全 文 ：书西北植物学报!
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收稿日期$!"#&+#!+#! &修改稿收到日期$
!"#$+"!+"( 基金项目$四川省教育厅青年基金"
#%12"!(&
#
作者简介$高 ! 飞" #((#) #!男!在读硕士研究生!主要从事植物分子生物学研究 3+45.6$
7
589:.;.868
756.
<
=0,>84
"
通信作者$姚慧鹏!博士!副教授!主要从事植物分子生物学研究 3+45.6$
<
58?=.
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7
"(!#
!
#%,>84
苦荞锌指蛋白基因
1#203$的克隆 及其对非生物胁迫的应答 高 ! 飞!姚攀锋!雒晓鹏!李成磊!吴 ! 琦!姚慧鹏" "四川农业大学 生命科学院!四川雅安 !$"#&
#
摘
!
要$根据苦荞" !" #$
%&
()*"*"+,()
#花期转录组数据!分别以苦荞
ABC
和
>ABC
为模板!克隆得到
#
个苦荞
D!D!
型锌指蛋白基因
!*-./#
"
E:0250F
登录号
GH!$!#%& #的 ABC 序列和 >ABC 序列!采用实时荧光定量 HDI 方法!研究了 !*-./# 基因在非生物胁迫下的表达模式结果显示$苦荞
!*-./#
基因
ABC
全长
!&!*;
@
!由

个
外显子和
$个内含子构成!符合 EJ+CE 剪切原则& >ABC 序列包含一个$!K;
@
开放阅读框!编码
#*$个氨基酸!具 有 LMA# 家族的典型结构域& JN+2 照射和水杨酸处理均能使 !*-./# 基因的表达量上升!且 JN+2 处理在 ? 达 到最大!为 "? " DG #的 %,K& 倍&水杨酸处理于 #"? 达到最大!为 "? " DG #的 %,&& 倍!而 &O 冷胁迫下该基因表达量 保持稳定推测该基因可能参与苦荞抗 JN+2 和高浓度水杨酸等非生物胁迫的应答反应!为苦荞的抗逆性研究提 供新的视角 关键词$苦荞&锌指蛋白
LMA#
&基因克隆&非生物胁迫
中图分类号$P*K$
&
P*K(
文献标志码$C %&"# ( )!*+ , -.//#"0)& 1 /#/"23#45# ( .-6-"7.#8.. 1#203$#1$4 & 56 (78#$#$(-"789!.-0:#"7#4;7-.// ECQR:. ! SCQH509:0 7 ! LJQT.58 @ :0 7 ! LUD?:0 7 6:. ! VJP. ! SCQW=. @ :0 7 " " D86: 7 :89L.9:M>.:0>: ! M.>?=50C 7 X.>=6Y=X56J0.Z:X/.Y < ! S5 ( 50 ! M.>?=50!$"#&
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!!
类
-./#
基因编码一类特殊的
D!D!
型锌指蛋
白!含有
%
个特殊的锌指结构域$D` D`` I` L`aS`+ E`C` MN` D` D` !又称为 _9+LMA# 结构域)#*该基 因家族克隆的首个基因是拟南芥 1*-./# !随后在 水稻+小麦+玉米等植物中发现并克隆出更多含有 _9+LMA# 结构域的基因)!+%*功能研究表明!这类 LMA# 型锌指蛋白在细胞过敏性死亡+植物广谱抗 病性以及植物对低温+长日照等非生物环境胁迫具 有调 控 功 能)&* A50.: 等)$*研 究 表 明!拟 南 芥
1*-./#
基因功能是通过应答水杨酸"
/56.>
<
6.>
5>.[
!
MC
#信号分子!上调铜锌超氧化物歧化酶"
D=+
10MQA
#来清除由病原菌或者其它非生物胁迫造成
的过量积累的活性氧"
X:5>Y.Z:8`
<7
:0/
@
:>.:/
!
IQM
#!减轻氧迸发引起的二次伤害
苦荞"
!"
