全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 42(3): 260-266(2012)
收稿日期: 2011-09-22; 修回日期: 2011-12-22
基金项目: 国家自然科学基金(30871607)
通讯作者: 张世宏,教授,主要从事分子植物病理学、植物逆境分子生物学及抗逆基因工程研究; Tel: 0431-87836274, E-mail:zhang_sh
@ jlu. edu. cn
第一作者: 王艳丽(1986 - ),女,内蒙古赤峰人,硕士,主要从事植物病理学研究; E-mail:agatha087@126. com
李 健(1986 - ),男,山东临沂人,博士,主要从事植物逆境分子生物学及抗逆基因工程研究; E-mail:li_jian08@mails. jlu. edu. cn。
极端低温对稻瘟菌的筛选及其生化机制初探
王艳丽1#, 李 健1#, 柳玉芳2, 靳春鹏1, 刘金亮1,
贾保磊1, 赵文生3, 潘洪玉1, 张世宏1*
( 1吉林大学植物科学学院, 长春 130062; 2龙口市诸由观镇农业技术服务站, 龙口 265705;
3中国农业大学农学与生物技术学院, 北京 100193)
摘要:本研究利用来自我国南北稻区田间稻瘟菌菌株,对其进行了低温耐受性比较和统计分析。 结果表明,南方与东北田
间稻瘟菌在低温耐受性上存在明显差异:95%东北菌株可以忍受至少一周的 -15℃低温处理,而相同条件下南方菌株仅有
65%菌株存活。 模拟东北冬季田间生境,选取 10 株低温敏感型菌株进行临界致死低温条件下的继代处理,发现 - 15℃条
件下反复冻融处理 55 次后,其中 8 株低温耐受水平得到显著提高,且部分菌株的培养性状和抗药性相继发生改变。 在此
基础上,对抗性增强菌株的非原生质体蛋白进行双向电泳和差异蛋白质质谱分析,获得了响应低温的分泌蛋白及其指纹信
息。 本研究为进一步探索温度等环境因子对稻瘟菌的致变作用奠定了基础。
关键词: 稻瘟病菌; 极端低温; 变异; 双向电泳
Effects of extreme low temperature on the biological and biochemical activities of
Magnaporthe oryzae 　 WANG Yan-li1, LI Jian1, LIU Yu-fang2, JIN Chun-peng1, LIU Jin-liang1,
JIA Bao-lei1, ZHAO Wen-sheng3, PAN Hong-yu1, ZHANG Shi-hong1 　 ( 1College of Plant Sciences, Jilin Univer-
sity, Changchun 130062; 2Longkou Zhuyouguan Agriculture Technology Station, Longkou 265705; 3College of Agriculture and
Biotecnology, China Agricultural University, Beijing 100193)
Abstract: Tolerance comparisons to low temperature were performed between different strains of blast fungi
isolated from rice fields of Northern and Southern China. Statistical analysis indicated that there existed a re-
markable difference in low temperature tolerance between northern and southern isolates. More than 95%
strains from northeastern area can tolerate low temperature of - 15℃ at least for one week. However, only
65% strains from Southern China can survive. Based on this, several strains sensitive to low temperature were
selected and subjected to the critical lethal low temperature for successive generations. The results showed that
low-temperature tolerability of eight strains were significantly improved through 55 cycles of repeated freeze-
thaw treatment. Culture characteristics and resistance to antifungal chemicals of some strains were also
changed. Eleven secretory proteins from the enhanced tolerant strains were identified by two dimensional gel
electrophoresis and mass spectrometry analysis. This study provides important information for effective strategy
in the prevention and control of rice fungal blast.
