全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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$
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.
,/001,#"""*+"!$,!"#$,"&,#"(
收稿日期$
!"#+*#!*!&
&修改稿收到日期$
!"#$*"$*#"
基金项目$河北省教育厅重点项目"
23!"#!"+(
#&河北省自然科学基金"
4!"#+!"+"-+
#
作者简介$田
!
真"
#(()
#!女!在读硕士研究生!主要从事设施园艺与无土栽培的研究
5*67/8
$
9
/1
:
;/?7/
!
#&%,@A6
"
通信作者$高洪波!教授!硕士生导师!主要从事设施蔬菜和无土栽培的教学和研究工作
5*67/8
$
?A1
:
BA
:
7A
!
?=B7C,=;C,@1
生菜硝酸还原酶基因的克隆及高氮水平下外源
!
$
氨基丁酸对其表达和叶片硝酸盐含量的影响
田
!
真!李敬蕊!王
!
祥!吴晓蕾!宫彬彬!高洪波"
"河北农业大学 园艺学院!河北保定
"-#""#
#
摘
!
要$硝酸还原酶"
DE
#是硝酸盐代谢的关键酶该研究在成功克隆生菜
!"
基因的同时!进行了高氮水平下外
源
"
*
氨基丁酸"
FGHG
#对生菜叶片
!"
基因表达和
DI
%
)
*D
含量的研究结果表明$"
#
#生菜
!"
基因"
F=1H71J
登录号为
KL#!!!"-
#序列长
#-#B
9
!编码
$($
个氨基酸残基!蛋白保守结构域含钼辅蛋白超家族(细胞色素
B$
超
家族和
MDE
超家族&生菜
!"
基因与菊苣
!"
基因亲缘关系最近!序列一致性为
%N
!与烟草(甜菜(黄瓜(大豆等
DE
序列的一致性均在
("N
以上"
!
#高氮水平下外源
!,$66A8
%
OFGHG
处理生菜可诱导
!"
基因上调表达!并
显著提高了生菜叶片
DE
(亚硝酸还原酶"
D/E
#(谷氨酸脱羧酶"
FGP
#活性和
D3
+
Q
*D
含量!降低了
DI
%
)
*D
(
DI
!
)
*D
含量&虽然
DI
%
)
*D
含量与
DE
(
FGP
(
D/E
活性(
DI
!
)
*D
(
D3
+
Q
*D
含量均呈显著相关关系!但与
DE
活
性的相关系数最高且达极显著水平研究认为!高氮水平下外源
FGHG
可通过诱导
!"
基因上调表达(增强相关
酶活性来影响无机氮代谢!从而降低了生菜叶片硝酸盐含量!其中
DE
在该过程中发挥着至关重要的作用!为生产
中
FGHG
的施用及降低叶菜类蔬菜硝酸盐含量提供了理论依据
关键词$
"
*
氨基丁酸"
FGHG
#&高氮水平&生菜&基因克隆&硝酸盐含量
中图分类号$
R-(
&
R+$,-
文献标志码$
G
%&"#
(
")*#+,-+./.!01+-2.3..")4.++01.-!5)).1+")56"
(
."02
!
789#":0+
;
,#181#!"3..56
<
,.22#"-!*#+,-+.
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(
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(
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STGD2?=1
!
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:
VC/
!
WGDFX/71
:
!
WYX/7A8=/
!
FIDFH/1B/1
!
FGI3A1
:
BA
"
"
4A8=
:
=AZ3AV[/@C8[CV=
!
G
:
V/@C8[CV78Y1/>=V0/[
AZ3=B=/
!
H7A;/1
:
!
3=B=/"-#""#
!
4?/17
#
8:2+,-1+
$
D/[V7[=V=;C@[70=
"
DE
#
/0[?=J=
=1]
6=AZ1/[V7[=6=[7BA8/06,S?/0
9
7
9
=V0C@@=00ZC8
@8A1=;
[?=
:
=1=AZ!"/18=[[C@=71;/1>=0[/
:
7[=;[?==ZZ=@[AZ=:
=1AC0
"
*76/1ABC[
V/@7@/;
"
FGHG
#
A1[?==<*
9
V=00/A1AZ!"
:
=1=71;DI
%
)
*D@A1[=1[C1;=V?/
:
?1/[VA
:
=18=>=8/18=7>=0AZ8=[[C@=@C8[CV=; /^[??