#
$%& ()*"*"+,() #又称鞑靼荞麦! 属蓼科" H86 <7 805>:5: #荞麦属一年生草本植物主 要分布在中国西南高寒山地)*苦荞含有丰富的生 物类黄酮!对人类多种疾病具有预防治疗作用!被誉 为新型的绿色保健食品!备受青睐)*+K*苦荞抗逆能 力强!能适应高寒+高海拔+强紫外及干旱等恶劣环 境目前!关于苦荞抗逆及抗氧化的研究主要集中 于黄酮类化合物和 MQA 酶类对 IQM 的清除方面 M=_=F. 等)(*证明苦荞在受到紫外线+冷和干旱胁迫 时叶片中的芦丁含量以及芦丁葡萄糖苷酶活性显著 上升!以此来清除胁迫条件下产生的过量 IQM 董 新纯等)#"*研究发现!苦荞经 JN+2 处理后!其 MQA 总活性提高!说明苦荞在受到胁迫时!通过提高抗氧 化酶活性清除 IQM 以保护细胞!而其中的分子调控 机制尚不清楚 本实验根据获得的苦荞花期转录组数据!采用 I]+HDI 技术克 隆 苦 荞 抗 逆 相 关 的 锌 指 蛋 白 !*-./# 基因序列!并采用 JN+2 + !4486 % L 水杨 酸和 &O 冷胁迫处理二叶期苦荞!探究 !*-./# 基 因的表达与外界非生物胁迫的相关性!为从分子水 平探究苦荞抗逆和抗氧化的机制提供参考!也为苦 荞的抗逆性研究提供新的视角 # ! 材料和方法$,$! 材料及处理 苦荞",西荞二号(#种植于四川农业大学生命科 学院实验室培养箱!培养条件为光照 #? !黑暗 K ? !温度" !!b! # O !相对湿度 "c !培养至二叶期 供试备用 JN+2 处理$使用
#"VJN+2
"
%"K04
#
L3A
灯
照射二叶期苦荞!光照距离
%">4
水杨酸处理$使 用 !4486 % L 浓度水杨酸!叶面喷施二叶期苦荞!以 叶面滴水为度!以上处理均于处理前 "? +处理后 ! + & + + K + #" 和 #!? 分别取供试样品叶片!液氮冷冻 后置于 )K"O 备用 &O 冷处理$将二叶期苦荞转
移至培养条件为光照
#?
!黑暗
K?
!温度
&O
!相
对湿度
"c
的光照培养箱!于处理前
"?
+处理后
#!
+
!&
+
%
+
&K
+
"
和
*!?
取供试样品叶片!液氮冷
冻后置于
)K"O
备用
$,> ! 方 ! 法$?>?$! 1#203$@A0
序列和
4@A0
序列的克隆
!
采用改良
MAM
法)##*提取苦荞叶片总
ABC
!采用植
物
IBC
8=Y
试剂盒提取各处理样品的总
IBC
!并以
其为模板使用
HX.4:M>X.
@
YI]X:5
7
:0YG.YV.Y?
7
ABC3X5/:X
"
H:X9:>YI:56].4:
#试剂盒反转录制
备
>ABC
第一条链根据本实验室获得的苦荞花
期转录组数据!设计
#
对特异引物
RYLMA#9
"
$d+ ]]D]CDDC]]]]CDEDD]DDD]DD+%d #和 RYLMA#X "$d+DECDDEE]CDED]E]]ECE]C]CCD+%d
#!
分别以苦荞总
ABC
和
>ABC
第一条链为模板!
HDI
扩增
!*-./#ABC
序列和
>ABC
序列!
HDI
产物回收纯化后连接至
@
aA#(+]
载体!阳性克隆
送上海英骏生物公司测序
$,>,> ! 序列分析 ! 使用 BD2U 在线工具 265/Y 进行 !*-./# 核苷酸序列及其编码的蛋白质氨基酸序列 同源性分析&使用 ABCaCB 进行多序列比对&利 用 a3EC$,"
将对比结果采用邻接法"
0:.
7
?;8X+
-
8.0.0
7
!
Be
#构建系统进化树
$?>?B ! 苦荞 1#203$
基因表达
!
