全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４６(１): ７２￣８３(２０１６)
收稿日期: ２０１４￣１０￣１８ꎻ 修回日期: ２０１５￣１１￣０２
基金项目: 中国烟草总公司资助项目(１１０２００９０２０６５￣４)ꎻ 山东烟草专卖局资助项目(２０１００１)ꎻ 农业部科研项目(２１３０１０８)ꎻ 山东省“泰山
学者”建设工程专项
通讯作者: 武 侠ꎬ教授ꎬ主要从事植物病原线虫生物防治研究ꎻＴｅｌ:１３８８４９５６２５０ꎬ Ｅ￣ｍａｉｌ:ｗｕｘｉａ３８９７＠１６３.ｃｏｍ
第一作者: 朱先婷ꎬ女ꎬ山东枣庄人ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事植物线虫学研究ꎻＴｅｌ:１３２５５４２４９９７ꎬ Ｅ￣ｍａｉｌ:ｚｈｕｘｉａｎｔｉｎｇ１２１９＠１２６.ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１６.０１.００９
寄生于南方根结线虫卵的
长梗木霉几丁质酶基因 ＴｌＣｈｉ４６的克隆
朱先婷１ꎬ 赵 洋１ꎬ 王 凯１ꎬ 王凤龙２ꎬ 陈德鑫２ꎬ 梁文星１ꎬ 武 侠１∗
( １青岛农业大学 农学与植物保护学院ꎬ山东省植物病虫害综合防控重点实验室ꎬ青岛 ２６６１０９ꎻ ２中国农业科学院烟草研究所ꎬ青岛 ２６６１０１)
摘要:为进一步筛选高效寄生线虫真菌和阐明其寄生线虫卵的机理ꎬ本研究从湖北省烟草南方根结线虫雌虫分离到 １株具
高效生防潜力的菌株 ＨＢＦ１ꎮ 形态学、ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ 和翻译延长因子 ｔｅｆ１￣α 序列分析鉴定该菌为长梗木霉菌 Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ
ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍꎬ其对南方根结线虫卵第 １０ ｄ寄生率为 ８０.４５％ꎮ 通过简并引物设计和 ＲＡＣＥ技术克隆其几丁质酶基因ꎬ分
析该基因序列及与其他几丁质酶的同源性ꎮ 该菌是 １株可以产生几丁质酶的南方根结线虫卵寄生真菌ꎬ第 １０ ｄ 几丁质酶
的活性达到高峰ꎬ为 ２４.８８ μｍｏｌ / ｈ / ｍＬꎮ 本研究首次从长梗木霉 ＨＢＦ１ 菌株中克隆到 １ 个几丁质酶基因 ＴｌＣｈｉ４６ꎬ该基因
ＤＮＡ全长 １ ７９３ ｂｐꎬ含 ３个内含子和 １个 １ ２７２ ｂｐ的开放阅读框ꎬ编码 ４２３个氨基酸ꎬ理论分子量 ４５.９ ｋＤａꎬ等电点 ５.２３ꎮ
同源性比对表明和昆虫寄生菌几丁质酶的亲缘关系较远ꎮ 从长梗木霉 ＨＢＦ１中克隆得到的几丁质酶基因编码的几丁质酶
的功能域可供进一步研究ꎬ高效产几丁质酶并有效寄生南方根结线虫卵的长梗木霉对南方根结线虫具有良好的生防潜力ꎮ
关键词:克隆ꎻ 长梗木霉ꎻ 南方根结线虫卵ꎻ 寄生ꎻ 几丁质酶基因
Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ ＴｌＣｈｉ４６ ｆｒｏｍ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ ｐａｒａ￣
ｓｉｔｉｚｉｎｇ ｏｎ Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｉｎｃｏｇｎｉｔａ ｅｇｇｓ　 ＺＨＵ Ｘｉａｎ￣ｔｉｎｇ１ꎬ ＺＨＡＯ Ｙａｎｇ１ꎬ ＷＡＮＧ Ｋａｉ１ꎬ ＷＡＮＧ
Ｆｅｎｇ￣ｌｏｎｇ２ꎬ ＣＨＥＮ Ｄｅ￣ｘｉｎ２ꎬ ＬＩＡＮＧ Ｗｅｎ￣ｘｉｎｇ１ꎬ ＷＵ Ｘｉａ１ 　 ( １Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｏｎｏｍｙ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ ＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬＱｉｎｇｄａｏ
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｋｅｙ Ｌａｂ ｏｆ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｃｒｏｐ Ｐｅｓｔ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｈａｎｄｏｎｇ ＰｒｏｖｉｎｃｅꎬＱｉｎｇｄａｏ ２６６１０９ꎬＣｈｉｎａꎻ ２Ｔｏｂａｃｃｏ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅꎬ ＣＡＡＳꎬ Ｑｉｎｇｄａｏ ２６６１０１ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ａ ｆｕｎｇｕｓ ｎａｍｅｄ ＨＢＦ１ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｆｅｍａｌｅ ｏｆ Ｍ. ｉｎｃｏｇｎｉｔａ ｏｎ ｔｏｂａｃｃｏ ｉｎ Ｈｕｂｅｉ ｐｒｏｖｉｎｃｅꎬ
Ｃｈｉｎａ ａｎｄ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １￣ａｌｐｈａ. Ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｖｉｒｕｌｅｎｔ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｅｌｕｃｉｄａｔｅ
ｔｈｅ ｐａｒａｓｉｔｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｎ Ｍ. ｉｎｃｏｇｎｉｔａ ｅｇｇｓꎬ ｔｈｅ ｅｇｇ ｐａｒａｓｉｔｉｓｍ ｏｆ Ｍ. ｉｎｃｏｇｎｉｔａ ｅｇｇｓ ｂｙ Ｔ. ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ
ＨＢＦ１ ｗａｓ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ. Ｔｈｅ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ ｐａｒａｓｉｔｉｚｅｄ ｅｇｇｓ ｗａｓ ８０.４５％ ａｔ ｔｈｅ １０ ｔｈ ｄａｙ ａｆｔｅｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ.
