分为两大类群!)陕林
$
号*为类群
$
!其余
*
个品种为类群
%
(当阈值为
"9%
时!类
群
%
又可以分为)
A)%
杨*.)南抗
#
号*和)创新杨
#
号*.)北抗
#
号*两大亚类(基于
/=@)==>
聚类分
析"图
!
!
,
#!当遗传相似系数为
"9++
时!分为两大
类群!)
A)%
杨*.)南抗
#
号*.)陕林
$
号*为类群
$
!
)创新杨
#
号*与)北抗
#
号*为类群
%
(基于
=>-?
和
/=@)==>
数据综合后的聚类分析!聚类结果与
=>-?
分析的结果是一致的"图
!
!
M
#(结果显示!
=>-?
和
/=@)==>
标记的聚类结果有一定的差异!
表现为)陕林
$
号*在
!
种分子标记中处于不同的类
群!但)创新杨
#
号*.)北抗
#
号*的聚类结果在
!
种
分子标记中具有一致性(说明
!
种分子标记在亲缘
关系较近的美洲黑杨品种之间的分析具有一定的可
靠性!但
=>-?
标记可能具有更高的可信度(
@?C
!
!"#$
和
%!&!!"
标记相关性分析
利用
@I?E-
软件中的
_18PK3
对
=>-?
和
/=@)
表
B
!
美洲黑杨
!"#$
和
%!&!!"
标记的多态性
@1[3K$
!
-0
Z
32;2:1P268NKO53PO6;+#")*+$,)*(U1N2KP2KO[1OKX68=>-?18X/=@)==>01NYKNO
=>-?
引物对
?N20KN
Z
12N
=>-?
扩增
总条带数
@6P13J69
6;[18XO
=>-?
多态性
条带数
J696;
Z
63
Q
06N
Z
R2:
[18XO
=>-?
多态性比率
>1PK6;
Z
63
Q
06N
Z
R2:
[18XO
+
B
/=@)==>
引物对
?N20KN
Z
12N
/=@)==>
扩增总条带
@6P13J69
6;[18XO
/=@)==>
多态性条带数
J696;
Z
63
Q
06N
Z
R2:
[18XO
/=@)==>
多态性比率
>1PK6;
Z
63
Q
06N
Z
R2:
[18XO
+
B
_/$
+
/_* * 9 c,)# & & #""9"
_/#
+
/_* % & &&9< c,)$ + + #""9"
.M#
+
G.$ #" & &"9" c,)#" * $ &+9"
_/!
+
/_* #$ % %9! c,)## #" #" #""9"
_/$
+
/_$ #* #* #""9" c,)# * * #""9"
_/$
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/_* # & *$9< /=@MF$#"#*" + <$9$
_/<
+
/_! ## & $9 /=@MF$#<$+ * $ &+9"
_/<
+
/_$ ## #" %"9% /=@MF$"%+* < < #""9"
_/<
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/_* #$ < #9+ /=@MF$"$+ $ +"9"
_/<
+
/_& #& % +!9% /=@MF$"&&+& ! ! #""9"
_/<
+
/_ #$ #" &9% /=@MF$"&&!" + ! *"9"
_/%
+
=-* #! #" <$9$
_/%
+
/_$ #$ #" &9%
_/%
+
/_& #* #! <+9&
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分析
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分别同两者的混合数据形成的遗传相似系数矩阵进
行相关性分析(结果显示!
=>-?
和
/=@)==>
标记
对美洲黑杨品种的相似性分析的结果相关性不显著
"
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标记更接近综合数
据的分析结果!因此推测
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缘关系较近的美洲黑杨品种间的遗传差异(
$
!
讨
!
论
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和
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标记遗传检测效率的评价
本试验首次利用
=>-?
和
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种分子
标记对陕西省内主栽的
+
个美洲黑杨品种进行遗传
差异检测!品种间的遗传基础较窄!但
=>-?
表现
出了较高的分析效率!每个引物组合检测到的位点
"
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#及多态性位点"
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/=@)==>
的
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倍和
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倍(本试验合成的
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条
=>-?
引
物!可以组合成
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对引物!成本优势明显!而目前公
布的杨树的
/=@)==>
引物数目相对较少且合成成
本较高(所以!
=>-?
标记在揭示不同品种间遗传
差异性的性能要优于
/=@)==>
(
B?@
!
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和
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聚类分析及其相关性
不同分子标记技术的比较已在多种作物中进行
过!如于栓仓等,!!-利用
>-?.
.
>E-
和
=>-?
分子
标记技术对
!!
个番茄品种进行了分子鉴别研究!但
目前在杨树中报道很少(基于不同分子标记的相同
材料之间遗传相似系数的相关性大小取决于这些分
子标记所揭示的基因组多态性的特征,!$-(本试验
中!
/=@)==>
的聚类结果与
=>-?
的聚类结果之间
存在一定的差异!主要表现在)陕林
$
号*处于不同
的类群(而
=>-?
的聚类结果与综合分析的聚类
结果是一致的!这与高建明,#+-的研究也是一致的(
原因可能是
!
种分子标记的扩增产物虽都分布在基
因组的转录区,!*-!但揭示的多态性不同(
/=@)==>
是通过筛选包含
==>
的
/=@
并根据微卫星序列两
端保守的侧翼序列设计引物!对基因组编码区进行
扩增!多态性主要基于微卫星重复序列数目的变化
而产生的长度多态性,%-(而
=>-?
是利用独特的
引物设计对
G>IO
进行扩增!对内含子区域.启动子
区域进行特异性扩增!因个体不同以及物种的内含
子.启动子与间隔长度不等而产生多态性,!+-(也可
能与多态性位点多少有关!
/=@)==>
聚类是根据
%
个多态性位点进行的!而
=>-?
聚类是根据
!"%
个多态性位点进行的(研究表明!品种相似性分析
的可靠性和准确性在很大程度上取决于所使用的标
记数目的多少,#+-(从聚类结果可以看出!
=>-?
标
记更可靠!也可能与
=>-?
标记与相应性状的连锁
更加紧密有关,!-(
=>-?
和
/=@)==>
数据综合后的遗传相似系
数矩阵分别与
=>-?
.
/=@)==>
的遗传相似系数矩
阵进行
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检测!相关系数分别为
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和
"9<$"<
!两两间匹配良好(又因为
=>-?
和
/=@)
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标记揭示的基因组不同的位点信息!因此将两
种标记结合起来可能会更加合理.准确地反映品种
间的遗传差异(不同的分子标记之间并不相互排
斥!也无法相互取代!不同标记间的相互补充和利
用!能更好地揭示种质之间的遗传多样性,!!-(
参考文献!
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