设计
#
对实时定
量
HDI
特异引物
RYLMA#P9
"
$d+]E]C]DDD]]+ ]EECEDCDDC]DCE+%d #和 RYLMA#PX "$d+ED+
DCCDDCDCCDC]]ED]ECDD+%d
#!以苦荞组蛋
白
W%
基因)#!*为内参基因!引物为
W%P9
"
ECCC]+
]DEDCCE]CDDCECCECE
#和
W%PX
"
DDCC+
DCCEE]C]EDD]DCED
#!采用
]5F5X5
公司实时
荧光定量
HDI
试剂盒
MS2IHX:4.` 3` 2"
3
]a
"
"
H:X9:>YI:56].4:
#!在
2UQ+ICA
公司的
DRT(
I:56+].4:M
<
/Y:4
进行荧光定量!数据采用
!
)
##
4
]
方法)#%*分析!采用
U2aMHMMMY5Y./Y.>/!"
统计软
件对水杨酸+
JN+2
和冷胁迫下苦荞
!*-./#
基因
的表达进行数据分析
!
!
结果与分析
>?$! 苦荞 1#203$
基因
@A0
序列和
4@A0
序列的
克隆
采用特异引物
RYLMA#9
和
RYLMA#X
!以苦荞
ABC
为模板!
HDI
扩增得到
&""";
@
左右条带!测
序结果表明该片段长
&"K";
@
"图
#
!
C
#用该特异
引物!以苦荞
>ABC
为模板!
HDI
扩增得到
("";
@
左右条带"图
#
!
2
#!测序结果表明该片段长
K**;
@

"*
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$卷 >,> ! 核苷酸序列分析 通过 265/Y 比对苦荞 !*-./#ABC 和 >ABC 序列!确定其全长 ABC 序列为 !&!*; @ !由 个外 显子!$
个内含子构成"图
!
#!符合标准的
EJ+CE
剪切原则此外!位于
C]E
上游
$d+J]I 的 )! ; @ 和 )##(&; @ 之间!存在 # 个长度为 #%(#; @ 插 入片段!同时符合 EJ+CE 剪切原则!属于特殊的内 含子结构!是比较少见的基因类型)#&* HX:[.>Y.80 在线软件分析结果表明!在距离起始密码子 )##&" ; @ 至 )##("; @ 存在 # 个可能的启动子基础序列 苦荞 !*-./#>ABC 序列包含一个$!K;
@
开放阅
读框"
QIR
#
265/Y
序列比对显示!该
>ABC
序列
与豌豆"
5+6()6"*+7()
#+可可"
289$:$)",","$# 和毛果杨" 5$
%
(;(6*+,8$," % " #的相似性分别为 (c + (c 和$c
表明克隆得到的序列属于类
-./#
基因家族
>,B
!
氨基酸序列及系统进化树分析
ABC450
分析表明!
!*-./#
基因编码
#*$个 氨基酸!等电点" @ U #为 K,%* !相对分子质量为 #K,%K GA5 !无信号肽 MQHaC 预测表明!该序列由 #%,#&c # + 螺旋+ !&,$*c
延伸链+
,Kc
$+ 转角和$$,&%c 无规则卷曲组成 BD2U265/Y 结果表明! 苦荞 RYLMA# 与拟南芥 " 1":+<$
%
6+6*8";+"="
#
CYLMA#
+可可"
289$:$)",","$# ]>LMA# 和豌豆 " 5+6()6"*+7() # H/LMA# 相似性分别为$(c
+
c
图
#
!
苦荞
!*-./#ABC
"
C
#和
>ABC
"
2
#扩增
R.
7
,#
!
!*-./#ABC
"
C
#
50[>ABC
"
2
#
54
@
6.9.>5Y.8089!0*"*"+,()
a
#
,a5XF:X
%
&
a
!
,a5XF:XAL!"""
图
!
!
!*-./#
基因结构示意图
C]E
表示起始密码子&
]CC
表示终止密码子
R.
7
,!
!