Ｆｒｏｍ ｔｈｉｓ ｉｓｏｌａｔｅꎬ ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎｄ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｃｌｏｎｅｄ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ
ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ＲＡＣＥ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ. Ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｅｄｕｃｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｏｎｇ ｗｉｔｈ ｉｔｓ
ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗａｓ ｂｙ ｂｉｏｌｏｇｙ ｓｏｆｔｗａｒｅ. Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＨＢＦ１ ｗａｓ ａｂｌｅ ｔｏ ｐｅｎｅｔｒａｔｅ ｎｅｍａｔｏｄｅ ｅｇｇ ａｎｄ
ｐｒｏｄｕｃｅ ｃｈｉｔｉｎａｓｅꎬ ｍａｘｉｍｕｍ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ ｗａｓ ２４.８８ μｍｏｌ / ｈ / ｍＬ ｒｅｃｏｒｄｅｄ ａｔ ｔｈｅ ｔｅｎｔｈ ｄａｙ ａｆｔｅｒ ｉｎｏｃｕ￣
ｌａｔｉｏｎ. Ｗｅ ｈａｖｅ ｃｌｏｎｅｄ ａ ｎｏｖｅｌ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ ＴｌＣｈｉ４６ ｆｒｏｍ Ｔ. ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ ＨＢＦ１ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｔｉｍｅ. Ｔｈｅ
ｇｅｎｅ ｉｓ １ ７９３ ｂｐ ｉｎ ｌｅｎｇｔｈ ａｎｄ ｃｏｎｔａｉｎｓ ｔｈｒｅｅ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｉｎｔｒｏｎｓ. Ｔｈｅ ＯＲＦ ｏｆ ＴｌＣｈｉ４６ ｉｓ １ ２７２ ｂｐ ｉｎ ｓｉｚｅ ｗｉｔｈ ｅｎｃｏ￣
ｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ４２３ ａａ ꎬ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ ｏｆ ４５.９ ｋＤａ ａｎｄ ｐＩ ｏｆ ５.２３. Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈａｔ ｔｈｉｓ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ
ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｒｅｐｏｒｔｅｄ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ. ｃｈｉｔｉｎａｓｅｓ ａｒｅ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｔｏｇｅｔｈｅｒ ａｎｄ ａｒｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｄｉｓｔａｎｔ ｆｒｏｍ ｏｔｈｅｒ

　
　 １期 朱先婷ꎬ等:寄生于南方根结线虫卵的长梗木霉几丁质酶基因 ＴｌＣｈｉ４６的克隆
ｅｎｔｏｍｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｇｉ. Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｄｅｄ ｂｙ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ
ＴｌＣｈｉ４６ ｆｒｏｍ Ｔ. ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ ＨＢＦ１ ｐｏｓｓｅｓｓｅｓ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｏｍａｉｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｕｒｔｈｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈꎬ
Ｔ. ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ ＨＢＦ１ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｔｈｅ ｓｔｒｏｎｇ ｃｈｉｔｉｎｏｌｙｔｉｃ ａｎｄ ｅｇｇ￣ｐａｒａｓｉｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｈａｓ ａ ｇｒｅａｔ ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ
ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｇａｉｎｓｔ Ｍ. ｉｎｃｏｇｎｉｔａ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｃｌｏｎｉｎｇꎻ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍꎻ Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｉｎｃｏｇｎｉｔａ ｅｇｇｓꎻ ｐａｒａｓｉｔｉｓｍꎻ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ
中图分类号: Ｓ４３２.１　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１６)０１￣００７２￣１２
　 　 根结线虫 (Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｓｐｐ.) 病是世界范围
内发生且寄主范围广泛的重要植物线虫病害[１]ꎮ
化学杀线剂对环境造成严重污染ꎬ并且化学药剂的
大量使用使植物寄生性线虫抗药性随之增强ꎬ防治
效果降低ꎮ 因此ꎬ开发具有生防作用的真菌和有潜
力的生防因子备受关注ꎮ 几丁质是由 β￣１ꎬ４￣糖苷
键相连的 Ｎ￣乙酰葡聚糖胺线性聚合物ꎬ是自然界
中第二大丰富的多糖ꎬ存在于真菌细胞壁、海藻、昆
虫和甲壳类动物的外骨骼以及软体动物中ꎬ同时也
是线虫卵壳的重要结构成分(４０％ｗ / ｗ) [２]ꎮ 几丁
质酶可催化几丁质的 β￣１ꎬ４￣糖苷键水解生成 Ｎ￣乙
酰葡聚糖胺ꎮ 几丁质酶在营养、寄生、防御机制和
形态建成不同的生理过程中发挥重要作用[３]ꎮ 真
菌分泌的几丁质酶一方面可以帮助其穿透寄主ꎬ另
一方面可间接的对寄主进行酶解ꎮ
线虫卵是线虫生活史中最具抗性的阶段ꎬ但同
样易受到卵寄生真菌的定殖和破坏ꎮ 线虫卵壳结
构中包括包埋几丁质微纤维的蛋白胶质组成的几
丁质层[４]ꎮ 几丁质层是线虫卵壳最厚的一层ꎬ也
是线虫抵御土壤微生物侵染的主要屏障ꎬ微生物必
须穿透这层屏障才能在线虫卵内成功定殖[２]ꎮ 线
虫卵寄生真菌分泌的几丁质酶对降解含几丁质的
线虫卵壳起到重要作用[５]ꎮ 诸如厚垣普奇尼亚菌
Ｐｏｃｈｏｎｉａ ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒｉａꎬ这种卵寄生真菌在寄生
线虫卵时必须要穿透线虫卵壳[６]ꎮ
据报道ꎬ从线虫卵寄生真菌厚垣轮枝菌 Ｖｅｒｔｉ￣
ｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒｉｕｍ[７]、 萨 克 拉 轮 枝 菌 Ｖ.
ｓｕｃｈｌａｓｐｏｒｉｕｍ[７]、淡紫拟青霉 Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｌｉｌａｃｉ￣
ｎｕｓ[８] 和 刀 孢 蜡 蚧 菌 Ｌｅｃａｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｓａｌｌｉｏ￣
ｔａｅ[９]中纯化的几丁质酶和蛋白酶单独或一起使用
都可以对马铃薯白线虫 Ｇｌｏｂｂｏｄｅｒａ ｐａｌｌｉｄａ[７]、爪哇
根结线虫Ｍ. ｊａｖａｎｉｃａ[８]和南方根结线虫 Ｍ. ｉｎｃｏｇ￣
ｎｉｔａ[９]的卵造成破坏ꎬ并已从线虫卵寄生真菌刀孢
蜡蚧菌[９]和淡紫拟青霉[１０]中克隆到几丁质酶基
因ꎬ为几丁质酶在植物病原线虫生防机制研究提供
了新的理论依据ꎮ
木霉菌(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ.)在根、土壤环境中