*
;VA
9
A1/@0@C8[CV=7[[?=076=[/6=,S?=V=0C8[0?A^ =;[?7[
$"
#
#
[?=!"
:
=1=
"
[?=7@@=00/A1DI,AZF=1B71J
/0KL#!!!"-
#
0=
_
C=1@=AZ8=[[C@= 7^0#-#B
9
[?7[=1@A;/1
:
$($76/1A7@/;V=0/;C=0
!
71;@A1[7/1=;[?=
A`@A0C
9
=VZ76/8
!
4
[*B$0C
9
=VZ76/8
71;MDE0C
9
=VZ76/8
\9
VA[=/1;A67/10,S?=!"
:
=1=0=
_
C=1@=AZ8=[*
[C@=?7;@8A0=
:
=1=[/@V=87[/A10?/
9
/^[?4/@?AV/C6/1[
BC0
"
%N@A10/0[=1@
#
71;?7;V=87[/>=@8A0=
:
=1=[/@
V=87[/A10?/
9
/^[?[AB7@@A
!
0C
:
7VB==[0
!
@C@C6B=V71;0A
B=710
"
6AV=[?71("N@A10/0[=1@
#
,
"
!
#
S?==:
*
=1AC0!,$66A8
%
OFGHG/1;C@=;767VJ=;/1@V=70=/1!"
:
=1==<
9
V=00/A1,` =71^ ?/8=
!
0/
:
1/Z/@71[8
/1*
@V=70=;[?=7@[/>/[/=0AZDE
!
1/[V/[=V=;C@[70=
"
D/E
#!
:
8C[767[=;=@7VBA<
870=
"
FGP
#
71;[?=@A1[=1[AZ
D3
+
Q
*D/18=[[C@=8=7>=0C1;=V?/
:
?1/[VA
:
=18=>=8AZ1C[V/=1[0A8C[/A1
!
BC[V=;C@=;[?=@A1[=1[0AZDI
%
)
*
D71;DI
!
)
*D,S?=@A1[=1[AZDI
%
)
*D?7;0/
:
1/Z/@71[@AVV=87[/A1 /^[?[?=7@[/>/[/=0AZDE
!
D/E
!
FGP
71;[?=@A1[=1[0AZDI
!
)
*D
!
D3
+
Q
*D
!
BC[[?=@AVV=87[/A1@A=ZZ/@/=1[ 7^0[?=?/
:
?=0[B=[^==1DI
%
)
*D71;
DE ?^/@?V=7@?/1
:
=<[V=6=8
0/
:
1/Z/@71[1=
:
7[/>=@AVV=87[/A1,S?=0[C;
0C
::
=0[=;[?7[
!
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=1AC0FGHG
@AC8;7ZZ=@[/1AV
:
71/@1/[VA
:
=16=[7BA8/0671;V=;C@=[?=1/[V7[=@A1[=1[/18=[[C@=8=7>=0B
/1;C@/1
:
!"
:
=1=C
9
*V=
:
C87[=;=<
9
V=00/A171;=1?71@/1
:
=1]
6=7@[/>/[/=0C1;=V?/
:
?1/[VA
:
=18=>=8,50
9
=@/78
[?=DE
9
87
=;7J=
VA8=/1[?=
9
VA@=00
!
?^/@?
9
VA>/;=;7[?=AV=[/@78B70/0ZAV[?=7
99
8/@7[/A1AZFGHG71;V=;C@*
/1
:
[?=1/[V7[=@A1[=1[/18=7Z
>=
:
=[7B8=0,
@.
;
A",!2
$
"
*76/1ABC[
V/@7@/;
"
FGHG
#&
?/
:
?1/[VA
:
=18=>=8
&
8=[[C@=
&
:
=1=@8A1=
&
1/[V7[=@A1[=1[
!!
近年来!设施蔬菜发展迅速!但在蔬菜生产中一
部分菜农为追求经济效益常滥施化肥!特别是单一
大量施用氮肥!导致蔬菜体内硝酸盐含量超标的现
象较严重许多学者提出了降低蔬菜硝酸盐含量的
方法!如合理施用氮肥(改善蔬菜生长环境(选择合
适的采收期(采用适宜贮藏加工及食用处理方法等!