Key words: rice blast fungus; extreme low temperature; variation; 2-D analysis
中图分类号: S432. 1; S432. 44　 　 　 　 　 文献标识码: A　 　 　 　 　 文章编号: 0412-0914(2012)03-0260-07
　
　 3 期 　 　 王艳丽,等:极端低温对稻瘟菌的筛选及其生化机制初探
　 　 黑龙江、吉林、辽宁三省是我国东北稻作区的
典型代表,水稻种植面积近 5 000 万亩,在我国粮
食总产量中占据着举足轻重的地位。 由稻瘟病菌
(Magnaporthe oryzae)引起的水稻稻瘟病是危害水
稻的重要病害。 近几年,在东北地区稻瘟病发生愈
加猖獗且有逐年加重的趋势:以黑龙江省为例,仅
进入 21 世纪后,就出现过三次大的流行(2002、
2005 和 2006 年),造成了重大的经济损失[1]。 稻
瘟病发病因素非常复杂,受病原菌自身的遗传变
异、水稻抗性和环境因素的综合作用影响。 稻瘟菌
田间菌株呈现极其复杂的群体结构,保证了优势小
种的出现和发生,给稻瘟病防治带来了极大的
困难。
对于稻瘟菌的变异机制已有广泛的研究。 早
在 1998 年,Covert[2]就注意到稻瘟病菌存在核型
多变的现象,这显示了染色体的不稳定性和易变
性。 对中国和美国稻瘟菌菌株进行核型分析发现,
染色体呈现 3 ~ 10 Mb 变化的现象,而且还发现一
类分子量较小 (470 kb ~ 2. 2 Mb)的小染色体
(minichromosomes) [3,4]。 在稻瘟病菌基因组序列
中存在着大量的重复序列,其中 9. 7%为高度重复
序列(长度大于 200 bp、相似性超过 65% ) [5]。 重
复序列与稻瘟菌基因复制、基因重组或染色体重排
及序列的多样性是紧密相关的[6],而稻瘟菌这些
高度重复序列的存在是由其无性生殖的生活方式
所决定的[7]。 Shen等[8]和 Wang 等[9]通过对不同
稻瘟病菌的菌丝融合和无性重组研究,认为菌丝融
合是稻瘟病菌变异和致病性分化的重要机制。 除
此之外,稻瘟菌的有性重组、准性生殖以及自发的
突变均可能导致稻瘟菌变异的发生。 目前关于稻
瘟病大规模爆发的原因主要集中于单一品种种植
和寄主诱导方面,对于稻瘟菌侵染循环过程中的环
境因子的研究则相对较少。 而实际上多数极端的
环境因子都可能成为潜在的诱发因素,其中尤以对
生命活动构成威胁的逆境最为重要。 早在 1987
年,Bonman等[10]对 Ou等[11]研究过的稻瘟病菌株
再进行鉴定,结果与原来的结论不一致,认为是由
于接种病菌的环境条件不稳定导致菌株高度变异。
一直以来,利用紫外线、γ-射线、微波、药剂等物理
化学条件诱导稻瘟菌发生突变获得突变体,是研究
稻瘟菌变异的常用方法[12]。 Shen 等[13]通过逐代
重复分离药剂诱导菌株,并对原始菌株和诱导菌株
对三环唑的敏感性以及三环唑对它们的持效期进
行了测定,发现随诱导代数的增加,菌株对药剂的
敏感性渐次降低,药剂对菌株的持效期明显缩短,
但其致病性无明显变化趋势。 Zhang 等[14]将 6 个
稻瘟菌菌株分别在含有 60 μg·L -1氯酸钾的 MM
培养基上培养 40 d,共得到 11 个硝酸盐利用缺陷
突变体,其中可交配菌株产子囊壳的能力与亲本有
显著差异,推测可能是受培养基类型及组分尤其是
维生素的影响。
本研究利用我国南北来源的众多稻瘟菌菌株,
初步检测其低温耐受性后,选取部分菌株进行模拟
冬季低温循环处理,持续低温诱导后检测相关指标
变化。 初步印证了低温对稻瘟菌的选择和致变作
用,有助于进一步探索极端环境因子参与下的稻瘟
菌的变异机制,掌握东北地区稻瘟病发生的规律和
小种变异动态,为实现稻瘟病的有效防治奠定理论
基础。
1　 材料与方法
1. 1　 供试材料
供试菌株:北方菌株为 2005 ~ 2008 年从吉林
省和黑龙江省各市(县)采集并单孢分离得到的
107 个有效菌株,南方稻瘟菌菌株为从浙江省和云
南省等地征集到的 89 个单孢菌株。
1. 2　 东北冬季闲置稻田的生境模拟
根据国家气象局气象资料(www. cma. gov.