是非常活跃的腐生性真菌ꎬ已广泛应用于拮抗植物
病原线虫[１１]ꎮ 木霉生防机制包括抗菌代谢物的产
生、对空间和营养的竞争、重寄生、促进植物生长和
诱导 植 物 的 防 御 反 应[１２]ꎮ 哈 茨 木 霉 Ｔ.
ｈａｒｚｉａｎｕｍ[１３]和绿色木霉 Ｔ. ｖｉｒｅｎｓ[１４]的培养滤液
可以抑制南方根结线虫卵孵化ꎬ哈茨木霉[１３]培养
滤液中蛋白水解酶和几丁质酶对降解南方根结线
虫卵壳进而阻止胚胎发育发挥重要作用ꎮ 温室盆
栽试验中哈茨木霉能明显减少爪哇根结线虫的二
龄幼虫侵染番茄幼苗ꎬ该菌株可定殖其游离卵[１５]ꎮ
深绿木霉 Ｔ. ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ和棘孢木霉 Ｔ. ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ的
分生孢子ꎬ可吸附爪哇根结线虫的卵块并萌发出大
量的菌丝穿透卵块寄生其中的卵和二龄幼虫ꎬ并且
棘孢木霉的分生孢子和菌丝可吸附在游离卵的表
面ꎬ菌丝穿透卵的过程中观察到附着胞状结构的形
成和卵内容物外泄[１６]ꎮ 深绿木霉、哈茨木霉、绿色
木霉都可以寄生秀丽隐杆线虫 Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ
ｅｌｅｇａｎｓ卵[１７]ꎮ 有关长梗木霉寄生线虫卵尚未见
报道ꎮ
大多数木霉菌采用重寄生过程寄生其他真菌和
线虫ꎬ因此以重寄生为基础的分子机制是高度保守
的ꎮ Ｖｉｔｅｒｂｏ 等[１８](２００１)已克隆出和重寄生过程有
关的哈茨木霉内切几丁质酶 基 因 Ｃｈｉ１８￣１５
(Ｃｈｉｔ３６)ꎬＣｈｉｔ３６ 转化株的培养滤液可完全抑制病
原菌孢子萌发和菌丝生长ꎮ Ｓｅｉｄｌ 等[１９](２００５)从深
绿木霉中克隆出 ５个几丁质酶基因 ｃｈｉ１８￣２、 ｃｈｉ１８￣
３、ｃｈｉ１８￣４、ｃｈｉ１８￣１０ 和 ｃｈｉ１８￣１３ꎬ病原菌细胞壁可激
发几丁质酶基因的转录ꎬ并且 ｃｈｉ１８￣１３和 ｃｈｉ１８￣３在
深绿木霉生长过程中存在拼接和非拼接的 ｍＲＮＡꎬ
表明这 ２种几丁质酶基因存在转录后的调节机制ꎮ
木霉菌可以产生几丁质降解酶ꎬ这一重要特性使其
可有效寄生含几丁质的线虫卵ꎮ 编码哈茨木霉几丁
质酶的基因 Ｃｈｉ１８￣１２的转录丰度明显高于 Ｃｈｉ１８￣５
３７

　
植物病理学报 ４６卷
的转录丰度ꎬ并且 ２种内切几丁质酶基因以协同作
用的方式在寄生秀丽隐杆线虫卵过程中发挥重要作
用[１７]ꎮ Ｋｏｖａｃｓ等[２０](２００４)从长梗木霉固体发酵培
养基中纯化出 ４３.５ 和 ３０ ｋＤａ ２ 种几丁质酶ꎮ 长梗
木霉几丁质酶基因的克隆尚未见报道ꎮ
本研究采用可以高效寄生南方根结线虫卵的
长梗木霉 ＨＢＦ１克隆其几丁质酶基因ꎬ明确该几丁
质酶基因编码蛋白的氨基酸序列ꎬ阐明该菌株的几
丁质酶和其他生防菌几丁质酶的同源性ꎬ可为农业
线虫病害的生物防治提供新的资源和理论依据ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 试验材料
　 　 长梗木霉 Ｔ. ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ 菌株分离自湖北
省咸丰县甲马池乡石板村烟草南方根结线虫雌虫ꎬ
菌株编号 ＨＢＦ１ꎮ 菌株于 ４℃、ＰＤＡ 培养基上保存
于青岛农业大学线虫学研究室ꎮ
１.２　 试验方法
１.２.１　 菌株的形态学观察　 将已活化的菌株接于
直径 ９ ｃｍ的 ＰＤＡ培养基上ꎬ２７℃暗箱培养ꎮ 从第
２ ｄ 开始记录菌落颜色、形态和菌落生长状况ꎬ直
至菌落长满平板ꎮ 采用玻片培养法ꎬ将 ＰＤＡ 培养
基分成 ５ ｍｍ×５ ｍｍ 的小薄片ꎬ挑于载玻片上ꎬ再
将已活化的菌丝挑至培养基上ꎮ ２７℃暗箱保湿培
养ꎬ在显微镜下连续观察该菌的分生孢子、分生孢
子梗的形成情况ꎬ测量并照相ꎮ
１.２.２　 菌株的分子生物学鉴定　 采用 ＤＮＡ提取试
剂盒(ＴａＫａＲａ ＤＶ８１１Ａ)提取基因组 ＤＮＡꎮ 分别采
用通用引物 ＩＴＳ１￣Ｆ、ＩＴＳ４￣Ｒ、ＥＦ￣７２８Ｍ、ＥＦ￣２(表 １)
在 ＰＣＲ仪(ＰＴＣ２００ꎬＢｉｏ￣ＲａｄꎬＵＳＡ)中扩增 ＨＢＦ１菌
株 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ和翻译延长因子 ｔｅｆ１￣α片段ꎮ ＰＣＲ反
应体系(５０ μＬ)包括:２５ μＬ ｍｉｘ(Ｓａｎｇｏｎ Ｃｏ.Ｌｔｄꎬ
ＳｈａｎｇｈａｉꎬＣｈｉｎａ)ꎬ２.５ μＬ 模板、５ μｍｏｌ / Ｌ 上下游引
物各 ２.５ μＬ、１７.５ μＬ 无核酸酶的水(Ｓａｎｇｏｎ Ｃｏ.
