全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA摇 41(3): 301鄄304(2011)
收稿日期: 2010鄄05鄄25; 修回日期: 2011鄄03鄄29
基金项目: 国家科技部 863 项目(2006AA100108鄄4); “十一五冶国家科技支撑计划项目(2006BA01D01A7); 东北农业大学创新团队
(CXT002鄄1鄄2); 黑龙江省教育厅科学技术研究项目(11551058)
通讯作者: 张艳菊,副教授,主要从事植物病原生物学研究; Tel: 0451鄄55190827,Fax: 0451鄄55190447, E鄄mail: yanjuzhang@yahoo. com. cn。
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研究简报
黄瓜枯萎病菌遗传多样性的 AFLP分析
张艳菊*, 陈 霞, 刘 东, 秦智伟, 周秀艳, 蒲子婧
(东北农业大学, 哈尔滨 150030)
AFLP analysis of genetic diversity of Fusarium oxysporum f. sp. cucumainum 摇
ZHANG Yan鄄Ju, CHEN Xia, LIU Dong, QIN Zhi鄄Wei, ZHOU Xiu鄄Yan, PU Zi鄄jing摇 (Northeast Agricul鄄
tural University, Harbin 150030, China)
Abstract: The genetic diversity of Fusarium specises isolated from cucumber plants showing wilt disease
from 8 cities was detected by amplified restriction fragment polymorphism (AFLP) . Sixteen combinations of
primer pair were selected from 130 combinations and used to amplify the genomic DNA of 351 Fusarium
oxysporum isolates. A total of 116 444 bands were obtained and 60 579 of them showed polymorphism,
accounting for 52. 0% . The genetic distances of 351 F. oxysporum isolates were ranged 0. 56鄄1. 00 based on
AFLP markers, averaged at 0. 78. The results showed that the genetic diversity among the F. oxysporum
isolates was high. The 351 tested isolates could be classified into 5 AFLP groups, and most of the isolates
from the same area were clustered in the same group by using the UPGMA method.
Key words: cucumber; Fusarium oxysporum; AFLP; genetic diversity
文章编号: 0412鄄0914(2011)03鄄0301鄄04
摇 摇 黄瓜枯萎病是由半知菌亚门尖孢镰刀菌黄瓜
专化型 ( Fusarium oxysporum f. sp. cucumainum
Owen)侵染引起的一种土传病害,是影响黄瓜生产
的最主要病害之一[1]。 近年来随着分子生物学技
术的迅速发展,国内外学者对于病原真菌的遗传多
样性做了大量的研究,Wang 等[2]对影响黄瓜枯萎
病菌 AFLP技术体系的多种因素作了探讨,得到了
1 种适合于黄瓜枯萎病菌 AFLP 分析的优化体系;
Duan等[3]应用 RAPD、ISSR 和 AFLP 标记揭示出
了西瓜枯萎病菌株在分子水平上的遗传多样性。
AFLP 技术 ( amplified fragment length polymor鄄
phism)是由 Zabeau 发明,并由 Vos 发展起来的一
种分子标记技术,它结合了 RFLP 稳定性和 RAPD
技术的简便高效性,同时又能克服 RFLP 带型少、
信息量小以及 RAPD 技术不稳定的缺点[4]。 该技
术以其重复性好、效率高的特点已被广泛应用于动
物、植物研究,也成功地应用于植物病原真菌研究
中,但在黄瓜枯萎病菌的研究中报道较少。 因此,
本研究采用 AFLP 分子标记方法对从哈尔滨、长
春、沈阳、北京、保定、银川、西宁及杭州 8 个地区发
病的黄瓜植株上分离得到的尖孢镰刀菌进行分析,