cn)和田间连续多年测量数据模拟自然生境。
1. 3　 稻瘟菌低温耐受性测定
1. 3. 1　 稻瘟菌低温致死时间测定　 将供试稻瘟菌
菌株转移至固体 CM 培养基(酵母浸粉 1 g、酶水
解干酪素 0. 5 g、酸水解干酪素 0. 5 g、葡萄糖 10 g、
Ca(NO3) 2 ·4H2O 1 g、KH2PO4 0. 2 g、MgSO4 ·
7H2O 0. 25 g、NaCl 0. 15 g、琼脂 18 g 加蒸馏水定
容至 1 000 mL)活化培养。 用 5 mm打孔器取生长
一致的菌碟置于无菌的空培养皿中,4 ℃预处理,
然后置于 - 15℃低温处理。 定期取出部分试样,4
~ 8℃缓慢解冻后,放至 CM培养基进行常规培养,
测定不同低温致死所需的时间。
1. 3. 2　 稻瘟菌膜透性分析　 应用电导率仪测定电
解质渗漏程度。 等量菌体加入 10 mL 去离子水,
162
　
植物病理学报 42 卷
真空抽气 10 min后静置 1 h,用 DDS-320 型台式电
导仪测定溶液的电导率值 S1,然后置于沸水中 30
min,冷却后测总电导率 S2,计算相对电导率 L =
S1 / S2。
1. 4　 稻瘟菌低温致变方法
根据稻瘟菌低温耐受水平,取菌碟于 - 15 ℃
低温处理 3 d,4 ~ 8℃解冻后进行常规培养,重复这
一过程,循环 55 次后检测各项指标。
1. 5　 稻瘟菌低温循环诱导前后生理生化指标
检测
1. 5. 1　 低温耐受性测定　 稻瘟菌低温耐受性的测
定方法参照 1. 3。
1. 5. 2　 三环唑耐受性测定　 将预培养 7 d 的供试
菌株制成直径为 5 mm的菌碟,挑取菌碟置于含有
60 μg·L -1三环唑的培养基中央,25℃恒温培养,
观察稻瘟菌的生长速率。
1. 6　 双向电泳分析及抗冻活性测定
1. 6. 1　 非原生质体蛋白的提取　 参考植物非原生
质体提取方法[15],并略作改进。 将菌体悬浮于预
冷的抗坏血酸和 CaCl2 混合液(1 ∶ 1,20 mmol·
L -1)并抽真空,过滤(3 M 滤纸)后装入自制抽提
器(20 mL注射器与 50 mL 离心管改装),离心 30
min( -4 ℃,8 000 rpm)。 收集蛋白提取液,加入
两倍体积的预冷的丙酮 (包含 10% 的 TCA),
-20℃沉淀过夜,12 000 rpm,4℃,离心 15 min。
预冷丙酮洗沉淀 3 次,真空低温抽干。 沉淀溶于
200 μL水化液(7 mol·L -1尿素,2 mol·L -1硫
脲,4%CHAPS,1%DTT,2% IPG Buffer(pH4 ~ 7),
0． 002%痕量溴酚蓝)充分溶解。 4℃,12 000 rpm
离心 15 min,取上清。 Bradford方法[16]定量蛋白。
1. 6. 2 　 抗冻活性的测定 　 使用 ADVANCE3000
渗透压计,参考 Pudney 等[17]方法,测定热滞活性
( thermal hysteresis activity, THA),判断低温抗性。
1. 6. 3　 非原生质体的双向电泳分析　 采用被动水
化的方式,取含有 150 μg蛋白质的水化液,加入水
化液补充体积至 200 μL,取 11 cm(pH4 ~ 7)胶条,
20 ℃水化 16 h,等电聚焦(100 V,1 h;500 V,1 h;
1 000 V,1 h;8 000 V,5 h)。 等电聚焦结束后,分