Ｌｔｄꎬ Ｓｈａｎｇｈａｉꎬ Ｃｈｉｎａ)ꎮ 反应程序:９４℃预变性 ５
ｍｉｎꎻ９４℃变性 ３０ ｓꎬ５４℃(ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ) / ５５℃( ｔｅｆ１￣α)
退火 ３０ ｓꎬ７２℃延伸 １ ｍｉｎꎬ３４个循环ꎻ７２℃最终延伸
１０ ｍｉｎꎮ １％琼脂糖凝胶电泳检测 ＰＣＲ产物ꎬ并由生
工生物工程股份有限公司测序ꎮ ＨＢＦ１ 菌株的
ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ 和 ｔｅｆ１￣α 基因的核苷酸序列与 ＧｅｎＢａｎｋ
数据 库 比 对 ( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｎｃｂｉ. ｎｌｍ. ｎｉｈ. ｇｏｖ /
ＢＬＡＳＴ)ꎬ并基于 ｔｅｆ１￣α基因序列使用 ＴｒｉｃｈｏＢＬＡＳＴ
(ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ.ｉｓｔｈ.ｉｎｆｏ)再次比对ꎮ 挑选和 ＨＢＦ１相
似性最高的序列用于矩形集群ꎮ 采用 ＭＥＧＡ４.０.２
软件构建系统发育树ꎬ评估 ＨＢＦ１ 菌株和 ＮＣＢＩ 数
据库中其他序列的进化距离ꎮ
１.２.３　 粗酶液的制备　 １％胶体几丁质作为唯一碳
源的液体培养基培养 ＨＢＦ１ 菌株诱导几丁质酶产
生ꎮ ２５０ ｍＬ三角瓶中装有 １００ ｍＬ 上述液体培养
基无菌条件下接种 １０ 块 ５ ｍｍ 直径大小的菌块ꎬ
２７℃、１８０ ｒｐｍ振荡培养 １６ ｄꎮ 从第 ２ ｄ开始每隔 ２
ｄ取 ２ ｍＬ 培养滤液ꎬ直到第 １６ ｄꎮ 培养滤液于
４℃、１１ ０００ ｒｐｍ 离心 １５ ｍｉｎꎬ上清于－２０℃保存ꎬ
供几丁质酶活性测定ꎮ
１.２.４　 几丁质酶活性分析　 依据 Ｓｃｈａｌｅｓ[２１]方法测
定粗酶液产生还原糖的量ꎬ评估几丁质酶的活性ꎮ
反应体系包括 ２００ μＬ 粗酶液ꎬ４００ μＬ ０.２ ｍｏｌ / Ｌ
(ｐＨ ４.６)的醋酸钠缓冲液、５００ μＬ 胶体几丁质ꎬ对
照再加入 ２００ μＬ １ ｍｏｌ / Ｌ 的 ＮａＯＨꎬ反应液于 ３７℃
振荡培养 ２ ｈ后立即加入 ２００ μＬ １ ｍｏｌ / Ｌ 的 ＮａＯＨ
终止反应ꎮ 反应液于 １１ ０００ ｒｐｍ常温离心 １０ ｍｉｎꎮ
取 ０.５ ｍＬ 上清加入 １ ｍＬ Ｓｃｈａｌｅ’液 ９５℃加热 ５
ｍｉｎꎮ 冷却到室温后采用紫外分光光度计(ＵＶｍｉｎｉ￣
１２４０ꎬＳｈｉｍａｄｚｕ)测量 ４２０ ｎｍ 处的吸光值ꎮ ３ 次重
复ꎮ Ｎ￣乙酰￣Ｄ￣葡萄糖胺(ＮＡＧＡ)作为标准制作的
标准曲线用于测量还原糖的浓度ꎮ 酶活性单位定义
为每小时产生 １ μｍｏｌ还原糖所需要的酶量ꎮ
１.２.５　 南方根结线虫卵的制备　 根结线虫样本来
源于青岛即墨国家农业高新技术区番茄大棚内ꎮ
从番茄根结上挑取新鲜的卵块ꎬ１％的次氯酸钠对
卵块进行解离和表面消毒ꎬ收集游离卵ꎬ制成 ３ ０００
个 / ｍＬ卵的悬浮液即刻用于分析ꎮ
１.２.６　 离体条件下 ＨＢＦ１对南方根结线虫卵寄生作
用的直接观察　 ＨＢＦ１在 ＰＤＡ培养基上预培养 ３ ｄꎮ
挑取 ５ ｍｍ直径大小的菌落块转移至含 ２％水琼脂
直径 ９ ｍｍ的培养皿中ꎮ 在培养皿四周埋 ４个盖玻
片ꎬ待菌丝长至盖玻片边缘时在无菌条件下吸取
３０ μＬ约含 １００个卵的悬浮液于相应的盖玻片上ꎬ置
２７℃暗箱中密封培养ꎮ 设无 ＨＢＦ１菌的线虫卵为对
照ꎮ 从第 ２ ｄ开始每天随机取出一皿的 ４个盖玻片
经 ０.１％的苯胺蓝染色后镜检ꎬ并对 ＨＢＦ１寄生的卵
计数ꎮ 一皿的 ４个盖玻片作为 ４次重复ꎮ 卵寄生指
数定义为: ＨＢＦ１对卵的寄生率ꎬ减去对照的寄生率
４７

　
　 １期 朱先婷ꎬ等:寄生于南方根结线虫卵的长梗木霉几丁质酶基因 ＴｌＣｈｉ４６的克隆
的差值ꎬ除以 ＨＢＦ１对卵的寄生率ꎮ
１.２.７　 总 ＲＮＡ提取　 长梗木霉 ＨＢＦ１菌株在 ＰＤＡ
培养基上预培养 ３ ｄꎬ无菌条件下挑取 １０ 块直径 ５
ｍｍ大小的菌落块ꎬ接到 １％胶体几丁质作为唯一碳
源的液体培养基中ꎬ培养 ＨＢＦ１菌株诱导几丁质酶的
产生ꎬ２７℃、１８０ ｒｐｍ振荡培养 ８ ｄꎬ用于提取总 ＲＮＡꎮ
液氮研磨后的 ＨＢＦ１ 菌丝粉末用 Ｔｒｉｚｏｌ 试剂
