全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
!"#$*"#*#&
&修改稿收到日期$
!"#$*"%*%#
基金项目$国家自然科学基金"
%##)#&"&
#
作者简介$陈
!
姣"
#011(
#!女!在读硕士研究生!主要从事蛋白质与酶方面的研究
2*34-5
$
6.
7
(
,
8
7
69
!
:8;34-5+683
"
通信作者$陈
!
鹏!博士!教授!主要从事蛋白质与酶方面的研究
2*34-5
$
<
9/
=
6:9/
!
/>.?4@+9A?+6/
苦荞
$%&(
重组表达及靶向
结合蛋白的初步分析
陈
!
姣!张学宾!王
!
磊!陈
!
鹏"
"西北农林科技大学 生命科学学院!陕西杨陵
)#!#""
#
摘
!
要$苦荞
#&BC
过敏蛋白"
D4E;4E
7
F?6B>:94;#&BC459E
=
9/
!
DGH#&
#是定位于种子胚中的过敏蛋白!其生物
学功能未知该研究以苦荞种子灌浆期
6CIJ
文库中获得苦荞过敏原
DGH#&
基因的序列为基础!构建
DGH#&
成熟蛋白的原核表达载体
<
2D$)F*DGH#&
!实现了其在大肠杆菌
GK!#L;4E
"
C2%
#中的高效表达结果表明$该过
敏原以包涵体的形式表达!经包涵体复性及金属离子螯合层析纯化了目标蛋白&以
#
!
$
丁二醇二缩水甘油醚环氧
基介导的蛋白偶联技术固定化
DGH#&
于
L9
<
:4E8.9MK&G
上!采用亲和层析分离与
DGH#&
靶向结合的蛋白!
NJKCO*DPQ
质谱鉴定显示!苦荞
DGH#&
过敏原靶向结合蛋白与细菌膜孔蛋白高度同源!该研究结果为分析苦荞
DGH#&
生物学功能奠定了基础
关键词$苦荞&
#&BC
过敏原&过敏蛋白&互作蛋白
中图分类号$
R)1&
文献标志码$
J
)*+",-#./.012
3
4*55#"."6$%&(78*4
9
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7./8
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9
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9
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9
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MS2IT-48
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HJIVK9-
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MS2IX9/
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M859
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7
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M:-/4
#
7-504/+0
$
D4E;4E
7
F?6B>:94;#&BC459E
=
9/
"
DGH#&
#
-.5864;9A-/.99A93FE
7
84/A-;.F-858
=
-645@?/6;-8/
-..;-5?/B/8>/+G4.9A8/;:9DGH#&.9
^
?9/698F;4-/9A@E83;:9.99A*@-5-/
=<
9E-8A6CIJ5-FE4E
7
8@;4E*
;4E
7
F?6B>:94;
!
<
E8B4E
7
8;-69]
<
E9..-8/[96;8E
<
2D$)F*DGH#&>4.68/.;E?6;9A4/ADGH#&>4..?669..*
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7
8[9E9]
<
E9..9A-/!"#$%&GK!#L;4E
"
C2%
#
-/@8E38@-/65?.-8/F8A-9.+D:9DGH#&>4.E9/4;?E9AF
7
A-45
7
.-.4
=
4-/.;
=
E4A?45
7
A96E94.-/
=
?E94.85?;-8/4/A@?E;:9E
<
?E-@-9AF
7
68F45;6:954;-/
=
6:E834;8
=
E4
<
:
7
+
DGH#&>4.;:9/68?
<
59A;8L9
<
:4E8.9MK&G46;-[4;9AF
7
#
!
$F?;
7
5
=
5
7
685;>8
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5
7
6-A
7
59;:9E
!
4/A;:9
DGH#&-/;9E46;-/
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E8;9-/>4.8F;4-/9AF
7
4@@-/-;
7
6:E834;8
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E4
<
:
7<
E8;8685.+_9.?5;8@NJKCO*DPQ
34...
