全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４３(４): ４１８￣４２０(２０１３)
收稿日期: ２０１２￣０８￣２７ꎻ 修回日期: ２０１３￣０３￣１６
基金项目: 甘肃星火计划项目(１２０５ＮＣＸＪ２１９)
通讯作者: 魏周全ꎬ高级农艺师ꎬ主要从事植保大田开发与研究ꎻ Ｔｅｌ:０９３２￣８２１２２４３ꎬ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｗｅｉｚｈｏｕｑｕａｎ＠１２６. ｃｏｍ
马永强ꎬ助理研究员ꎬ主要从事植物病理学研究ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ:ｍａｙｏｎｇｑｉａｎｇ＿１６３＠１６３. ｃｏｍꎮ
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研究简报
甘肃省马铃薯黄萎病病原分离与鉴定
陈爱昌１ꎬ 魏周全１∗ꎬ 马永强２∗ꎬ 邓成贵１
( １定西市植保植检站ꎬ 定西 ７４３０００ꎻ ２ 甘肃省农业科学院植物保护研究所)
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｃａｕｓｉｎｇ Ｐｏｔａｔｏ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｗｉｌｔ ｉｎ
Ｇａｎｓｕ　 ＣＨＥＮ Ａｉ￣ｃｈａｎｇ１ꎬ ＷＥＩ Ｚｈｏｕ￣ｑｕａｎ１ꎬ ＭＡ Ｙｏｎｇ￣ｑｉａｎｇ２ꎬ ＤＥＮＧ Ｃｈｅｎｇ￣ｇｕｉ１ 　 ( １ Ｄｉｎｇｘｉ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃ￣
ｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｓｔａｔｉｏｎꎬ Ｄｉｎｇｘｉ ７４３０００ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ Ｇａｎｓｕ Ａｃａｄｅｍｙ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ
Ｌａｎｚｈｏｕ ７３００７０ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓꎬ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｃａｕｓｉｎｇ ｐｒｅｍａｔｕｒｅ
ｄｅａｔｈ ｏｆ ｐｏｔａｔｏ ｉｎ Ｄｉｎｇｘｉ Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｇａｎｓｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｗａｓ Ｖｅｒ￣
ｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ. Ｔｈｉｓ ｉｓ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｒｅｐｏｒｔ ｉｎ Ｇａｎｓｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｄｅａｔｈ ｏｆ ｐｏｔａｔｏꎻ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅꎻ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎ
文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１３)０４￣０４１８￣０３
　 　 马铃薯是重要的粮食作物ꎬ增产潜力大ꎬ对保
障我国的粮食安全具有重要的意义ꎮ 然而ꎬ由于连
作问题ꎬ各种病害日益突出ꎬ鉴定和认识新的病害
问题是其有效防控的基础ꎬ有助于马铃薯的可持续
生产ꎮ ２００９ ~ ２０１０ 年在甘肃省定西全市各县区马
铃薯病害的田间普查中ꎬ发现了能够造成马铃薯早
死的一种新病害ꎬ通过病菌分离和鉴定ꎬ确认了大
丽轮枝菌(Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ)侵染马铃薯是造成
马铃薯田间植株早死的主要原因ꎮ 本文首次报道
了甘肃马铃薯黄萎病害的发生ꎬ研究结果对系统调
查该病的发生情况以及病害防控具有重要的实践
意义ꎮ
１　 材料与方法
１. １　 标本来源及症状描述
标本来源于甘肃省定西市安定区高峰乡牌坊
村一露地田马铃薯早死病株ꎬ品种为陇薯 ３ 号ꎮ 通
过田间自然感病和人工接种发病植株进行症状
描述ꎮ
１. ２　 病原菌分离纯化及致病性测定
选取马铃薯萎蔫植株ꎬ在病健结合组织处切取
０. ５ ｃｍ小块ꎬ用 ７５％酒精表面消毒 ３ ｍｉｎꎬ无菌水
冲洗 ３ 次ꎬ置于 ＰＤＡ 培养基上 ２５℃培养ꎬ待长出
菌丝后ꎬ挑取菌落边缘进行纯化ꎬ纯化后的菌落再
进行单孢分离培养ꎮ 病原菌致病性测定根据柯赫
氏法则确定其病原性[１]ꎬ按每 １ ｋｇ 灭菌土壤接 １８
ｇ含有大量分生孢子的培养基ꎬ混匀、装入直径 １５
ｃｍ的花盆中备用ꎬ以陇薯 ３ 号为接种植株ꎬ每盆种
植一株ꎬ重复 ４ 次ꎬ并设未接菌种的灭菌土壤作对
照ꎬ对植物生长情况详细记载ꎬ待植株发病后对病
原菌进行再分离ꎮ
１. ３　 形态学鉴定
观察病原菌在 ＰＤＡ 平板上的菌落特征、产孢
　
　 ４ 期 　 　 陈爱昌ꎬ等:甘肃省马铃薯黄萎病病原分离与鉴定
情况ꎬ并对有无微菌核产生及分生孢子梗长、分生
孢子长宽进行显微测量ꎮ
１. ４　 分子生物学鉴定
病原菌的分子生物学鉴定委托上海基康生物
技术有限公司完成ꎮ
１. ４. １ 　 ＤＮＡ 提取 　 病原菌 ＤＮＡ 提取采用 Ｙｉ
等[２]的方法ꎮ
１. ４. ２　 ｒＤＮＡ ２８Ｓ区的扩增及测序　 采用真菌核
糖体基因 ２８Ｓ 区域引物 Ｄ１(５′￣ＧＣＡＴＡＴＣＡＡＴＡ￣
ＡＧＣＧＧＡＧＧＡＡＡＡＧ￣３′)和 Ｄ２(５′￣ＧＧＴＣＣＧＴＧＴ￣
ＴＴＣＡＡＧＡＣＧＧ￣３′)扩增 ２８Ｓ ｒＤＮＡꎮ 反应在 ２０
μＬ体系中进行ꎬ体系含有 Ｓｕｐｅｒ Ｔａｑ ＭＩＸ ２∗１０
μＬꎬｐｒｉｍｅｒ Ｆ １ μＬꎬ ｐｒｉｍｅｒ Ｒ １ μＬꎬＤＮＡ 模板 １
μＬꎬｄｄＨ２Ｏ ７ μＬꎮ 反应程序为:９４℃预变性 ２ ｍｉｎꎬ
进入循环ꎬ９４℃变性 ２０ ｓꎬ５０℃退火 １０ ｓꎬ７２℃复性
３０ ｓꎬ３５ 个循环ꎬ最后 ７２℃延伸 ２ ｍｉｎꎬ４℃保存ꎮ
取 ５ μＬ反应产物于 １％琼脂糖凝电泳鉴定ꎬ在紫
外投射仪下检测 ＰＣＲ 产物大小ꎬＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ
２ ０００ꎮ 用北京博大泰克生物工程有限公司的 ＰＣＲ
产物纯化试剂盒ꎻ扩增产物上样 ＡＢＩ３７３０ＤＮＡ 测
序仪检测ꎬ采用双脱氧测序法ꎬ测序引物为 Ｄ１ /
Ｄ２ꎬ进行双向测序ꎮ
１. ４. ３　 ｒＤＮＡ序列比较分析　 使用 ＢｉｏＥｄｉｔ校对
测序结果并拼接序列ꎮ 测序后的序列经校正后ꎬ
在核酸序列数据库 ＧｅｎＢａｎｋ( ｈｔｔｐ: / / ｂｌａｓｔ. ｎｃｂｉ.