(ＴＩＡＮＧＥＮ ＲＰ１２０４２０)提取总 ＲＮＡꎬ并用 ＤＮａｓｅＩ
处理ꎬ其中菌丝粉末与 Ｔｒｉｚｏｌ 的比例为 １ / １０
(ｗ / ｖ)ꎮ １％琼脂糖凝胶电泳检测 ＲＮＡ 质量ꎮ
ＲＮＡ用于下一步试验ꎮ
１.２.８　 引物设计　 通过ＧｅｎＢａｎｋ搜索高度同源的相
关真菌几丁质酶基因编码的氨基酸序列ꎬ采用 ＤＮＡ￣
ＭＡＮ ｖ.６.０比对确定保守区 ＤＧｘＤｘＤＷＥＹＰ和 ＧＬＧ￣
ＧｘＭＦＷＥｘＳꎬ根据保守区设计简并引物 ＴｌＪ１、ＴｌＪ２ꎮ 根
据简并引物扩增出的核苷酸序列ꎬ设计 ３′ＲＡＣＥ特异
性引物 ＴｌＧＳＰ１和 ５′ＲＡＣＥ 特异性引物 ＴｌＧＳＰ２ꎮ 根据
ＲＡＣＥ拼接结果设计 ＯＲＦ 引物 ＴｌＯＲＦ １ 和 ＴｌＯＲＦ ２ꎬ
ＯＲＦ引物的 ５’端加上限制酶切位点(下划线)ꎮ 引物
(表 １)由生工生物工程股份有限公司合成ꎮ
１.２. ９ 　 ＲＴ￣ＰＣＲ 　 采用 Ｒｅｖｅｒｔ ＡｉｄＴＭ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ
ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ (Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ)ꎬ按照试剂盒
操作流程以总 ＲＮＡ 为模板反转成第一链 ｃＤＮＡꎮ
ｃＤＮＡ模板结合简并引物(ＴｌＪ１、ＴｌＪ２)ＰＣＲ扩增几丁
质酶基因的保守区ꎮ 反应体系同 １.２.２ꎬ反应程序同
１.２.２ꎬ退火温度改为 ５１℃ꎮ １％琼脂糖凝胶电泳检测
ＰＣＲ产物ꎬ由生工生物工程股份有限公司克隆测序ꎮ
１.２. １０ 　 ＲＡＣＥ 　 采用 ＳＭＡＲＴｅｒＴＭ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ
Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ (ＰＴ４０９６￣１ꎬＣｌｏｎｔｅｃｈꎬＴａＫａＲａ Ｂｉｏ
Ｃｏｍｐａｎｙ) 试剂盒ꎬ按照操作流程将总 ＲＮＡ 反转
成 ３′ / ５′￣ＲＡＣＥ￣Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡꎮ ＲＡＣＥ ＰＣＲ 反应体
系的终体积 ２５ μＬꎬ包含 １. ２５ μＬ ２０ｘ 稀释的
ｃＤＮＡ模板ꎬ ５ μｍｏｌ / Ｌ 的 ＴｌＧＳＰ１ 、ＴｌＧＳＰ２、ＵＰＭ 各
１.２５ μＬꎬ其他同 １.２.２ꎮ ＰＣＲ 反应程序同 １.２.２ꎬ退
火温度改为 ６７℃ ( ３′ ＲＡＣＥ) / ５６℃ ( ５′ ＲＡＣＥ)ꎮ
ＰＣＲ反应 ３次重复ꎬ包含一个无模板的对照ꎮ ＰＣＲ
产物采用 １％琼脂糖凝胶电泳检测ꎬ送生工生物工
程股份有限公司克隆测序ꎮ
１.２. １１ 　 序列分析 　 通过 ＯＲＦ Ｆｉｎｄｅｒ ( ｈｔｔｐ: / /
ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ / ｇｏｒｆ / ｇｏｒｆ.ｈｔｍｌ)查找 ＨＢＦ１
几丁质酶基因的 ＯＲＦꎮ ＨＢＦ１ 菌株几丁质酶翻译
后的氨基酸序列和 ＧｅｎＢａｎｋ 中的氨基酸序列进行
ＢＬＡＳＴ ( ｈｔｔｐ: / / ｂｌａｓｔ. ｓｔ￣ｖａ. ｎｃｂｉ. ｎｌｍ. ｎｉｈ. ｇｏｖ /
Ｂｌａｓｔ.ｃｇｉ)比对ꎮ ＥｘＰａｓｙ￣Ｃｏｍｐｕｔｅ ｐＩ / Ｍｗ (ｈｔｔｐ: / /
ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ / ｔｏｏｌｓ / ｐｉ＿ｔｏｏｌ. ｈｔｍｌ)用于推测几丁质酶
的等电点和分子量ꎮ Ｓｉｇｎａｌ Ｐ ３. ０ ( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ.
ｃｂｓ.ｄｔｕ. ｄｋ / ｓｅｒｖｉｃｅｓ / ＳｉｇｎａｌＰ / )预测信号肽和信号
肽酶裂解位点ꎮ ＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎ(ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｅｂｉ. ａｃ.