<
96;E839;E
7
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=<
E8;9-/:4.:-
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::83858
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<
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E9.?5;54-A;:9F4.-.@8E@?E;:9EE9[945-/
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7
F?6B>:94;+
A*
:
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$
;4E;4E
7
F?6B>:94;
&
DGH#&
&
459E
=
-6
<
E8;9-/
&
-/;9E46;-/
=<
E8;9-/
!!
荞麦!蓼科荞麦属双子叶植物!有甜荞"
(
)
$*
+,
-./01#.%023./
#与苦荞"
(
)
$
+,
-./3(3(-&#./
#
两个种由于其富含氨基酸均衡的蛋白质及多种黄
酮类物质!因此具有较高的营养及药用价值)#*!*如
今伴随人们生活方式的巨大改变!糖尿病+心血管疾
病的发病率呈逐年上升的趋势!已成为危害人类健
康的主要慢性病害!而研究表明荞麦具有明显的降
血脂+降血糖和降胆固醇等作用)%*$*然而伴随荞麦
消费人群和区域的扩大!荞麦过敏的报道日益增多!
其引起过敏的比例远高于其他食品据不完全统计
日本儿童过敏的比例高达
"+!`
!目前日本已将荞
麦列为五大过敏源之一荞麦过敏主要表现为荨麻
疹+血管水肿+胃肠道症状和支气管痉挛哮喘等症
状+甚至产生休克而危及生命)*
#0"0
年
L3-;:
首
次报道了关于因摄取少量荞麦粉而引起的过敏反
应)&*
I834
等首次报道了荞麦过敏致死的病
例)*而这些过敏原以蛋白质为主!至今已从甜荞
中分离得到
0
+
#&
+
!!
"
!$
+
%$
"
%1
及
&0BC
等不同
分子量的过敏蛋白)1*0*!同时作为生物活性物质含量
更高的苦荞!已有
#&
+
!!
+
!$
和
&BC
等过敏蛋白得
到鉴定)#"*##*
消除或降低食品原料的过敏活性是食品过敏研
究的主攻方向之一)#!*#%*!研究主要集中在两个方面!
一是通过食品加工的途径使过敏蛋白发生变性或者
抗原表位发生改变!从而降低食品过敏活性!但有研
究显示众多的食品过敏原对食品加工的变性过程不
敏感)#$*#&*&另一种最直接和最经济的降低食品过敏
活性的方法是选育和创制低敏种质通过突变或者
基因工程技术消除或抑制过敏蛋白的表达已成为现
今选育低敏种质最主要的方法有些过敏蛋白在生
物体内以贮藏蛋白的形式存在!仅发挥储存氮素的
功能!然而有些过敏蛋白在植物体内发挥着特定的
生理功能!参与特定的生理过程!如有些过敏蛋白属
于病程相关蛋白!其参与植物自身对于病原的抗性
反应)#)*&具有过敏活性的橄榄钙结合蛋白!参与橄
榄花粉粒细胞的钙信号转导)#1*因此明确过敏蛋
白的生物学功能是通过突变或者基因工程手段进行
低敏种质创制的前提
苦荞
#&BC
过敏原"
D4E;4E
7
F?6B>:94;#&BC
459E
=
9/
!
DGH#&
#是定位于种子胚中的主要过敏蛋
白!然而
DGH#&
过敏蛋白的生物学功能尚未有研
究报道!因此为揭示
DGH#&
过敏原的生物学功能!
本研究通过构建
DGH#&
过敏原成熟蛋白的原核表
达载体!采用环氧基介导的蛋白偶联技术固定化
DGH#&
蛋白!利用亲和层析的方式分离其靶向结
合蛋白!以期为深入研究
DGH#&
过敏蛋白的生物
学功能及降低或消除苦荞的过敏活性奠定基础
#
!
材料和方法
+
!
材
!