但是这些方法的实施受外界环境因素的影响较大!
从而效果不稳定)#*硝酸还原酶"
V/[V7[=V=;C@[70=
!
DE
#作为催化硝酸盐同化反应的限速酶!是影响蔬
菜硝酸盐累积的主要内源因子!在氮素代谢中占有
重要地位)!*研究证明通过提高
DE
活性有利于蔬
菜硝酸盐的降解)%*!但不同蔬菜体内
DE
活性存在
很大差异!通过外源物质调控的方法稳定提高
DE
活性对降低蔬菜体内硝酸盐积累具有重要作用)+*
"
*
氨基丁酸"
"
*76/1ABC[
V/@7@/;
!
FGHG
#是一
种四碳非蛋白质氨基酸!广泛存在于动植物体内!有
缓解高血压(提高免疫力(改善睡眠等的作用外源
FGHG
可被植物根系和叶片吸收!作为氨基酸态氮
参与植物一系列生理代谢反应!在促进植株生长发
育(提高抗逆性等方面具有重要作用)$*&*近年来!
关于
FGHG
对植物硝酸盐含量的影响受到关注!研
究证明外源
"
*
氨基丁酸可调节拟南芥幼苗硝酸盐
的吸收和利用)-*!可作为甘蓝型油菜硝酸盐吸收上
调的长途信号)(*!但在高氮水平下
FGHG
降低蔬菜
硝酸盐含量的作用和机理研究较少生菜作为一种
重要的叶菜类蔬菜!极易富集硝酸盐!而实际生产中
设施土壤氮素水平超标现象日趋严重!为此从克隆
生菜
!"
基因入手!探求高氮水平下外源
FGHG
降
低生菜叶片硝酸盐含量的作用机理!旨在寻求降低
生菜硝酸盐含量(提高产品品质的有效措施
#
!
材料和方法
B,B
!
材
!
料
试验生菜品种为+大速生,!种子由中国农业科
学院蔬菜花卉研究所提供种子经
$$a
温水浸种
后!播于装有石英砂的塑料盆中育苗!温室昼温
!-
#
%"a
!夜温
#&
#
#(a
子叶展开后!用
#
%
!
倍的
3A7
:
871;
营养液浇苗幼苗长有
+
片真叶时!选整
齐一致的健壮幼苗定植到装有
#
倍
3A7
:
871;
营养
液)
9
3
"
&,%b",#
#!
54
"
!,"
#
#,!
#*的盆中水培!气
泵正常通气待幼苗长出第
&
片叶子时!将幼苗分
成
!
组并分别进行下列处理"
#
#
D7DI
%
处理
"
4K
#$在
3A7
:
871;
营 养 液 "含 有
#+ 66A8
%
O
DI
%
)
#中添加
#(66A8
%
OD7DI
%
!使得营养液中
DI
%
)浓度达到
%!66A8
%
O
"此浓度接近设施土壤
硝态氮浓度#&"
!
#
D7DI
%
Q!,$66A8
%
OFGHG
处
理"
!,$FGHG
#$
3A7
:
871;
营养液中同时添加
#(
66A8
%
OD7DI
%
和
!,$66A8
%
OFGHG

D7DI
%
和
FGHG
的浓度均为前期试验筛选出的最佳浓
度)*在处理
"
(
%
(
&;
取生菜叶片!用液氮速冻后
存放到
)("a
超低温冰箱内!用于硝酸还原酶基因
的克隆和表达分析&并在处理
"
(
%
(
&
(

(
#!;
后取生
菜叶片!测定硝酸盐代谢中主要产物含量和相关酶
活性试验重复
%
次
B,C
!
方
!
法
BDCDB
!
生菜总
/*8
提取及
1E*8
合成
!
分别称取
不同处理冷冻的生菜叶片
",#
:
!液氮研磨采用塞
勒生物
5Gcd5X
植物
EDG
快速提取试剂盒提取
总
EDG
!通过
S?=V6Ac@/=1[/Z/@D71APVA
9
!"""
%
!"""4
和琼脂糖凝胶电泳检测其浓度和纯度按照
SGKGEGLV/6=Vc@V/
9
[
S`
ES 7`0[=V /`<
反转录
试剂盒合成
@PDG
第一链
BDCDC
!
生菜
12
基因的克隆和表达
!
