全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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-
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收稿日期$
!"#&+#!+#!
&修改稿收到日期$
!"#$+"!+"(
基金项目$四川省教育厅青年基金"
#%12"!(&
#
作者简介$高
!
飞"
#((#)
#!男!在读硕士研究生!主要从事植物分子生物学研究
3+45.6
$
7
589:.;.868
756.
<
=0,>84
"
通信作者$姚慧鹏!博士!副教授!主要从事植物分子生物学研究
3+45.6
$
<
58?=.
@
:0
7
"(!#
!
#%,>84
苦荞锌指蛋白基因
1#203$
的克隆
及其对非生物胁迫的应答
高
!
飞!姚攀锋!雒晓鹏!李成磊!吴
!
琦!姚慧鹏"
"四川农业大学 生命科学院!四川雅安
!$"#&
#
摘
!
要$根据苦荞"
!"
#
$
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()*"*"+,()
#花期转录组数据!分别以苦荞
ABC
和
>ABC
为模板!克隆得到
#
个苦荞
D!D!
型锌指蛋白基因
!*-./#
"
E:0250F
登录号
GH!$!#%&
#的
ABC
序列和
>ABC
序列!采用实时荧光定量
HDI
方法!研究了
!*-./#
基因在非生物胁迫下的表达模式结果显示$苦荞
!*-./#
基因
ABC
全长
!&!*;
@
!由

个
外显子和
$
个内含子构成!符合
EJ+CE
剪切原则&
>ABC
序列包含一个
$!K;
@
开放阅读框!编码
#*$
个氨基酸!具
有
LMA#
家族的典型结构域&
JN+2
照射和水杨酸处理均能使
!*-./#
基因的表达量上升!且
JN+2
处理在
?
达
到最大!为
"?
"
DG
#的
%,K&
倍&水杨酸处理于
#"?
达到最大!为
"?
"
DG
#的
%,&&
倍!而
&O
冷胁迫下该基因表达量
保持稳定推测该基因可能参与苦荞抗
JN+2
和高浓度水杨酸等非生物胁迫的应答反应!为苦荞的抗逆性研究提
供新的视角
关键词$苦荞&锌指蛋白
LMA#
&基因克隆&非生物胁迫
中图分类号$
P*K$
&
P*K(
文献标志码$
C
%&"#
(
)!*+
,
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1
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(
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1#203$#1$
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56
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7
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7
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QIR,
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7
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@
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65
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_.0>9.0
7
:X
@
X8Y:.0LMA#
&
7
:0:>680.0
7
&
5;.8Y.>/YX://
!!
类
-./#
基因编码一类特殊的
D!D!
型锌指蛋
白!含有
%
个特殊的锌指结构域$
D` D`` I` L`aS`+
E`C` MN` D` D`
!又称为
_9+LMA#
结构域)#*该基
因家族克隆的首个基因是拟南芥
1*-./#
!随后在
水稻+小麦+玉米等植物中发现并克隆出更多含有
_9+LMA#
结构域的基因)!+%*功能研究表明!这类
LMA#
型锌指蛋白在细胞过敏性死亡+植物广谱抗
病性以及植物对低温+长日照等非生物环境胁迫具
有调 控 功 能)&*
A50.:
等)$*研 究 表 明!拟 南 芥
1*-./#
基因功能是通过应答水杨酸"
/56.>
<
6.>
5>.[
!
MC
#信号分子!上调铜锌超氧化物歧化酶"
D=+
10MQA
#来清除由病原菌或者其它非生物胁迫造成
的过量积累的活性氧"
X:5>Y.Z:8`
<7
:0/
@
:>.:/
!
IQM
#!减轻氧迸发引起的二次伤害
苦荞"
!"
#
$
%&
()*"*"+,()
#又称鞑靼荞麦!
属蓼科"
H86
<7
805>:5:
#荞麦属一年生草本植物主
要分布在中国西南高寒山地)*苦荞含有丰富的生
物类黄酮!对人类多种疾病具有预防治疗作用!被誉
为新型的绿色保健食品!备受青睐)*+K*苦荞抗逆能
力强!能适应高寒+高海拔+强紫外及干旱等恶劣环
境目前!关于苦荞抗逆及抗氧化的研究主要集中
于黄酮类化合物和
MQA
酶类对
IQM
的清除方面
M=_=F.