ｕｋ / ｉｎｔｅｒｐｒｏ / ｓｅａｒｃｈ / ｓｅｑｕｅｎｃｅ￣ｓｅａｒｃｈ)推测几丁质酶
功能区域的氨基酸序列ꎮ
从 ＧｅｎＢａｎｋ 中查找到相似蛋白的氨基酸序
列ꎬＣｌｕｓｔａｌＷ２ (ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｅｂｉ. ａｃ. ｕｋ / Ｔｏｏｌｓ / ｍｓａ /
ｃｌｕｓｔａｌｗ２ / )中默认的设置进行序列比对ꎮ 采用
ＭＥＧＡ ４.０.２ 中的邻接法完成系统发育分析ꎬ样品
１ ０００次比对分析后的统计数据支持系统发育的结
果ꎮ 根据 Ｃａｒｂｏｈｙ￣ｄｒａｔｅ￣Ａｃｔｉｖｅ ｅｎＺｙｍｅｓ (ＣＡＺｙ)
数据库的命名法命名几丁质酶的功能域[２２]ꎮ
Ｔａｂｌｅ １　 ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ(５′￣３′) Ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ Ｕｓｅ
ＩＴＳ１￣Ｆ ＣＴＴＧＧＴＣＡＴＴＴＡＧＡＧＧＡＡＧＴ Ｆｏｒｗａｒｄ ＩＴＳ￣ＰＣＲ
ＩＴＳ４￣Ｒ ＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ Ｒｅｖｅｒｓｅ ＩＴＳ￣ＰＣＲ
ＥＦ￣７２８ Ｍ ＣＡＴＹＧＡＧＡＡＧＴＴＣＧＡＧＡＡＧＧ Ｆｏｒｗａｒｄ ｔｅｆ１￣ＰＣＲ
ＥＦ￣２ ＧＧＡＲＧＴＡＣＣＡＧＴＳＡＴＣＡＴＧＴＴ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｅｆ１￣ＰＣＲ
ＴｌＪ１ ＧＡＴＧＧＹＡＴＹＧＡＹＲＴＹＧＡＹＴＧＧＧＡ Ｆｏｒｗａｒｄ ＲＴ￣ＰＣＲ
ＴｌＪ２ ＧＣＲＧＡＤＧＣＣＴＣＣＣＡＲＡＡＣＡＴ Ｒｅｖｅｒｓｅ ＲＴ￣ＰＣＲ
ＴｌＧＳＰ１ ＴＡＴＧＣＣＡＡＣＣＣＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＡＣＧ Ｆｏｒｗａｒｄ ３′ＲＡＣＥ￣ＰＣＲ
ＴｌＧＳＰ２ ＧＣＣＴＴＧＴＡＡＴＣＣＣＡＧＡＣＡＣＣＧＴＴＣ Ｒｅｖｅｒｓｅ ５′ＲＡＣＥ￣ＰＣＲ
ＴｌＯＲＦ１ ＣＣｇｇＡＡＴＴＣＧＡＧＣＡＡＣＡＣＡＴＴＴＴＣＣＴＴＣＧＣＡＴＴＡ Ｆｏｒｗａｒｄ ＰＣＲ
ＴｌＯＲＦ２ ＣＣＣＡＡｇＣＴＴＴＧＧＣＴＴＧＴＣＣＣＡＡＴＣＡＧＣＧＡＧＴＣＡＧ Ｒｅｖｅｒｓｅ ＰＣＲ
ＵＰＭ ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ
　 Ｔｈｅ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｓｉｔｅｓ ａｒｅ ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ.
５７

　
植物病理学报 ４６卷
２　 结果与分析
２.１　 长梗木霉的形态学描述及分子生物学鉴定
２.１.１　 长梗木霉菌的培养性状和形态特征　 ＰＤＡ
培养基上观察到 ＨＢＦ１ 菌株生长快速ꎬ菌落初为白
色后转为浅绿色ꎬ分生孢子梗以众多小丛束分布于
菌落表面(图 １￣Ｄ)ꎬ菌落背面浅绿色ꎮ 镜下观察到
分生孢子梗长而直ꎬ次级分枝直角伸出或朝主枝弯
曲生长ꎮ 瓶梗基部略收缩或不收缩ꎬ略呈弯曲状(图
１￣Ａ)ꎮ 瓶梗单生或下部轮生亦或不规则着生于分
生孢子梗上(图 １￣Ｂ)ꎬ产生大量(３.７０ μｍ×２.２４ μｍ)
Ｆｉｇ. １ 　 Ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｈａｒａｃ￣
ｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａ￣
ｔｕｍ ＨＢＦ１
Ａ: Ｃｏｎｉｄｉｏｐｈｏｒｅｓꎻ Ｂ: Ｐｈｉａｌｉｄｅｓꎻ Ｃ: Ｏｖａｌ ｏｒ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄａｌ
ｃｏｎｉｄｉａꎻ Ｄ:Ｃｏｌｏｎｙ ｆａｃｅ ｖｉｅｗ.