ｎｌｍ. ｎｉｈ. ｇｏｖ / )中进行同源序列搜索ꎬ比较测试菌
株与出现在数据库中相应序列的相似程度ꎮ
２　 结果与分析
２. １　 病害症状
苗期发病初期由叶尖沿叶缘变黄ꎬ从叶脉向内
黄化衰弱ꎬ后由黄变褐干枯ꎬ但不卷曲ꎬ直到全部叶
片提早枯死ꎬ不脱落ꎮ 成株期发病ꎬ植株一侧叶片
或全部叶片逐渐萎蔫ꎬ引起植株凋萎ꎮ 感病植株剖
开茎秆维管束变褐ꎬ形成纵向的变色条带ꎮ 块茎染
病始于脐部ꎬ维管束变浅褐色至褐色ꎬ纵切病薯维
管束变褐色(图 １)ꎮ
２. ２　 致病性测定
接菌植株表现出与自然病株相同的症状ꎬ未接
菌植株表现正常ꎮ 从回接发病马铃薯植株上分离
得到与接种菌株 １００％相同的病原菌ꎮ
２. ３　 形态学鉴定
在 ＰＤＡ培养基上菌落近圆形ꎬ边缘光滑ꎬ中心
微突起ꎬ有明显黑色或灰黑色交替的同心轮纹ꎮ 分
生孢子梗直立ꎬ分枝ꎬ初次分枝两出、三出或互生ꎬ
二次分枝轮生ꎬ顶层小梗下部膨大而尖端细削ꎬ直
径为 ２ ~ ４ μｍꎮ 分生孢子单生ꎬ单孢ꎬ球形、椭圆
形、卵形或梭形ꎬ无色或略带褐色ꎬ大小为(３. ０ ~
５􀆰 ５) μｍ × (１. ５ ~ ２. ０) μｍꎬ平均 ４. ２５ μｍ × １. ５
μｍꎮ 在 ＰＤＡ 培养基上约 １０ ｄꎬ产生直径 ３０ ~ ６０
μｍ的微菌核(图 １)ꎮ
２. ４　 分子生物学鉴定
使用真菌 ２８Ｓ区域的引物 Ｄ１ 和 Ｄ２ 扩增出了
大小为 １ ０００ ｂｐ的片段ꎮ 将扩增产物测序所得序
列与 ＧｅｎＢａｎｋ 中核酸数据进行 Ｂｌａｓｔ分析ꎬ该序列
与已报道的 Ｖ . ｄａｈｌｉａｅ 序列同源性最高ꎬ相似性达
９９％ ꎮ
３　 结论与讨论
由大丽轮枝菌(Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ)引起的马铃薯黄
萎病是马铃薯生产上的一种毁灭性病害ꎬ可以侵染
马铃薯的各个生长部位ꎬ尤其对生长期地下主茎危
害严重ꎬ引起马铃薯早死ꎮ 该病原菌所形成的微菌
核在土壤中能长期存活ꎬ同时还具有广泛的寄主范
围ꎬ可侵染棉花、马铃薯、茄子等茄科植物ꎬ从而造
成该病防治上的困难[３]ꎮ 根据 ２０１１ 年生长期调
查ꎬ定西市安定区高峰乡露地马铃薯陇薯 ３ 号植株
开花期(８ 月上旬)开始发病枯死ꎬ比正常植株提前
枯死 ２ 个多月ꎬ经测产减产达 ５０％以上ꎮ 国内对
该病的研究较少ꎬＷａｎｇ 等[４]报道了马铃薯黄萎病
是新疆马铃薯上新发现的 ５ 种新病害之一ꎻＣｈｅｎ
等[５]采用木霉生防菌 １５０ 对马铃薯黄萎病进行了
防治效果试验ꎻ２００４ 年 Ｚｈａｎｇ[６]对马铃薯黄萎病
的发生与防治进行了相关报道ꎮ
本研究通过形态学和分子生物学鉴定ꎬ确定马
铃薯田间早死病株由大丽轮枝菌(Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ)引
起ꎬ有关该病害在甘肃的发生流行规律、侵染循环
９１４
　
植物病理学报 ４３ 卷
Ｆｉｇ. １　 Ｔｈｅ ｐｉｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｐｏｔａｔｏ ｏｆ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｗｉｌｔ ｉｎ ｆｉｅｌｄ ａｎｄ ｉｎｄｏｏｒ
Ａ: Ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｉｎ ｆｉｅｌｄꎻ Ｂ: Ｄｉｓｃｏｌｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｉｎ ｓｔｅｍꎻ Ｃ: Ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｉｎ ｐｏｔａｔｏꎻ Ｄ: Ｃｏｌｏｎｙ ｏｎ ＰＤＡꎻ
Ｅ: Ｍｉｃｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉａ ｏｆ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａꎻ Ｆ: Ｃｏｎｉｄｉｏｐｈｏｒｅ ａｎｄ ｃｏｎｉｄｉａ(Ｂａｒ:５０ μｍ) .