等)(*证明苦荞在受到紫外线+冷和干旱胁迫
时叶片中的芦丁含量以及芦丁葡萄糖苷酶活性显著
上升!以此来清除胁迫条件下产生的过量
IQM
董
新纯等)#"*研究发现!苦荞经
JN+2
处理后!其
MQA
总活性提高!说明苦荞在受到胁迫时!通过提高抗氧
化酶活性清除
IQM
以保护细胞!而其中的分子调控
机制尚不清楚
本实验根据获得的苦荞花期转录组数据!采用
I]+HDI
技术克 隆 苦 荞 抗 逆 相 关 的 锌 指 蛋 白
!*-./#
基因序列!并采用
JN+2
+
!4486
%
L
水杨
酸和
&O
冷胁迫处理二叶期苦荞!探究
!*-./#
基
因的表达与外界非生物胁迫的相关性!为从分子水
平探究苦荞抗逆和抗氧化的机制提供参考!也为苦
荞的抗逆性研究提供新的视角
#
!
材料和方法
$,$
!
材料及处理
苦荞",西荞二号(#种植于四川农业大学生命科
学院实验室培养箱!培养条件为光照
#?
!黑暗
K
?
!温度"
!!b!
#
O
!相对湿度
"c
!培养至二叶期
供试备用
JN+2
处理$使用
#"VJN+2
"
%"K04
#
L3A
灯
照射二叶期苦荞!光照距离
%">4
水杨酸处理$使
用
!4486
%
L
浓度水杨酸!叶面喷施二叶期苦荞!以
叶面滴水为度!以上处理均于处理前
"?
+处理后
!
+
&
+

+
K
+
#"
和
#!?
分别取供试样品叶片!液氮冷冻
后置于
)K"O
备用
&O
冷处理$将二叶期苦荞转
移至培养条件为光照
#?
!黑暗
K?
!温度
&O
!相
对湿度
"c
的光照培养箱!于处理前
"?
+处理后
#!
+
!&
+
%
+
&K
+
"
和
*!?
取供试样品叶片!液氮冷
冻后置于
)K"O
备用
$,>
!
方
!
法
$?>?$
!
1#203$@A0
序列和
4@A0
序列的克隆
!
采用改良
MAM
法)##*提取苦荞叶片总
ABC
!采用植
物
IBC
8=Y
试剂盒提取各处理样品的总
IBC
!并以
其为模板使用
HX.4:M>X.
@
YI]X:5
7
:0YG.YV.Y?
7
ABC3X5/:X
"
H:X9:>YI:56].4:
#试剂盒反转录制
备
>ABC
第一条链根据本实验室获得的苦荞花
期转录组数据!设计
#
对特异引物
RYLMA#9
"
$d+
]]D]CDDC]]]]CDEDD]DDD]DD+%d
#和
RYLMA#X
"
$d+DECDDEE]CDED]E]]ECE]C]CCD+%d
#!
分别以苦荞总
ABC
和
>ABC
第一条链为模板!
HDI
扩增
!*-./#ABC
序列和
>ABC
序列!
HDI
产物回收纯化后连接至
@
aA#(+]
载体!阳性克隆
送上海英骏生物公司测序
$,>,>
!
序列分析
!
使用
BD2U
在线工具
265/Y
进行
!*-./#
核苷酸序列及其编码的蛋白质氨基酸序列
同源性分析&使用
ABCaCB
进行多序列比对&利
用
a3EC$,"
将对比结果采用邻接法"
0:.
7
?;8X+
-
8.0.0
7
!
Be
#构建系统进化树
$?>?B
!
苦荞
1#203$
基因表达
!