!*-./#
7
:0:/YX=>Y=X:[.5
7
X54
]?:C]E4:50/.0.Y.5Y8X>8[80
&
]CC4:50/Y:X4.05Y8X>8[80
和
&c
将
RYLMA#
氨基酸序列与其它物种
LMA#
氨基酸序列进行对序列比对结果"图
%
#表明!苦荞
RYLMA#
与拟南芥等植物的
LMA#
都具有
%
个共同
的保守肽基序!结构为
D` D`` I` L`aS` E`C` M+
N` D` D`
!是锌指蛋白的典型的保守序列!而其它区
域相似性较低
采用
a3EC$," 软件将 LMA# 氨基酸序列进 行比对!并采用邻接法构建系统发育进化树"图 & #! 发现 苦 荞 RYLMA# 与 拟 南 芥 CYLMA# +甘 蓝 28LMA# + 28LMA! 等共分布于进化树簇 & !而拟南 芥 CYLQL# +水稻 Q/LMA# 和玉米 14LQL# 等分布 于进化树簇 " >?C ! 苦荞 1#203$
表达分析
使用荧光定量
HDI
分析
!*-./#
在
JN+2
+水
杨酸和
&O
冷处理下各个时间段的转录水平以苦
荞组蛋白
W%
为内参基因!
"?
为对照组!使用
!
)
##
4
]法计算
!*-./#
基因表达量变化的倍数关
系
JN+2
处理结果"图
$#表明! !*-./# 基因表达 从 JN+2 处理 !? 开始上升!到 ? 达到最大!为对 照" ? #的 %,K& 倍! ? 后有所下降!但仍然维持较 高表达量水杨酸处理结果"图$
#表明!
*-./#
基
因的表达量从水杨酸处理的
!?
开始上升!
&?
有所
图
%
!
不同植物
LMA#
氨基酸序列比对
图中从上至下依次代表的是苦荞+甘蓝+拟南芥+
玉米+水稻+竹子+拟南芥中相应的
LMA#
氨基酸序列&
划线部分为
_9+LMA#
锌指蛋白结构域
R.
7
,%
!
C6.
7
04:0Y8954.085>.[/:
^
=:0>:/
89LMA#9X84[.99:X:0Y
@
650Y/
]?:54.085>.[/:
^
=:0>:.0Y?:45
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Y8Y?:
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6+6
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A"6"*+7"
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>"):(6"$;<8")++ ! 1":+<$
%
6+6
*8";+"=",]?:_9+LMA#_.0>9.0
7
:X
@
X8Y:.0[845.0/5X:6.0:[
#*
&
期
!!!!!!!!!
高
!
飞!等$苦荞锌指蛋白基因 !*-./# 的克隆及其对非生物胁迫的应答 图 & ! 苦荞 LMA# 与其他植物 LMA# 氨基酸序列的系统发育树 R. 7 ,& ! H? < 68 7 :0:Y.>YX::;5/:[8054.085>.[ /: ^ =:0>:/89RYLMA#50[8Y?:X @ 650Y/ 图$
!
JN+2
和
MC
处理条件下
!*-./#
表达量
R.
7
,$! !*-./#:` @ X://.806:Z:6/=0[:XJN+2 50[MCYX:5Y4:0Y>80[.Y.80/ 图 ! &O 冷处理条件下 !*-./# 表达量 R. 7 , ! !*-./#:` @ X://.806:Z:6/=0[:X &O>86[YX:5Y4:0Y>80[.Y.80/ 下降!但在 " #"? 表达量保持稳定上升趋势!到 #"? 达到最大 值!为对照" ? #的 %,&& 倍& #!? 后表达量突然下 降!仅为对照" ? #的 #,K$
倍
&O
冷处理结果"图

#表明!
!*-./#
基因的表
达量整体趋势保持稳定!
#!?
开始上升!
&K?
达到
最大值!为对照"
?