料
原核表达载体
<
2D$)F
+
<
DE-
<
52]!*DGH#&
+大
肠杆菌菌株
GK!#L;4E
"
C2%
#和
DPX#"
均由本实验
室保存
+B
!
方
!
法
CBC
!
$%&(
过敏原原核表达载体构建
!
根据
DGH#&
成熟蛋白的编码区"
%0%F
<
!登录号
VP$0&!0$
#
序列设计并合成引物!上游引物
Q
#
"
a*VVMDMMMMV*
MVVVVJVJVJDVJJVVMDDMVJDDDJV*%a
!下划
线为
4(#
#
酶切位点#!下游引物
_
#
"
a*MVVMMVMDM*
VJVDDJMJMJDJJDJMMJVDDDMMDMDJVJVD*%a
!
下划线为
56$
$
酶切位点#以本实验室先前构建
的质粒
<
DE-
<
52]!*DGH#&
为模板进行
XM_
扩增!
扩增条件$
0b
预变性
%3-/
&
0b
变性
#.
&
$b
退火
!.
&
)!b
延伸
%".
&
%"
个循环纯化后的扩
增产物与表达载体
<
2D$)F
同时用
4(#
#
和
56$
$
进
行双酶切!回收酶切产物经
D$CIJK-
=
4.9
连接构建
表达载体
<
2D$)F*DGH#&
!对重组质粒进行双酶切鉴
定!测序验证后转化表达菌株
GK!#L;4E
"
C2%
#
CBCB
!
$%&(
过敏原的诱导表达
!
将重组质粒转
入
GK!#L;4E
"
C2%
#中!挑单克隆接种于
3K
含有
"
%
=
%
3K
卡那霉素的
KG
培养基中!
%)b
过夜培
养次日!将菌液按
#c#""
的比例转接到含卡那霉
素的
!"3KKG
培养基中至
PC
值为
"+&
"
"+1
!加
入诱导剂
OXDV
至终浓度为
#3385
%
K
!诱导
&:

同时!取
#3K
未加诱导剂
OXDV
的菌液作为对照
离心收集菌体!加入
#dLCL*XJV2
上样缓冲液悬
浮菌体!沸水浴煮

"
#"3-/
!离心后取上清进行
LCL*XJV2

CBCD
!
$%&(
过敏原的分离纯化
!
包涵体的纯
化$大量诱导过敏原蛋白表达!收集菌体后加入
#
%
#"
体积
<
S1+"
的裂解缓冲液"
"3385
%
KI4M5
!
!"
3385
%
KDE-.*SM5
#!超声破碎
!"3-/
!离心后弃上
清!加入适量
<
S1+"
的包涵体洗涤缓冲液"
"
3385
%
KI4M5
!
"3385
%
KDE-.*SM5
!
#` DE-;8/W*
#""
#重悬沉淀!超声
3-/
!重复以上步骤
%
"
$
次
洗涤后加入适当体积
<
S1+"
的包涵体溶解液"
"
3385
%
KI4M5
!
!"3385
%
KDE-.*SM5
!
1385
%
K
尿
素#!冰上溶解沉淀约
!:

钴离子螯合层析纯化过敏原蛋白$将溶解好的
包涵体于
#!"""E
%
3-/
+
$b
离心
#3-/
!上清转入
透析袋中!在含有不同浓度尿素"
&
+
$
+
%
+
!
+
#
+
"385
%
&&&
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
K#的透析液"
<
S0+"
!
"3385
%
KI4M5
!
"3385
%
K
DE-.*SM5
#中进行缓慢梯度透析
&
"
1:
将透析过
的蛋白溶液
#!"""E
%
3-/
+
$b
离心
#3-/
!上清与
等体积的
!dXGL
"
<
S)+1
!