设计
#
对实时定
量
HDI
特异引物
RYLMA#P9
"
$d+]E]C]DDD]]+
]EECEDCDDC]DCE+%d
#和
RYLMA#PX
"
$d+ED+
DCCDDCDCCDC]]ED]ECDD+%d
#!以苦荞组蛋
白
W%
基因)#!*为内参基因!引物为
W%P9
"
ECCC]+
]DEDCCE]CDDCECCECE
#和
W%PX
"
DDCC+
DCCEE]C]EDD]DCED
#!采用
]5F5X5
公司实时
荧光定量
HDI
试剂盒
MS2IHX:4.` 3` 2"
3
]a
"
"
H:X9:>YI:56].4:
#!在
2UQ+ICA
公司的
DRT(
I:56+].4:M
<
/Y:4
进行荧光定量!数据采用
!
)
##
4
]
方法)#%*分析!采用
U2aMHMMMY5Y./Y.>/!"
统计软
件对水杨酸+
JN+2
和冷胁迫下苦荞
!*-./#
基因
的表达进行数据分析
!
!
结果与分析
>?$
!
苦荞
1#203$
基因
@A0
序列和
4@A0
序列的
克隆
采用特异引物
RYLMA#9
和
RYLMA#X
!以苦荞
ABC
为模板!
HDI
扩增得到
&""";
@
左右条带!测
序结果表明该片段长
&"K";
@
"图
#
!
C
#用该特异
引物!以苦荞
>ABC
为模板!
HDI
扩增得到
("";
@
左右条带"图
#
!
2
#!测序结果表明该片段长
K**;
@

"*
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
>,>
!
核苷酸序列分析
通过
265/Y
比对苦荞
!*-./#ABC
和
>ABC
序列!确定其全长
ABC
序列为
!&!*;
@
!由

个外
显子!
$
个内含子构成"图
!
#!符合标准的
EJ+CE
剪切原则此外!位于
C]E
上游
$d+J]I
的
)!
;
@
和
)##(&;
@
之间!存在
#
个长度为
#%(#;
@
插
入片段!同时符合
EJ+CE
剪切原则!属于特殊的内
含子结构!是比较少见的基因类型)#&*
HX:[.>Y.80
在线软件分析结果表明!在距离起始密码子
)##&"
;
@
至
)##(";
@
存在
#
个可能的启动子基础序列
苦荞
!*-./#>ABC
序列包含一个
$!K;
@
开放阅
读框"
QIR
#
265/Y
序列比对显示!该
>ABC
序列
与豌豆"
5+6()6"*+7()
#+可可"
289$:$)",","$
#
和毛果杨"
5$
%
(;(6*+,8$,"
%
"
#的相似性分别为
(c
+
(c
和
$c
表明克隆得到的序列属于类
-./#
基因家族
>,B
!
氨基酸序列及系统进化树分析
ABC450
分析表明!
!*-./#
基因编码
#*$
个
氨基酸!等电点"
@
U
#为
K,%*
!相对分子质量为
#K,%K
GA5
!无信号肽
MQHaC
预测表明!该序列由
#%,#&c
#
+
螺旋+
!&,$*c
延伸链+
,Kc
$
+
转角和
$$,&%c
无规则卷曲组成
BD2U265/Y
结果表明!
苦荞
RYLMA#
与拟南芥 "
1":+<$
%
6+6*8";+"="
#
CYLMA#
+可可"
289$:$)",","$
#
]>LMA#
和豌豆
"
5+6()6"*+7()
#
H/LMA#
相似性分别为
$(c
+
c
图
#
!
苦荞
!*-./#ABC
"
C
#和
>ABC
"
2
#扩增
R.
7
,#
!
!*-./#ABC
"
C
#
50[>ABC
"
2
#
54
@
6.9.>5Y.8089!0*"*"+,()
a
#
,a5XF:X
%
&
a
!
,a5XF:XAL!"""
图
!
!
!*-./#
基因结构示意图
C]E
表示起始密码子&
]CC
表示终止密码子
R.
7
,!
!