生菜
!"
基
因序列尚未见报道!本试验以同为菊科的菊苣
!"
基因组
PDG
序列"
F=1H71J
登录号为
X(+#"%,#
#
为依据!运用
LV/6=VLV=6/=V$,"
软件设计特异引
物
DE*0
"
$e*4GGGSG4FFFG44GF4GSGG*%e
#
和
DE*7
"
$e*SSFF4GG4GG4GSG44GSG44S*
"#
&
期
!!!!
田
!
真!等$外施
"
*
氨基丁酸对高氮水平下生菜叶片硝酸还原酶基因表达和硝酸盐含量的影响
%e
#
L4E
反应体系为$
@PDG#,!$
$
O
(
;DSL
"
!,$
66A8
-
O
)#
#
+,"
$
O
(上下游引物"
#"
$
6A8
-
O
)#
#
各
",$
$
O
(
HCZZ=V
"
#"f
#
!,$
$
O
(
#$
%
酶
",!$
$
O
和
;;3
!
I#&
$
O
反应程序为
+a
预变性
!6/1
&
+
a
变性
%"0
!
$%a
退火
%"0
!
-!a
延伸
!6/1
!
+"
个
循环&
-!a
延伸
#"6/1
&
+a
保温克隆获得的产
物切胶回收!与
9
`P#*S
载体连接后转化大肠杆
菌
P3$
%
!在含有氨苄青霉素抗性的固体
OH
培养基
上
%-a
过夜培养!挑取单菌落!在氨苄青霉素抗性
的液体
OH
培养基中
%-a
摇菌
%?
!经菌液
L4E
验
证后送生工生物工程"上海#股份有限公司测序
另外!就不同处理生菜叶片
@PDG
"通过
S?=V*
6Ac@/=1[/Z/@D71APVA
9
!"""
%
!"""4
仪器检测并调
节为一致的浓度#!分别用上述所设计引物进行
L4E
扩增!后经
!N
琼脂糖凝胶电泳检测!以此来分
析生菜叶片
!"
基因的表达量
B,C,F
!
生物信息学分析
!
序列比对采用
D4HT
H870[
&利用
5LVA[L7V76
对
!"
基因编码蛋
白理化性质进行预测&采用
D4HT4PP
数据库"
?[*
[
9
$%%
^^ ^,=B/,7@,CJ
%
SAA80
%
9
Z7
%
/
9
V0@71
%#预测蛋
白保守结构域&多序列比对用
PDG`GD
软件!并
用
`5FG+
软件构建系统进化树
B,C,G
!
硝酸盐代谢过程中主要产物含量和相关酶
活性的测定及其相关性分析
!
硝态氮"
DI
%
)
*D
#(
铵态氮"
D3
+
Q
*D
#含量的测定参照吕伟仙)#"*的方
法&亚硝态氮"
DI
!
)
*D
#含量采用盐酸萘乙二胺比
色法测定&硝酸还原酶"
V/[V7[=V=;C@[70=
!
DE
#和亚
硝酸还原酶"
1/[V/[=V=;C@[70=
!
D/E
#活性的测定分
别参照
MA
=V
等)##*和
S7J7?70?/
等)#!*的方法&谷氨
酸脱羧酶"
:
8C[767[=;=@7VBA<
870=
!
FGP
#活性采
用
FGHG
比色定量法)#%*测定采用
5<@=8
软件处
理数据和作图!
cGc(,#
软件
PC1@71
多重比较法
进行方差分析同时!利用
cLcc#-,"
软件的
L=7V*
0A1
相关系数法对硝酸盐代谢过程中的
DI
%
)
*D
(
DI
!
)
*D
(
D3
+
Q
*D
含量与相关酶
DE
(
D/E
(
FGP
活性进行相关性分析
!
!
结果与分析
CDB
!
生菜
12
基因的克隆和表达
L4E
扩增产物经
!N
琼脂糖凝胶电泳检测!在
#"""
#
!"""B
9
之间出现预期条带"图
#
#!测序结
果良好!均为单峰经
D4HTH870[
比对!与菊苣
"
&()*+,-./
0
1,2
!
F=1H71J
登录号为
L+%#"#,#
#
!"
基因序列一致性为
%N
!初步证明获得的序列
为生菜
!"