"+#385
%
K
磷酸盐缓冲
液!含有
"+&385
%
KI4M5
#混合!缓慢上样于经
#d
XGL
平衡过的
D458/E9.-/
柱上用
&
倍柱体积的
#
dXGL
洗脱杂蛋白随后用含有
#"3385
%
K
咪唑
的
XGL
洗脱目标蛋白目标蛋白经
<
S
为
1+"
的
透析液"
"3385
%
KI4M5
!
"3385
%
KDE-.*SM5
#透
析后!
(!"b
保存
CBCE
!
苦荞种子萌发过程中
$%&(
过敏原蛋白
的
&*50*4.-8"00#.
9
分析
!
苦荞总蛋白样品经
LCL*
XJV2
分离后半干转移至
"+#
%
3
的
IM
膜上!
"
3J
电流下转移
#:
!以制备的多克隆抗体为一抗
"工作浓度
#c%""
#!辣根过氧化物酶"
S_X
#标记的
山羊抗兔
O
=
V
为二抗"
#c#"""
!北京博奥森生物技
术有限公司#进行蛋白质印迹分析!印迹信号的检测
方法参考化学发光显色试剂盒"北京康为世纪生物
科技有限公司#!并利用化学发光成像仪"
M:93-C86
W_LL
7
.;93
!
G-8*_4A
#记录结果
苦荞总蛋白样品的制备$称取定量苦荞种子!去
皮研磨并加入
<
S&+
的
"+!385
%
K
乙酸钠缓冲
液!混匀后置于
$b
保温过夜!
#""""E
%
3-/
+
$b
离
心
#3-/
!上清液即为总蛋白样液!保存于
(!"b
待用
CBCF
!
$%&(
的固定化及靶向结合蛋白纯化
!
过
敏原的固定化$用大量水清洗
L9
<
:4E8.9MK&G
!加
入适量
#385
%
KI4PS
"含
!3
=
%
3KL8A-?3F8E8*
:
7
AE-A9
#和
#
!
$*G?;4/9A-85A-
=
5
7
6-A
7
59;:9E
!室温反
应约
:
!大量水洗及
#""3385
%
KI4SMP
%
洗涤
#
次!与经超滤管除
DE-.*SM5
后的
DGH#&
过敏原蛋
白室温偶联反应约
#":
!将获得的溶液用
<
S)+
的
XGL
洗涤
#
次去除游离蛋白!加入
#3385
%
K
甘
氨酸封闭未反应基因!水洗
%
次
DGH#&
过敏原靶向结合蛋白的纯化$将苦荞
籽粒总蛋白溶液
#!"""E
%
3-/
+
$b
离心
#3-/
!上
清与等体积的
!dXGL
"
<
S&+0
!
"+#385
%
K
磷酸盐
缓冲液!含有
"+&385
%
KI4M5
#混合!缓慢上样于经
#dXGL
平衡过的偶联
DGH#&
过敏原的
L9
<
:4E8.9
MK&G
上用
&
倍柱体积
#dXGL
洗脱杂蛋白!
"+#` LCL
洗脱目标蛋白!
(!"b
保存
+B+(
!
质谱鉴定
!
对洗脱蛋白进行
LCL*XJV2
电
泳检测!考马斯亮蓝染色后切取目标条带送至北京
华大生物科技有限公司进行
NJKCO*DPQ
质谱
检测
!
!
结果与分析
BC
!
$%&(
过敏原基因的
?G)
扩增+诱导表达及
分离纯化
用合成的引物
Q
#
+
_
#
进行
XM_
扩增!产物经
#`
的琼脂糖凝胶电泳检测!结果显示特异性扩增条
带与预期大小
%0%F
<
一致"图
#
#
将表达载体
<
2D$)F*DGH#&
转化表达菌
GK!#
L;4E
"
C2%
#!诱导后经
LCL*XJV2
分析"图
!
#!在
#&
BC
附近有明显的诱导表达条带!其大小与预测的
苦荞
DGH#&
的分子量大小相符
DGH#&
过敏蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体
形式表达!纯化的包涵体经
1385
%
K
尿素溶解及透
析复性!可形成高度可溶的蛋白质溶液复性蛋白
经钴离子螯合层析柱纯化后进行
LCL*XJV2
检测!