别用含 1% DTT和 2. 5% 碘乙酰胺的平衡缓冲液
(50 mmol·L -1 Tris-HCl,pH8. 8;6 mol·L -1尿
素;30% (v / v)甘油;2% (w / v) SDS 和痕量溴酚
蓝)平衡胶条各 10 min。 12% SDS-PAGE 垂直电
泳。 考马斯亮蓝染色,Image scanner 扫描图像,并
用 Image master图像分析软件对图像进行分析。
1. 6. 4　 差异表达蛋白的质谱鉴定　 胶内蛋白点的
酶解参照 Liao 等[18]、Havlis 等[19]的方法,并略作
修改。 用修剪后的吸头从凝胶上获取蛋白点,转入
200 μL离心管内。 室温下,用无菌去离子水清洗
三次,加入 50 μL脱色液(50% 乙腈,25 mmol·L -1
碳酸氢铵)浸没管内的蛋白胶。 室温放置 30 min
等胶上染的颜色褪去后,低温真空干燥至凝胶成白
色颗粒状。 在 4℃条件下,胶粒用溶于 50 mmol·
L -1碳酸氢铵的 2 μmol·L -1胰蛋白酶酶解 5 h,酶
解后用 50% (v / v)乙腈︰ 5% (v / v)三氟乙酸提
取,脱盐后用于基质辅助激光解吸附 /电离飞行时
间串联质谱(MALDI-TOF MS / MS)分析。
2　 结果与分析
2. 1　 生境确立
根据中国气象局、吉林省气象局网站资料,吉
林省 12 月到次年 1 月的平均气温在 - 25℃ ~
-15℃;辽宁省的大部分地区的气温与吉林相似,
而黑龙江省的温度则更低。 由于地温的作用和冰
雪覆盖的原因,地表较空气温度高出 5℃左右,因
此,本研究选择 -15℃的温度环境模拟自然生境。
2. 2　 不同稻瘟菌菌株低温耐受性与电导率的
关系
将稻瘟菌菌株在 - 15℃下进行低温致死时间
检测,结果表明不同稻瘟菌菌株在对极端低温的忍
受度上存在显著的个体及地区差异。 在所有的供
试菌株中,39. 5%的菌株表现对低温的极度敏感,
在经过一周的低温处理后死亡,其中南方源菌株死
亡占 34. 8% 。 相对于采集自气候潮湿温润我国南
方的菌株,北方源菌株对低温的抵御性更强,95%
以上的东北源菌株可以忍受至少一周的 - 15℃低
温处理,而南方源菌株仅为 65% ,三周后南方菌株
的死亡率达到了 95. 5% ,而北方源菌株仅为
42． 1% (表 1),呈现出显著的地域差异。
262
　
　 3 期 　 　 王艳丽,等:极端低温对稻瘟菌的筛选及其生化机制初探
Table 1　 Sensitivity of Magnaporthe oryzae from different regions to low temperature
Parameter 1 week 2 weeks 3 weeks 4 weeks
Death No. of isolates from south of China ( frequency) 31(34. 8% ) 50(56. 2% ) 85(95. 5% ) 89(100. 0% )
Death No. of isolates from northeast of China ( frequency) 5(4. 7% ) 34(31. 8% ) 45(42. 1% ) 101(94. 4% )
The experiments were performed at - 15℃.