基因"
F=1H71J
登录号为
KL#!!!"-
#!
可用于后续序列分析
将不同处理生菜叶片的
@PDG
进行
L4E
扩
增!经
!N
琼脂糖凝胶电泳检测!电泳条带的亮度表
示基因的表达量结果显示!在处理
%
(
&;
时!
,$
66A8
%
OFGHG
处理的生菜叶片
!"
基因的表达量
均高于对照处理"图
!
#!表明
!,$66A8
%
OFGHG
处理提高了生菜叶片
!"
基因的表达量
C,C
!
生物信息学分析
测序结果分析表明!生菜叶片
!"
基因序列长
#-#B
9
"图
#
#!该基因编码的氨基酸残基长度为
$($

LVA[L7V76
预测结果显示该序列编码的蛋白
由
!"
种氨基酸组成!分子量为
&&JP
!理论等电点
为
&,#$
!酸性氨基酸残基总数"
G0
9
QF8C
#为
-!
!碱
性氨基酸残基总数"
GV
:
QO
0
#为
&%

同时!
D4HT4PP
数据库对生菜
!"
基因结构
域的预测结果显示"图
%
#!生菜
!"
基因含有钼辅
蛋白超家族"
#
#
!#%
#!其在硝酸盐还原为亚硝酸盐
的过程中发挥着重要作用另外还包含细胞色素
图
#
!
生菜叶片
!"
基因的扩增结果
`,PO!"""
&
#,
生菜叶片
!"
基因扩增结果
M/
:
,#
!
!"
:
=1=76
9
8/Z/@7[/A1
9
VA;C@[0/18=[[C@=8=7>=0
`,PO!"""
&
#,DE
:
=1=76
9
8/Z/@7[/A1
9
VA;C@[0/18=[[C@=8=7>=0
图
!
!
FGHG
处理后高氮水平下生菜叶片
!"
基因的表达结果
`,PO!"""
&
#
#
$
分别表示
";
的
4K
处理(
%;
的
4K
和
!,$FGHG
处理(
&;
的
4K
和
!,$FGHG
处理的生菜叶片
!"
基因表达量
M/
:
,!
!
5<
9
V=00/A1V=0C8[AZ!"
:
=1=7Z[=V[?=[V=7[6=1[
AZFGHGC1;=V?/
:
?1/[VA
:
=18=>=8/18=[[C@=8=7>=0
`,PO!"""
&
#)$0[71;ZAV[?==<
9
V=00/A1AZ
DE
:
=1=/18=[[C@=8=7>=07[";
"
4K
#!
%;
"
4K71;
!,$FGHG
#!
&;
"
4K71;!,$FGHG
#
""##
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
B$
超家族"
!-#
#
%$#
#和
MDE
超家族"
%&
#
$($
#!
且含有
MGP
和
DGP3
结构域的
MDE
超家族!是
众多还原酶类所共有的保守结构
另外!氨基酸序列比对发现!生菜
!"
基因编码
的氨基酸序列与菊苣"
&()*+,-./
0
1,2
#(可可
"
#)3*1+*-$($($*
#(烟草"
!(*/$.$/$1$(,-
#(蓖
麻"
"(.,2(*--,.2
#(甜菜"
43/$5,6
7
$+2
#(黄瓜
"
&,(,-22$/5,2
#(苜蓿"
839($
7
*/+,.($/,6$
#(拟
南芥"
:+$19*
;
22/)$6$.$
#(大豆"
<6
0
(.3-$=
#

个物种中的同源基因编码的氨基酸序列具有很高的
相似性!均含有
%
个保守结构域"图
+
!
G
#
4
为
%
个
保守结构域#系统进化树进一步分析表明!生菜
!"
基因编码的氨基酸序列与菊苣亲缘关系最近!
序列一致性高达
%N
&而且其与烟草(可可(蓖麻(
甜菜(黄瓜(苜蓿(拟南芥(大豆的序列一致性也在
("N
以上"图
$
#
CDF
!
外源
38H8
对生菜叶片硝酸盐代谢过程中主
要产物含量和相关酶活性的影响
图
&
!
G
显示!随处理时间的延长!