旨在为更好的了解镰刀菌的遗传多样性和演化关
系,为黄瓜枯萎病菌致病性分化和抗病育种提供一
定的理论基础。
1摇 材料与方法
1. 1摇 供试菌株
2008 年,从哈尔滨、长春、沈阳、北京、保定、银
摇
植物病理学报 41 卷
川、西宁及杭州 8 个城市采集黄瓜枯萎病标本。 采
用组织分离方法分离纯化,通过形态学和 EF鄄1琢
序列测定,共获得 371 株尖孢镰刀菌。 选用黄瓜品
种津春 4 号,采用胚根接种法接种后进行致病性测
定,获得 351 株致病菌。
1. 2摇 供试菌株的 AFLP分析
1. 2. 1摇 DNA 提取摇 采用 SDS 法提取供试菌株基
因组 DNA,方法见参考文献[5]。
1. 2. 2摇 AFLP 体系与程序 摇 AFLP 反应体系和反
应条件参考 Vos 等的方法[ 6 ],并稍作改进。 引物
人工接头由上海生工合成,选择性扩增使用了 11
种 EcoRI引物和 14 种 MseI 引物共 130 个引物组
合。
1. 2. 3 酶切反应 摇 酶切体系 20 滋L,包含基因组
DNA(150 ng / 滋L)3 滋L,NEB buffer 2. 0 滋L,BSA
0. 2 滋L, MseI 3U、EcoRI 3U,加 ddH2O 补足体积
至 20 滋L,37益酶切 3 h。
1. 2. 4摇 连接反应摇 在酶切完成的每个 DNA 样品
中加入 5 滋L 混合液[MseI adapter(50 pmol / 滋L)
1. 0 滋L, EcoRI adapter(5 pmol / 滋L) 1. 0 滋L,T4
DNA Ligase(5 U / 滋L)0. 6 滋L,T4 buffer 0. 5 滋L,
10 mmol / L ATP 1. 8 滋L,ddH2O 0. 2 滋L],37益连
接 10 h。 连接完成后用 1 伊 TE(pH 8. 0)将连接产
物稀释 10 倍进行预扩增。
1. 2. 5摇 预扩增 摇 取 5 滋L 连接稀释后的 DNA 样
品,加入 15 滋L 混合液 [ 10 伊 PCR buffer (含
Mg2 + )2. 0 滋L, 2. 5 mmol / L dNTP 1. 6 滋L, M00
(50 ng / 滋L ) 0. 6 滋L, E00 (50 ng / 滋L) 0. 6 滋L,
Taq DNA polymerase (5 U / 滋L) 0. 1 滋L, ddH2 O
10. 1 滋L]混合后,按下列程序进行 PCR扩增:95益
2 min;95益 30 s,56益 30 s,72益 1 min,30 个循环;
72益 10 min,4益保存,预扩增结束后,取 5 滋L 产
物用 0. 8% 的琼脂糖凝胶电泳检测结果。 另取
5 滋L预扩增产物加入 45 滋L 1 伊 TE (pH8. 0)稀释
10 倍进行选择性扩增。
1. 2. 6摇 选择性扩增摇 取 5 滋L预扩增稀释后产物,
加入 15 滋L 混合液[10 伊 PCR buffer (含 Mg2 + )
2. 0 滋L, 2. 5 mmol / L dNTP 1. 8 滋L, Mse玉primer
(50 ng / 滋L) 0. 8 滋L, EcoR玉primer(50 ng / 滋L)
0. 8 滋L, Taq DNA polymerase (5 U / 滋L)0. 15 滋L,
ddH2O 9. 45 滋L]混合后,按下列程序进行 PCR 扩
增:95益 2 min;95益 50s,65益 (每次循环降低
0. 7益)40 s,72益 1 min,13 个循环;95益 50 s,56益
40 s,72益 1 min,31 个循环;72益 10 min,4益保
存。 扩增后的样品与 10 滋L Loading buffer 混合,
95益变性 10 min,立即转入冰浴中冷却。 扩增结束
后,利用 6%变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,80W
恒功率电泳 2 h。 采用银染方法进行染色。
1. 2. 7 摇 数据分析 摇 每个引物的扩增结果用 NT鄄
SYS(2. 1 版)软件统计分析,采用 UPGMA 法构建
分子系统树。
2摇 结果与分析
2. 1摇 351 株尖孢镰刀菌的 AFLP扩增结果
在选取的 130 对引物组合中,筛选出 16 对多
态性好、带型清晰的引物组合。 利用这 16 对引物
组合对 351 个供试尖孢镰孢菌进行 AFLP分析,均
得到清晰的电泳谱带。 不同引物组合扩增出的谱
带数存在差异,谱带最多的引物组合 E14 / M11 扩
增出 10 354 条带,最少的引物组合 E24 / M47 扩增
出 4 458 条带(表 1)。 16 对引物共扩增出 116 444
条带,每对引物平均扩增条带数 7 278 条,其中多
态性带 60 579 条,占扩增总带数的 52. 0% ,每对引
物平均扩增多态性带 3 786 条。
2. 2摇 351 株尖孢镰刀菌 AFLP聚类分析