　 　 当生物体受到低温胁迫时,细胞膜透性增大,
电解质外渗,质膜的结构和功能受到影响,细胞膜
受到的伤害可以用相对电导率来衡量。 将供试菌
株根据低温耐受性水平的不同分为四组,分别测相
对电导率后取均值分析,实验结果初步表明:稻瘟
菌的相对电导率的大小与其低温耐受性水平呈现
相关性。 总体来说,菌株低温耐受性越强,相对电
导率越低(图 1)。
2. 3 　 稻瘟菌极端低温循环处理致变效应及生理
生化变化
选取最不耐低温的菌株 10 株,循环低温处理
55 次。 检测低温处理后菌株低温致死时间变化,
并检测其相对电导率变化。 从相对电导率可以看
出(图 2),处理过的菌株与未处理的相比,有 8 个
菌株的相对电导率变小,1 个菌株变大,1 个未变。
因此我们可以看出低温具有选择效应,长期的低温
选择过程能够诱导菌株向耐低温方向进化,从而产
生低温耐受性增强菌株。
　 　 抗药性测定结果显示,在经过长时间多次的循
环低温诱导后部分菌株呈现出三环唑耐受性增强
的趋势,但是这种增强趋势并不是很明显。 说明,
低温作为诱导因素,可以定向的诱导稻瘟菌菌株向
低温耐受性增强的趋势进化,而对于药物的耐受性
方面并未表现出普遍耐受性增强趋势,只有少数菌
株表现出对三环唑耐受性增强现象(图 3)。
2. 4　 非原生质蛋白表达分析和抗冻活性检测
通过对 200805 号低温诱导前后菌株非原生质
体蛋白进行双向电泳分析(图 4),表明 200805 号
菌株在经过低温诱导后,其非原生质体蛋白表达谱
发生了明显变化,部分蛋白点发生了 2 倍以上的表
达量变化,并选取这些蛋白点进行质谱鉴定(表
2)。 同时对 200805 号低温循环诱导前后稻瘟菌菌
株所提取的非原生质体蛋白液进行热滞活性检测
(图 5),表明经过多次低温诱导后,200805 号菌株
的非原生质体蛋白抗冻活性显著增强。
Fig. 1　 The relationship between relative con-
ductivity and the survival rate of Mag-
naporthe oryzae under cold stress of
-15℃
Fig. 2　 Effect of freeze-thaw cycles on relative
conductivity of different Magnaporthe
oryzae isolates
White and black columns represent freeze-thaw treated and
untreated samples, respectively.
The horizontal numbers represent different isolates. The bar
above the columns are standard error of three times repeats.
362
　
植物病理学报 42 卷
Fig. 3 　 Effect of freeze-thaw cycles on resis-
tance of tricyclazole of three different
Magnaporthe oryzae isolates
A: Growth of three isolates under normal conditions; B:
Growth of the same isolates after freeze-thaw cycles in the
presence of tricyclazole; C: Growth of the same isolates
without freeze-thaw cycles in the presence of tricyclazole.
3　 讨论
稻瘟菌侵染性菌体数量在经过越冬循环后会
显著减少,而且反复的低温冻融会降低稻瘟菌的致
病性[20]。 因此,理论上稻瘟菌较低的越冬存活能
力会限制其在我国东北水稻种植区的侵染循环和
大规模爆发,但是最近几年我国东北地区稻瘟病却
呈现出逐年严重的趋势,我们由此推测东北地区
秋、冬季的反复冻融以及极端低温在作为逆境因素
影响稻瘟菌的越冬存活和致病性的同时,也可能作
为诱发因子促进了稻瘟菌的变异,使得低温耐受性
高、致病性强、耐药性强的稻瘟菌菌株得以出现,并
导致大规模的稻瘟病害发生。
本研究中,北方源菌株的低温耐受性水平明显
高于南方源菌株,这是长期低温环境下稻瘟菌自然
选择进化的结果,东北地区每年的冬季都要经历严
寒与冰雪,对于稻瘟菌来说无疑是极端的逆境,尽
管东北地区引种水稻的历史较短,但稻瘟菌的易于
变异的特性,使其得以生存。 南方菌株长期生长于
气候温暖湿润的环境,对于低温的耐受性随着时间
的推移而减弱。 为了进一步明确低温对稻瘟菌的
致变和选择效应,在供试菌株中选取 10 株相对不
耐低温的菌株模拟田间的自然生境,进行长时间的
低温循环处理,分析生理生化变化。
经过数次的低温循环处理后,绝大多数的菌株
的低温耐受性增强。 也就是说在经过长时间的低
温驯化后,其对低温的抗性是可以获得的。 大多数
来自温带的植物经过驯化后可以表现对冷冻的耐
性[21]。 Wei等[22]将酿酒酵母进行 9 次的冷冻溶
解处理后,获得一株多抗的菌株,其对乙酸、乙醇、
冻溶、H2O2 与热激的忍耐度分别是初始菌株的
23、26、7、10 倍。 长期的低温循环处理,可能会导
致低温耐受性强、高抗药物、高致病性菌株的出现,
进而导致稻瘟病的大规模爆发。
Fig. 4　 The differentially expressed proteins of isolate 200805 before
( left) and after (right) two days treatment at 4 ℃
Arrows represent up-regulating proteins.