,$66A8
%
O
FGHG
处理的生菜叶片的
DE
活性呈先升高后降
低的变化趋势!而对照叶片的
DE
活性基本保持稳
定!且在处理
%
(
&
(
;
时
!,$66A8
%
OFGHG
处理
分别比同期对照显著提高
!#,(N
(
!!,!N
(
!",#N
"
>
#
","$
#&同期两种处理的生菜叶片
DI
%
)
*D
含
量呈相似的变化趋势!但是
!,$66A8
%
OFGHG
处
理的生菜叶片
DI
%
)
*D
含量在整个培养过程中均
显著低于对照处理!如在处理
;
时比对照降低
!&,
#N
"图
&
!
H
#
同时!
,$66A8
%
OFGHG
处理和对照的生菜
叶片
D/E
活性也呈先升高后降低的趋势!且
!,$
66A8
%
OFGHG
处理在整个培养过程中均显著高于
同期对照处理!并在处理
&;
时达最大!此时比对照
显著提高
!#,#N
"图
&
!
4
#&
!,$66A8
%
OFGHG
处
理下的生菜叶片
DI
!
)
*D
含量在处理时间为
%
(
#!
;
时却显著低于对照处理"图
&
!
P
#
另外!两种处理的生菜叶片
D3
+
Q
*D
含量和
FGP
活性均呈先升高后降低的趋势!均在处理
&;
时达最大值!并在整个处理过程中
!,$66A8
%
O
FGHG
处理均高于对照处理且除处理
#!;
时的
FGP
活性外!两处理间的差异均达显著水平其
中!
,$66A8
%
OFGHG
处理的生菜叶片
D3
+
Q
*D
含量在处理
&;
时约为对照的
#,$
倍!而其相应的
FGP
活性约为对照的
#,!
倍"图
&
!
5
(
M
#
此外!硝酸盐代谢过程中主要产物含量及相关
图
%
!
DE
蛋白保守结构域
M/
:
,%
!
DE@A10=V>7[/>=
9
VA[=/1;A67/10
图
$
!
不同植物
DE
氨基酸系统进化树分析
分支上数值为
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次重复
HAA[0[V7
9
值
M/
:
,$
!
L?
8A
:
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_
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9
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9
8/@7[=0
#"##
&
期
!!!!
田
!
真!等$外施
"
*
氨基丁酸对高氮水平下生菜叶片硝酸还原酶基因表达和硝酸盐含量的影响
图
+
!
不同植物
!"
基因编码氨基酸序列比对图
G
(
H
(
4
表示
!"
基因蛋白保守结构域
M/
:
,+
!
G8/
:
16=1[AZ76/1A7@/;0=
_
C=1@=0AZ=1@A;=B
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:
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9
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报
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卷
图
&
!
外源
FGHG
对高氮水平下生菜叶片
DI
%
)
*D
(
DI
!
)
*D
(
D3
+
Q
*D
含量及
DE
(
D/E
(
FGP
活性的影响
不同小写字母表示同一时间对照与处理间差异达
","$
水平
M/
:
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""
表示
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水平差异极显著&
"
表示
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水平差异显著
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:
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:
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酶活性相关分析结果"表
#
#显示!高氮水平下生菜
叶片
DE
活性(
D/E
活性(
FGP
活性(
DI
%
)
*D
含
量(
DI
!
)
*D
含量(
D3
+
Q
*D
含量两两之间均呈显著
相关关系其中!
DI
%
)
*D
含量与
DE
活性(
FGP
活性呈极显著负相关关系!与
D/E
活性(
D3
+
Q
*D
含量呈显著负相关关系!而与
DI
!
)
*D
含量的正相
关性也达极显著水平表明生菜叶片中
DE
(
FGP
(
D/E
活性与其
DI
%
)
*D
含量关系密切
%
!
讨
!
论
硝酸盐污染是影响设施蔬菜品质的重要因素之
一!对人们的健康构成了潜在的威胁
DE
在植物
氮素代谢中起着关键作用!研究表明
DE
重组基因
1/7
的表达降低了生菜中硝酸盐的含量)#+*!将烟草
!"
基因与
47` g%$c
启动子的融合基因导入到马
铃薯中并在其中表达!马铃薯块茎中的硝酸盐含量
显著下降)#$*利用基因工程的手段提高叶菜类蔬
菜
!"
基因的含量!以此来降低叶菜类蔬菜的硝酸
盐含量越来越受到人们的关注!研究
!"