!*-./#
7
:0:/YX=>Y=X:[.5
7
X54
]?:C]E4:50/.0.Y.5Y8X>8[80
&
]CC4:50/Y:X4.05Y8X>8[80
和
&c
将
RYLMA#
氨基酸序列与其它物种
LMA#
氨基酸序列进行对序列比对结果"图
%
#表明!苦荞
RYLMA#
与拟南芥等植物的
LMA#
都具有
%
个共同
的保守肽基序!结构为
D` D`` I` L`aS` E`C` M+
N` D` D`
!是锌指蛋白的典型的保守序列!而其它区
域相似性较低
采用
a3EC$,"
软件将
LMA#
氨基酸序列进
行比对!并采用邻接法构建系统发育进化树"图
&
#!
发现 苦 荞
RYLMA#
与 拟 南 芥
CYLMA#
+甘 蓝
28LMA#
+
28LMA!
等共分布于进化树簇
&
!而拟南
芥
CYLQL#
+水稻
Q/LMA#
和玉米
14LQL#
等分布
于进化树簇
"

>?C
!
苦荞
1#203$
表达分析
使用荧光定量
HDI
分析
!*-./#
在
JN+2
+水
杨酸和
&O
冷处理下各个时间段的转录水平以苦
荞组蛋白
W%
为内参基因!
"?
为对照组!使用
!
)
##
4
]法计算
!*-./#
基因表达量变化的倍数关
系
JN+2
处理结果"图
$
#表明!
!*-./#
基因表达
从
JN+2
处理
!?
开始上升!到
?
达到最大!为对
照"
?
#的
%,K&
倍!
?
后有所下降!但仍然维持较
高表达量水杨酸处理结果"图
$
#表明!
*-./#
基
因的表达量从水杨酸处理的
!?
开始上升!
&?
有所
图
%
!
不同植物
LMA#
氨基酸序列比对
图中从上至下依次代表的是苦荞+甘蓝+拟南芥+
玉米+水稻+竹子+拟南芥中相应的
LMA#
氨基酸序列&
划线部分为
_9+LMA#
锌指蛋白结构域
R.
7
,%
!
C6.
7
04:0Y8954.085>.[/:
^
=:0>:/
89LMA#9X84[.99:X:0Y
@
650Y/
]?:54.085>.[/:
^
=:0>:.0Y?:45
@
/\?.>?9X84Y?:Y8
@
Y8Y?:
;8YY845X:
$
!"
#
$
%&
()*"*"+,()
!
>"66+,"$;9",9"
!
1":+<$
%
6+6
*8";+"="
!
?9")"
&
6
!
@
&
A"6"*+7"
!
>"):(6"$;<8")++
!
1":+<$
%
6+6
*8";+"=",]?:_9+LMA#_.0>9.0
7
:X
@
X8Y:.0[845.0/5X:6.0:[
#*
&
期
!!!!!!!!!
高
!
飞!等$苦荞锌指蛋白基因
!*-./#
的克隆及其对非生物胁迫的应答
图
&
!
苦荞
LMA#
与其他植物
LMA#
氨基酸序列的系统发育树
R.
7
,&
!
H?
<
68
7
:0:Y.>YX::;5/:[8054.085>.[
/:
^
=:0>:/89RYLMA#50[8Y?:X
@
650Y/
图
$
!
JN+2
和
MC
处理条件下
!*-./#
表达量
R.
7
,$
!
!*-./#:`
@
X://.806:Z:6/=0[:XJN+2
50[MCYX:5Y4:0Y>80[.Y.80/
图

!
&O
冷处理条件下
!*-./#
表达量
R.
7
,
!
!*-./#:`
@
X://.806:Z:6/=0[:X
&O>86[YX:5Y4:0Y>80[.Y.80/
下降!但在
"

#"?
表达量保持稳定上升趋势!到
#"?
达到最大
值!为对照"
?
#的
%,&&
倍&
#!?
后表达量突然下
降!仅为对照"
?
#的
#,K$
倍
&O
冷处理结果"图

#表明!
!*-./#
基因的表
达量整体趋势保持稳定!
#!?
开始上升!
&K?
达到
最大值!为对照"
?
#的
#,%$
倍
"?
下降回到冷
处理前的水平!然后维持稳定
%
!
讨
!
论
高通量测序技术作为新一代的测序技术!目前
广泛应用于基因组和转录组的测序!