以及防治措施等需进一步研究ꎮ
参考文献
[１] 　 Ｆａｎｇ Ｚ Ｄ. Ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｍｅｔｈｏｄｓ (３ ｔｈｅｄ. )
( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [Ｍ] . Ｂｅｉｉｎｇ: Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｅｓｓ
(北京:中国农业出版社)ꎬ １９８８.
[２] 　 Ｙｉ Ｒ Ｈꎬ Ｚｈｕ Ｘ Ｒꎬ Ｚｈｏｕ Ｅ Ｘ. ＤＮＡ ｏｆ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ
ｆｕｎｇｉ ｗａｓ ａｂｓｔｒａｃｔｅｄ ｑｕｉｃｋｌｙ ａｎｄ ｍｕｎｉｔｅｌｙ ｂｙ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ
ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｈｅｊｉａｎｇ
Ｏｃｅａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ (青岛海洋大学学报)ꎬ ２００３ꎬ ２３
(６): ７２ －７３.
[３] 　 Ｐｅｇｇ Ｇ Ｆꎬ Ｂｒａｄｙ Ｂ Ｌ. Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｗｉｌｔｓ[Ｍ] . Ｗａｌｌ￣
ｉｎｇｆｏｒｄＯｘｏｎꎬ ＵＫ: ＣＡＢＩ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇꎬ ２００２.
[４] 　 Ｗａｎｇ Ｌ Ｌꎬ Ｒｉｚｉｗａｎｇｇｕｌｉ􀅰Ｓ. Ｋｉｎｄｓ ａｎｄ ｆｉｖｅ ｎｅｗ ｒｅ￣
ｃｏｒｄｓ ｏｆ ｆｕｎｇｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｏｆ ｐｏｔａｔｏ ｉｎ Ｕｒｕｍｑｉ ａｎｄ Ｃｈａｎｇｊｉ
ａｒｅａ ｉｎ Ｘｉｎｊｉａｎｇ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ)[Ｊ] . Ｘｉｎｊｉａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒ￣
ａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ(新疆农业科学)ꎬ ２０１１ꎬ ４８ (２): ２６６ －
２７０.
[５] 　 Ｃｈｅｎ Ｘ Ｊꎬ Ｗｕ Ｓ Ｏꎬ Ｈｅ Ｈ Ｙꎬ ｅｔ ａｌ. ＣｏｎｔｒｏＩ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ ｏｎ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ ｏｆ Ｐｏ￣
ｔａｔｏ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] . Ｇｕｉｚｈｏｕ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
(贵州农业科学)２０１０ꎬ ３８(１２): １００ －１０２.
[６] 　 Ｚｈａｎｇ Ｃ Ｌ. Ｔｈｅ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｏｔａｔｏ ｗｉｌｔ
( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ)[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ ｄｏｃｔｏｒ(植物医生)ꎬ ２００４ꎬ １７
(５): ６.
责任编辑:曾晓葳
０２４