结果显示
DGH#&
有较高纯度"图
%
#!表明钴柱
D458/E9.-/
可实现该过敏蛋白的高效纯化
图
#
!
DGH#&
基因序列的
XM_
扩增
N+CK!"""
&
#+DGH#&
的
XM_
扩增结果
Q-
=
+#
!
XM_43
<
5-@-64;-8/8@;:968A-/
=
.9
^
?9/698@DGH#&
N+CK!"""
&
#+XM_
<
E8A?6;8@DGH#&
=
9/9
图
!
!
DGH#&
过敏原诱导表达的
LCL*XJV2
分析
N+
蛋白
N4EB9E
&
#
+
%
+
+
诱导前对照菌&
!
+
$
+
&+
诱导表达菌体
Q-
=
+!
!
LCL*XJV24/45
7
.-.8@;:99]
<
E9..-8/8@DGH#&
N+XE8;9-/34EB9E
&
#
!
%
!
+Z/-/A?69A695.68/;4-/-/
=<
2D$)F*
DGH#&
&
!
!
$
!
&+O/A?69A695.68/;4-/-/
=<
2D$)F*DGH#&
)&&
$
期
!!!!!!!!!!!!
陈
!
姣!等$苦荞
DGH#&
重组表达及靶向结合蛋白的初步分析
BCB
!
苦荞种子萌发过程中
$%&(
蛋白的
&*50*4.
-8"00#.
9
分析
提取干种子及不同萌发状态共
0
阶段的苦荞种
子"图
$
!
J
#中的总蛋白!以
DGH#&
过敏原为抗原
制备的多克隆抗体为一抗!
S_X
标记的山羊抗兔
O
=
V
为二抗进行
H9.;9E/F58;;-/
=
分析"图
$
!
G
#
干种子中的
DGH#&
天然蛋白与抗体结合的信号最
强!随着种子的萌发结合信号依次减弱!当芽长过
%
63
!几乎无抗原抗体结合信号!说明
DGH#&
在干种
子及萌发初期含量较高!选取此时期种子提取总蛋
白!以检测与之相作用的目标蛋白
BCD
!
$%&(
的固定化
除去
DGH#&
过敏原蛋白溶液中
DE-.*SM5
!与
L9
<
:4E8.9MK&G
以
#
!
$
丁二醇二缩水甘油醚环氧
图
%
!
纯化蛋白的
LCL*XJV2
分析
N+
蛋白
34EB9E
&
#+
纯化的
DGH#&
蛋白
Q-
=
+%
!
LCL*XJV24/45
7
.-.8@
<
?E-@-9ADGH#&
<
E8;9-/
N+XE8;9-/34EB9E
&
#+X?E-@-9A
<
E8;9-/
图
$
!
不同萌发状态种子中
DGH#&
含量的
H9.;9E/F58;;-/
=
分析
J+
干种子及不同萌发状态的种子&
G+DGH#&
含量
H9.;9E/F58;;-/
=
分析检测
Q-
=
+$H9.;9E/F58;;-/
=
4/45
7
.-.8@DGH#&68/;9/;
-/A-@@9E9/;
=
9E3-/4;-8/.;4
=
9.8@.99A.
J+M:4E46;9E-e4;-8/8@AE
7
.99A4/AA-@@9E9/;
=
9E3-/4;-8/
.;4
=
9.8@.99A.
&
G+C9;96;-8/;:968/;9/;8@DGH#&-/AE
7
4/AA-@@9E9/;
=
9E3-/4;-8/.;4
=
9.8@.99A.F
7
H9.;9E/F58;;-/
=
基共价键偶联!亲和层析靶向结合苦荞总蛋白中未
知蛋白!用
"+#` LCL
洗脱目标蛋白后经
LCL*
XJV2
电泳检测"图

#!有
#
条分子量约为
$"BC
的条带清晰可见
B+E
!