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　 3 期 　 　 王艳丽,等:极端低温对稻瘟菌的筛选及其生化机制初探
Table 2　 Isolate 200805 differentially accumulated proteins identified by MALDI-TOF MS / MS
No. Protein Score S. C / % Theor Mr / pi
1 Creato-platanim family 77 83 14195 / 4. 6
2 Predicted protein 300 100 16. 62 / 5. 56
3 PPI 284 100 11968 / 5. 29
4 POD 351 100 17993 / 5. 62
5 SOD 309 100 16530 / 6. 11
6 Hypothetical protein 214 100 32289 / 6. 01
7 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 226 100 35909 / 6. 46
8 Transaldolase 325 100 35635 / 5. 38
9 Adenosine kinase 245 100 38282 / 5. 18
10 Enolase 375 100 47077 / 5. 19
11 Hypothetical protein 217 100 12734 / 5. 63
Fig. 5 　 THA of isolate 200805 under freeze-
thaw cycles
Black and white columns represent THA values of freeze-thaw
treated and untreated samples, respectively. The bar above
the columns are standard error of three times repeats.
　 　 非原生质体作为连接细胞与外界环境的桥梁,
同时也是分泌性蛋白运输到体外的必经部位,因此
非原生质体蛋白在响应多种外界胁迫过程中扮演
重要作用[23]。 通过提取耐受性增强菌株的非原生
质体蛋白,并进行双向电泳分析,发现与低温诱导
前相比,诱导后的 200805 号菌株蛋白表达谱发生
了明显的变化。 选取了其中表达量发生显著变化
的 11 个蛋白点进行质谱分析,初步鉴定其中部分
为参与活性氧应答相关蛋白,如过氧化物酶蛋白、
超氧化物歧化酶蛋白;逆境胁迫可以使生物体活性
氧代谢失衡,从而导致活性氧的积累,对生物体造
成伤害。 在稻瘟菌 -水稻的互作过程中,水稻产生
的活性氧可以增强其细胞壁的韧度,调节细胞的程
序性死亡[24],还可以直接杀死菌丝细胞[25]。 因
而,激活相关酶系及时清除活性氧使其在逆境中生
存显得尤为重要。 此外还有与能量代谢及细胞程
序性死亡相关的腺苷酸激酶等,这些分泌性蛋白极
有可能在稻瘟菌适应逆境的保护机制中发挥重要
作用,目前对其中蛋白的功能及其后续的接种工作
正在进行,以期进一步在分子水平上探讨其致变机
制。
参考文献
[1] 　 Zhang G M, Ma J T, Xiao J L, et al. Evaluation and
utilization of value of twenty-four blast resistance genes
in north cold region, Heilongjiang ( in Chinese) [ J] .
Acta Phytopathologica Sinica(植物病理学报), 2011,
41(1): 72 -79.
[2] 　 Covert S F. Supernumerary chromosomes in filamen-
tous fungi [J] . Current Genetics, 1998, 33(5): 311
-319.
[3] 　 Talbot N J, Salch Y P, Ma M, et al. Karyotypic vari-
ation within clonal lineages of the rice blast fungus
Magnaporthe grisea [ J] . Applied and Environmental
Microbiology, 1993, 59(2): 585 -593.
[4] 　 Orbach M J. , Chumley F G, Valent B. Electrophore-
tic karyotypes of Magnaporthe grisea pathogens of di-
verse grasses [ J] . Molecular Plant-Microbe Interac-
tions, 1996, 9(4): 261 -271.
[5] 　 Dean R A, Talbot N J, Ebbole D J, et al. The ge-
nome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe
grisea [J] . Nature, 2005, 434(7036): 980 -986.
[6] 　 Ebbole D J. Magnaporthe as a model for understanding
562
　
植物病理学报 42 卷
host-pathogen interactions [ J ] . Annual Review of
Phytopathology, 2007, 45: 437 -456.
[7] 　 Xu J R, Peng Y L, Dickman M B, et al. The dawn of
fungal pathogen genomics [ J] . Annual Review of
Phytopathology, 2006, 44: 337 -366.