基因的克
隆和表达具有重要的意义目前已有针对不结球白
菜(黄瓜(菜豆等蔬菜的
!"
基因的克隆和表达展开
研究)#&*#(*!然而高氮水平下外源
FGHG
对生菜
!"
%"##
&
期
!!!!
田
!
真!等$外施
"
*
氨基丁酸对高氮水平下生菜叶片硝酸还原酶基因表达和硝酸盐含量的影响
基因表达情况的研究较少本试验成功克隆到一段
长为
#-#B
9
的生菜
!"
基因序列!其编码蛋白由
$($
个氨基酸残基组成&蛋白保守结构域包括
%
个
DE
家族基因的保守结构$钼辅蛋白超家族(细胞色
素
B$
超家族及
MDE
超家族)#&*!与不同物种
!"
基
因氨基酸序列比对具有很高的相似性!表明
!"
基
因在进化上具有很强的保守性同时!高氮水平下
外源添加
FGHG
使生菜叶片
!"
基因的表达量升
高!说明外源
FGHG
有诱导
!"
基因表达的作用!
对降低生菜硝酸盐含量有重要作用
氨基酸作为硝态氮的还原产物!对氮代谢具有
反馈调节作用!当植株生长环境中有氨基酸态氮存
在时!就不会吸收硝态氮!以此来降低硝态氮吸收(
还原和氨基酸合成过程中能量的消耗!达到降低硝
酸盐含量的目的)#*研究表明!氨基酸态氮源和硝
态氮同时存在的情况下!不结球白菜和生菜先吸收
氨基酸态氮!从而降低其体内硝酸盐含量)!"!+*
FGHG
是一种潜在的植物体中调节离子转运的调
节因子)!#*或硝酸盐吸收上调的长途信号)(*!并通过
调节与氮(碳代谢相关的酶活性!如硝酸还原酶(谷
氨酸合成酶等影响拟南芥幼苗硝酸盐的吸收和利
用!当硝酸盐的浓度升高时会抑制硝酸盐的吸收)-*&
外源添加
FGHG
可通过促进
DE
活性的提高!达到
降低生菜硝酸盐含量的目的)%*本试验研究结果表
明!高氮水平下外源添加
!,$66A8
%
OFGHG
显著
提高了生菜叶片
DE
(
D/E
(
FGP
活性和
D3
+
Q
*D
含量!同时降低了
DI
%
)
*D
(
DI
!
)
*D
含量这可能
是因为!外源
FGHG
作为氨基酸态氮源可以被植物
根系直接吸收!当环境中同时存在硝态氮和氨基酸
态氮时!
FGHG
被优先吸收!通过诱导
DE
(
D/E
(
FGP
活性的提高!从而达到降低叶片硝酸盐含量的
目的
环境因子(不合理的施肥方式(植物种类等都是
影响植物体内硝酸盐积累的因素)!!*植物体对硝
酸盐的同化反应需要经过两个步骤$首先!
DI
%
)
*D
在
DE
的作用下还原成
DI
!
)
*D
&
DI
!
)
*D
由
D/E
还原为
D3
+
Q
*D
后进一步合成氨基酸和蛋白
质)#&*研究表明!
DE
的活性代表氮代谢的强弱!
DE
活性对整个氮素代谢的强弱起着关键的调控作
用)!%*由本试验结果可知!生菜叶片内
DI
%
)
*D
含
量与
DE
(
D/E
(
FGP
活性!以及与
DI
!
)
*D
(
D3
+
Q
*
D
含量均呈显著相关关系!表明
DE
(
D/E
(
FGP
活
性对
DI
%
)
*D
含量的积累有重要作用
综上所述!本试验克隆了生菜
!"
基因序列!该
基因在进化上具有很强的保守性!而且高氮水平下
外源
FGHG
可以通过影响无机氮代谢来降低生菜
叶片
DI
%
)
*D
含量!在此过程中
DE
发挥重要作
用此结果为生产中
FGHG
的合理施用及降低叶
菜类蔬菜硝酸盐含量提供了理论依据!但
FGHG
对
硝酸盐代谢中其他关键酶基因的克隆和表达的影响
尚需进一步深入研究
参考文献!
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氨基丁酸对高氮水平下生菜叶片硝酸还原酶基因表达和硝酸盐含量的影响