L5.
等)#$*根据
获得的红薯"
B
%
$)$9":"*"*"6
#转录组数据克隆得到
红薯尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶!目前根据转录组数
据克隆获得基因序列已经成为一种快速高效的克隆
方法!与
ICD3
等其它技术相比!具有简便+高效+
节省经费等特点本实验根据获得的苦荞花期转录
组数据库!首次在苦荞中克隆得到
#
条锌指蛋白基
因
!*-./#
!获得该基因的
ABC
和
>ABC
序列!为
从分子水平研究苦荞抗逆性提供一条靶基因
L.=
等)#*对植物
LMA#
型锌指蛋白家族进行了
分类!含有
%
个
_9+LMA#
蛋白+
!
个
_9+LMA6
蛋白以
及
#
个
_9+LMA6
蛋白!同时发现具有调控细胞死亡+
植物抗病性以及植物对非生物胁迫抗逆性功能的锌
指蛋白多属于
%
个
_9+LMA#
蛋白的亚家族通过氨
基酸序列比对!可知
RYLMA#
具有
%
个典型的
D!D!
型锌指蛋白结构域
_9+LMA6
!且与十字花科植物拟南
芥
CYLMA#
和甘蓝
28LMA#
高度同源!而与禾本科
植 物 玉 米
14LQL#
+水 稻
Q/LMA#
和 竹 子
28?LQL#
相比!仅在锌指蛋白保守结构域
_9+LMA#
"
D` D`` I` L`aS` E`C` MN` D` D`
#处保守!而在
%
个
_9+LMA#
间隔区域保守性较低!这种结构为该类
蛋白调控功能的多样化提供了分子依据另外!
RYLMA#
氨基酸序列第一个
_9+LMA#
结构域的第
#"
个氨基酸
a:Y
被同为疏水氨基酸的
L:=
取代!但不
影响其锌指结构域的形成)#**!相关功能是否存在不
同有待进一步研究由进化树可知!同一物种的拟
南芥
CYLMA#
和
CYLQL#
分属不同的簇!而研究表
明
CYLMA#
和
CYLQL#
具有相反的功能!
CYLMA#
参与负调控
IQM
介导的信号通路!而
CYLQL#
参
与正调控!推测苦荞
RYLMA#
与
CYLMA#
具有相似
的功能!参与负调控
IQM
介导的信号通路!限制植
物对外界的应激!防止细胞死亡的扩散)#K*
据报道!
MC
处理+
JN+2
处理和冷刺激等非生
物胁迫均能打破植物体内氧代谢平衡!造成
IQM
的
过量积累!引起细胞的死亡
G6.:;:0/Y:.0
等)#(*研
究表明!拟南芥
1*-./#
通过上调铜锌超氧化物歧
化酶"
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#来清除
IQM
!防止细胞死亡的扩
散本研究发现!苦荞
!*-./#
基因在水杨酸和
JN+2
处理条件下表达上调!说明
!*-./#
可能参
与了苦荞的抗
JN+2
和水杨酸的防卫反应!其中
JN+2
处理条件下
!*-./#
表达上调较水杨酸处理
迅速!说明该基因对不同的外界刺激具有不同的响
应速度而
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冷处理条件下!
!*-./#
基因表达
量相对稳定
W=50
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等)!"*研究表明!
&O
冷处理条
件下拟南芥
1*-./#
表达量在
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内表达量维持
稳定!而在
*!?
后开始积累!暗示在冷胁迫的初期
阶段!植物可能存在其它的途径来抵抗冷刺激
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西
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北
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植
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物
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学
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报
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卷
苦荞主要分布在中国西南山区!该地区干旱+昼
夜温差大+紫外线强!而苦荞具有良好的适应性!表
现出良好的抗逆性能已有的研究主要集中在苦荞
如何通过提高黄酮类物质合成来参与抗逆过程!而
本实验则首次对苦荞抗逆相关的锌指蛋白基因
!*-./#
进行研究!分析其在
JN+2
+水杨酸和冷处
理等非生物学胁迫下的响应!为研究苦荞的抗逆机
制提供新的思路
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