#的
#,%$倍 "? 下降回到冷 处理前的水平!然后维持稳定 % ! 讨 ! 论 高通量测序技术作为新一代的测序技术!目前 广泛应用于基因组和转录组的测序! L5. 等)#$*根据
获得的红薯"
B
%
$)$9":"*"*"6
#转录组数据克隆得到
红薯尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶!目前根据转录组数
据克隆获得基因序列已经成为一种快速高效的克隆
方法!与
ICD3
等其它技术相比!具有简便+高效+
节省经费等特点本实验根据获得的苦荞花期转录
组数据库!首次在苦荞中克隆得到
#
条锌指蛋白基
因
!*-./#
!获得该基因的
ABC
和
>ABC
序列!为
从分子水平研究苦荞抗逆性提供一条靶基因
L.=
等)#*对植物
LMA#
型锌指蛋白家族进行了
分类!含有
%
个
_9+LMA#
蛋白+
!
个
_9+LMA6
蛋白以
及
#
个
_9+LMA6
蛋白!同时发现具有调控细胞死亡+
植物抗病性以及植物对非生物胁迫抗逆性功能的锌
指蛋白多属于
%
个
_9+LMA#
蛋白的亚家族通过氨
基酸序列比对!可知
RYLMA#
具有
%
个典型的
D!D!
型锌指蛋白结构域
_9+LMA6
!且与十字花科植物拟南
芥
CYLMA#
和甘蓝
28LMA#
高度同源!而与禾本科
植 物 玉 米
14LQL#
+水 稻
Q/LMA#
和 竹 子
28?LQL#
相比!仅在锌指蛋白保守结构域
_9+LMA#
"
D` D`` I` L`aS` E`C` MN` D` D`
#处保守!而在
%
个
_9+LMA#
间隔区域保守性较低!这种结构为该类
蛋白调控功能的多样化提供了分子依据另外!
RYLMA#
氨基酸序列第一个
_9+LMA#
结构域的第
#"
个氨基酸
a:Y
被同为疏水氨基酸的
L:=
取代!但不
影响其锌指结构域的形成)#**!相关功能是否存在不
同有待进一步研究由进化树可知!同一物种的拟
南芥
CYLMA#
和
CYLQL#
分属不同的簇!而研究表
明
CYLMA#
和
CYLQL#
具有相反的功能!
CYLMA#
参与负调控
IQM
介导的信号通路!而
CYLQL#
参
与正调控!推测苦荞
RYLMA#
与
CYLMA#
具有相似
的功能!参与负调控
IQM
介导的信号通路!限制植
物对外界的应激!防止细胞死亡的扩散)#K*
据报道!
MC
处理+
JN+2
处理和冷刺激等非生
物胁迫均能打破植物体内氧代谢平衡!造成
IQM
的
过量积累!引起细胞的死亡
G6.:;:0/Y:.0
等)#(*研
究表明!拟南芥
1*-./#
通过上调铜锌超氧化物歧
化酶"
D=+10MQA
#来清除
IQM
!防止细胞死亡的扩
散本研究发现!苦荞
!*-./#
基因在水杨酸和
JN+2
处理条件下表达上调!说明
!*-./#
可能参
与了苦荞的抗
JN+2
和水杨酸的防卫反应!其中
JN+2
处理条件下
!*-./#
表达上调较水杨酸处理
迅速!说明该基因对不同的外界刺激具有不同的响
应速度而
&O
冷处理条件下!
!*-./#
基因表达
量相对稳定
W=50
7
等)!"*研究表明!
&O
冷处理条
件下拟南芥
1*-./#
表达量在
*!?
内表达量维持
稳定!而在
*!?
后开始积累!暗示在冷胁迫的初期
阶段!植物可能存在其它的途径来抵抗冷刺激
!*
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$卷 苦荞主要分布在中国西南山区!该地区干旱+昼 夜温差大+紫外线强!而苦荞具有良好的适应性!表 现出良好的抗逆性能已有的研究主要集中在苦荞 如何通过提高黄酮类物质合成来参与抗逆过程!而 本实验则首次对苦荞抗逆相关的锌指蛋白基因 !*-./# 进行研究!分析其在 JN+2 +水杨酸和冷处 理等非生物学胁迫下的响应!为研究苦荞的抗逆机 制提供新的思路 参考文献! ) # * ! AU3]IUDWIC ! IUDW23IEa W ! MDWaUA]I ! 9*";,C08Z:6_.0>9.0 7 :X @ X8Y:.0./:0>8[:[; < Y?:1":+<$
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6+6-./#
7
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7
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