利用 NTSYS 软件对 AFLP 数据进行分析,得
到 351 株尖孢镰孢菌间的聚类分析树状图。 菌株
间的相似系数介于 0. 56 ~ 1. 00 之间,平均为
0郾 78。 在相似系数为 0. 80 时,供试菌株被划分为
5 个类群。 其中第一类群包括 132 个菌株,全部来
自东北三省,包括来自哈尔滨的 71 个菌株、长春的
40 个菌株及沈阳的 21 个菌株;第二类群 86 个菌
株,包括来自北京的 70 个菌株和保定的 16 个菌
株;第三类群 91 个菌株,包括来自西宁的 53 个菌
株、银川的 14 个菌株和保定的 24 个菌株;第四类
群 32 个菌株,全部来自银川;第五类群包括 10 个
菌株,有来自杭州的 5 个菌株和哈尔滨的 5 个
菌株。
203
摇
摇 3 期 张艳菊,等:黄瓜枯萎病菌遗传多样性的 AFLP分析
Table 1摇 AFLP amplification of 351 Fusarium oxysporum isolates with 16 primer pairs
Code Primer combination Total band Polymorphic band Percent of polymorphic band / %
1 E12 / M11 9 650 2 554 26. 5
2 E12 / M12 7 612 3 524 46. 3
3 E12 / M16 5 676 2 980 52. 5
4 E14 / M11 10 354 7 046 68. 1
5 E14 / M12 7 429 4 143 55. 8
6 E14 / M16 4 714 2 286 48. 5
7 E15 / M13 8 143 3 143 38. 6
8 E15 / M59 6 954 2 838 40. 8
9 E15 / M65 9 285 4 572 49. 2
10 E19 / M16 8 000 3 142 39. 3
11 E19 / M11 6 183 11 726 27. 9
12 E23 / M12 8 429 4 429 52. 5
13 E23 / M23 7 909 2 300 29. 1
14 E24 / M47 4 458 1 582 35. 5
15 E24 / M11 5 321 1 869 35. 1
16 E37 / M65 6 327 2 445 38. 6
3摇 讨论与结论
由半知菌亚门尖孢镰刀菌引起的枯萎病是黄
瓜生产中非常重要的土传病害,轻则影响黄瓜产量
和品质,重则全株枯死,导致绝收。 有关黄瓜枯萎
病菌的生理小种分化现象已有明确报道,Arm鄄
strong 等[7]采用 MSU441034、MSU8519、PI390265
作为鉴别寄主,对来源于美国、以色列和日本的黄
瓜枯萎病菌株进行了生理小种分化鉴定,并将他们
分别定名为生理小种 1 号、2 号、3 号。 我国 Weng
等[8]和 Luo 等[9]对来源于哈尔滨、北京、天津、兰
州、南京和广州等地的黄瓜枯萎病菌株进行鉴别寄
主反应试验,其致病性不存在显著差异,为同一个
生理小种,但在鉴别寄主上的抗性表现与国外菌种
表现不同,均不属于已发表过的菌种,因此,将我国
供试菌株定名为生理小种 4 号。 近年来我国培育
了大量的黄瓜新品种,在同一地区黄瓜栽培品种发
生了很大变化,由于病菌与生产上应用的黄瓜品种
之间的互作,黄瓜枯萎病菌生理小种是否发生了变
化,以及不同地域的不同菌株是否存在地理型差异
均未见报道。 由于没有统一、可靠的鉴别寄主,所
以,本研究没有完成供试菌株在标准鉴别寄主上生
理分化的研究,但是在研究供试菌株致病性时发
现,351 株枯萎病菌在津春 4 号上存在明显的致病
力分化。 因此今后应在此基础上进一步筛选出对
生产上的推广品种和对重要抗源亲本有代表性的
鉴别寄主并进行致病性测定,以期明确我国黄瓜枯
萎病菌的生理小种分化。
本研究采用 AFLP 技术对来自我国 8 个城市
的 351 株尖孢镰刀菌的遗传多样性进行了研究,8
个城市 351 株尖孢镰刀菌的遗传相似性系数介于
0. 56 ~ 1. 00 之间,平均为 0. 78,从分子水平上证明
尖孢镰刀菌群体遗传多样性比较丰富。 聚类分析
结果表明,基于 AFLP分析的群体遗传多样性与地
理来源有一定的相关性,同一地区来源的菌株基本
位于相同的类群中。 本研究结果表明 AFLP 标记
选择性扩增多态性高,能够揭示大量的多态性位
点,可获得亲缘关系很近的菌株间 DNA 水平上的
多态性及亲缘关系,是研究黄瓜枯萎病菌基因组多
态性的一种较为高效的分子标记技术。 但本研究
所获得的分子标记与菌株的致病力间不存在相关
性。 因此今后应在此基础上筛选与病菌致病性分
化相关的分子标记,配合鉴别寄主来共同鉴别黄瓜
枯萎病菌生理小种。
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责任编辑:曾晓葳
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