质谱鉴定靶向结合蛋白
对图

中清晰可见的蛋白条带进行
NJKCO*
DPQ
质谱分析结果显示!该目标蛋白的
%
条肽段为
f+KR\JK\CRf+J
!
_+LDgLKJVVQV2g_+K
和
f+JSROLKV\gSIKLf+_
"图
&
#经与
IMGO/E
数
图

!
DGH#&
过敏原靶向结合蛋白的
LCL*XJV2
分析
N+
蛋白
N4EB9E
&
#
+
!+
目标蛋白
Q-
=
+
!
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的儿童和
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的成年人对特定的食
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的人受食物过敏性疾病
困扰)#0*!"*食品过敏原主要是蛋白质类物质植物
性食物过敏蛋白根据其功能可分为种子储藏蛋白+
结构蛋白和防御蛋白)!#*有些过敏蛋白在植物体
内承担着重要的生理功能!在通过分子手段降低或
消除过敏蛋白"如基因沉默#前应优先分析过敏蛋白
的生物学功能!否则可能造成转基因植株农艺性状
的严重缺陷!因此揭示过敏蛋白在生物体内的生物
学功能对于通过基因工程手段降低过敏蛋白的含量
有着基础的指导价值
对于荞麦过敏蛋白的研究!主要集中在过敏蛋
白的鉴定+分子特性和过敏表位分析等领域
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等)!!*在荧光酶联免疫分析过敏患者血清
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的基
础上推测
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蛋白可能是甜荞中的主
要过敏原国内学者对苦荞
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原具有抗胃蛋白酶消化的特性!
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验证了荞麦中
!$BC
过敏原有抗胰凝乳蛋白酶消化特性)!1*李
玉英证明
0BC
过敏原具有胰蛋白酶抑制剂活
性)!0*迄今为止对于荞麦过敏蛋白的生物学功能
分析未有文献报道
DGH#&
是定位于苦荞种胚中分子量为
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的过敏蛋白!其具有抗胃蛋白酶+耐热"沸水浴!
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过敏蛋白前体的原核表达并制备了
多克隆抗体!但包含信号肽的蛋白不能实现正确的
复性本研究建立了去除
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端
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个氨基酸残基的
信号肽"
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#的成熟蛋白
的原核表达体系!虽然目标蛋白仍以包涵体的形式
表达!但可实现包涵体蛋白的完全复性!为高效纯化
目标蛋白和研究该蛋白的生物学功能奠定了基础
寻找与过敏蛋白相互作用的蛋白是揭示过敏蛋
白生物学功能的有效途径之一本研究在实现
DGH#&
重组表达+复性和纯化的基础上!采用
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丁二醇二缩水甘油醚作为
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的活化剂偶联
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互作蛋白分离的纯化介
质
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以引入环氧基以利于
DGH#&
的共价固定化!同时
在固定化配基和支持介质之间引入
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个碳原子的
亲水性间隔臂!大大降低了支持介质对靶向蛋白结
合的空间位阻!可提高待分离蛋白结合的特异性和
高效性
本研究初步证实苦荞
DGH#&
靶向结合蛋白与
细菌膜孔蛋白高度同源细菌和真核生物的线粒体
膜孔蛋白有相对较多的研究!在细菌体内!膜孔蛋白
参与细菌对环境胁迫的响应!研究最多的是膜孔蛋
白与细菌抗生素耐药性的关系膜孔蛋白是抗生素
进入革兰阴性菌胞质间隙的非特异性蛋白通道!其
减少或缺失可能导致细菌抗生素摄入的降低!是细
菌抗生素耐药性形成的机制之一)%#*%!*与
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互作的类膜孔蛋白在苦荞中的细胞定位以及生物学
功能的进一步分析!将有助于揭示苦荞
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过
敏蛋白的生物学功能
参考文献!
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