[8] 　 Shen Y, Li C Y, Yuan X P, et al. The phenomenon
of hyphal fusion in Magnaporthe grisea and the patho-
genicity of its progeny ( in Chinese) [J] . Scientia Ag-
ricultura Sinica(中国农业科学), 1997, 30(6): 16 -
22.
[9] 　 Wang Y L, Zhang Z G, Lu F, et al. Several biologi-
cal characteristics of asexual recombinants of Magna-
porthe grisea ( in Chinese) [ J] . Journal of Nanjing
Agricultural University(南京农业大学学报), 2003,
26(2): 33 -37.
[10] Bonman J M, Vergel de D, Bandong J M, et al.
Pathogenic variability of monoconidial isolates of
Pyricularia oryzae in Korea and in the Philipipines
[J] . Plant Disease, 1987, 71(2): 127 -130.
[11] Ou S H. Rice diseases [M] . UK: Commonwealth
Agricultural Bureaux, 1985.
[12] Zhang Y Q, Zhao M F, He Y Q. Review of induced
mutagenesis of Magnaporthe grisea ( in Chinese) [J] .
Journal of Yunnan Agricultural University(云南农业
大学学报), 2006, 21(1): 52 -56.
[13] Shen Y, Liang T C, Zhu P L, et al. Study of drug re-
sistance of Magnaporthe oryzae to tricyclazole ( in Chi-
nese) [J] . Agrochemicals(农药), 1995, 34(2): 9
-11.
[14] Zhang C Q, Zhou M G. Recovery and biological pro-
perties of nitrate nonutilizing mutants of Magnaporthe
grisea ( in Chinese) [J] . Chinese Journal of Rice Sci-
ence (中国水稻科学), 2004, 18(2): 156 -160.
[15] Wai C H, Criffith M, Pele C, et al. Extraction and i-
solation of antifreeze proteins from winter rye (Secale
cereale L. ) leaves [J] . Plant Physiology, 1994, 104
(3): 971 -980.
[16] Bradford M M. A rapid and sensitive method for the
quantitation of microgram quantities of protein utilizing
the principle of protein-dye binding [ J] . Analytical
Biochemistry, 1976, 72: 248 -254.
[17] Pudney P D, Buckley S L, Sidebottom C M, et al.
The physico-chemical characterization of a boiling sta-
ble antifreeze protein from a perennial grass ( Lolium
perenne) [ J] . Archieves of Biochemistry and Bio-
physics, 2003, 410(2): 238 -245.
[18] Liao X, Ying T Y, Wang H L, et al. A modified
method of in-gel digestion of Coomassie brilliant blue-
stained 2-D gels ( in Chinese) [J] . Letters in biotech-
nology(生物技术通讯), 2003, 14(6), 509 -511.
[19] Havlis J, Shevchenko A. Absolute quantification of
proteins in solutions and in polyacrylamide gels by
mass pectrometry [ J] . Analytical Chemistry, 2004,
76(11): 3029 -3036.
[20] Kapoor A S, and Singh B M. Overwintering of Pyricu-
laria oryzae in himachal pradesh [J] . Indian Phytopa-
thology, 1976, 30(2): 213 -216.
[21] Guy C L. Cold acclimation and freezing stress tole-
rance: role of protein metabolism [J] . Annual Review
of Plant Physiology and Plant Molecular Biology,
1990, 41: 187 -223.
[22] Wei P, Li Z, Lin Y, et al. Improvement of the multi-
ple-stress tolerance of an ethanologenic Saccharomyces
cerevisiae strain by freeze-thaw treatment [ J] . Bio-
technology Letters, 2007, 29(10): 1501 -1508.
[23] Nielsen K H, Schjoerring J K. Regulation of apoplas-
tic NH +4 concentration in leaves of oil seed rape [ J] .
Plant Physiology, 1998, 118(4): 1361 -1368.
[24] Bradley D J, Kjellbom, P. and Lamb, et al. Elicitor-
and wound-induced oxidative cross-linking of a proline-
rich plant cell wall structural protein: A novel, rapid
plant defense response [J] . Cell, 1992, 70(1): 21 -
30.
[25] Wojtaszek P. Oxidative burst: an early plant response
to pathogen infection [J] . Biochemical Journal, 1997,
322(Pt3): 681 -692.
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