呈倒卵形或椭圆形分生孢子(图 １￣Ｃ)ꎮ 基于形态
学特征ꎬＨＢＦ１菌株被归为木霉属ꎮ
２.１.２　 长梗木霉菌 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ 和 ｔｅｆ１￣α 序列分子
鉴定　 将 ＨＢＦ１ 菌株的 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ 和 ｔｅｆ１￣α 核苷
酸序列在 ＮＣＢＩ 数据库中进行 ＢＬＡＳＴ 比对ꎬ
ＨＢＦ１ 菌株 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ 序列和 Ｔ. ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ
(ＧｅｎＢａｎｋ: ＫＣ５７６６９５.１、ＤＱ２９７０５４.１) 相似度达
９６％ꎬｔｅｆ１￣α 序列和 Ｔ. ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ(ＧｅｎＢａｎｋ:
ＪＮ６８８２６８.１、ＪＮ６８８２６６.１)相似度达 ９９％ꎮ 分别将
ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ和 ｔｅｆ１￣α 序列提交 ＧｅｎＢａｎｋꎬ获得登录
号分别为 ＫＪ１４９８０３. １ 和 ＫＰ２０８６５０ꎮ 从 ＧｅｎＢａｎｋ
中选取不同来源的 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ 和 ｔｅｆ１￣α 序列ꎬ通过
邻接法构建系统发育树ꎮ 基于 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ 序列构
建的系统发育树(图 ２)表明ꎬ该菌与 Ｔ. ｌｏｎｇｉｂｒａ￣
ｃｈｉａｔｕｍ 属于同一类群ꎻ基于 ｔｅｆ１￣α 序列构建的系
统发育树 (图 ３ ) 清晰表明ꎬ ＨＢＦ１ 以 ９７％ 的
Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ值和 Ｔ. ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ 聚到一支ꎮ 通过
ＴｒｉｃｈｏＭＡＲＫ 鉴定含有 ｔｅｆ１ 第 ４ 和第 ５ 内含子ꎬ
ＴｒｉｃｈｏＢＬＡＳＴ比对结果表明 ＨＢＦ１ 菌株与 Ｔ. ｌｏｎ￣
ｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ ＣＢＳ８１６. ６８ 的相似度达 １００％ (１２０ /
１２０)ꎮ 因此ꎬ将 ＨＢＦ１ 菌株命名为 Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ
ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ ＨＢＦ１ꎮ
２.２　 几丁质酶活性分析
　 　 以胶体几丁质作为唯一碳源的诱导培养基培
养 ＨＢＦ１ꎬ第 １０ ｄ达到酶活性高峰ꎬ为 ２４.８８ μｍｏｌ /
ｈ / ｍＬꎬ至第 １６ ｄ仍保持高峰活性水平(图 ４)ꎮ
Ｆｉｇ. ２　 Ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣ｊｏｉｎｉｎｇ ｔｒｅｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ ＨＢＦ１ ａｎｄ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｆｕｎｇｉ ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ
Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ ＨＢＦ１ ｉｓ ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ.
６７

　
　 １期 朱先婷ꎬ等:寄生于南方根结线虫卵的长梗木霉几丁质酶基因 ＴｌＣｈｉ４６的克隆
Ｆｉｇ. ３　 Ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣ｊｏｉｎｉｎｇ ｔｒｅｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｅｆ１￣α ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ ＨＢＦ１ ａｎｄ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｆｕｎｇｉ ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ
Ｔｈｅ ｔｅｆ１￣α ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ ＨＢＦ１ ｉｓ ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ.
Ｆｉｇ. ４　 Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ ａｃ￣
ｔｉｖｉｔｙ ｆｒｏｍ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａ￣
ｔｕｍ ＨＢＦ１ ａｎｄ ｉｔｓ ｐａｒａｓｉｔｉｓｍ ａｇａｉｎｓｔ
ｅｇｇｓ ｏｆ Ｍ. ｉｎｃｏｇｎｉｔａ
Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｉｌｔｒａｔｅ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ
ＨＢＦ１ ｇｒｏｗｉｎｇ ｉｎ ｌｉｑｕｉｄ ｍｅｄｉｕｍ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ｃｈｉｔｉｎ(￣△￣)
ａｎｄ ｐａｒａｓｉｔｉｓｍ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ｏｎ ｅｇｇｓ ｏｆ Ｍ. ｉｎｃｏｇｎｉｔａ(￣○￣).
２.３　 离体条件下 ＨＢＦ１菌株对南方根结线虫卵的
寄生
　 　 被寄生卵ꎬ初期菌丝接触卵壳表面形成侵染钉
(图 ５￣Ａ)ꎻ随后菌丝穿透卵壳表面ꎬ使卵内容物凝集
(图 ５￣Ｂ)ꎻ大量菌丝穿透卵壳ꎬ菌丝生长旺盛(图 ５￣
Ｃ)ꎻ最后菌丝破坏卵ꎬ卵内容物外渗(图 ５￣Ｄ)ꎮ 在
寄生过程中还可观察到定殖卵的真菌产生大量分生
孢子(图 ５￣Ｅ)ꎻ有的 ＨＢＦ１ 菌株可寄生含有线虫的
卵ꎬ幼虫发育畸形(图 ５￣Ｆ)ꎮ 未接菌的卵ꎬ卵壳表面
光滑ꎬ３ ｄ后可见胚胎发育明显(图 ５￣Ｇ)ꎬ５ ｄ后大部
分可孵化出幼虫ꎮ 该菌对南方根结线虫卵的寄生率
在第 １０ ｄ达到寄生高峰ꎬ寄生率为 ８０.４５％ꎬ并以接
近 ８０％的寄生率一直平稳持续到第 １６ ｄ(图 ４)ꎮ 长
梗木霉 ＨＢＦ１菌株分泌的胞外几丁质酶活性与该菌
株对南方根结线虫卵的寄生率正相关ꎬ表明几丁质
酶在该菌穿透线虫卵壳中发挥了重要作用ꎮ
Ｆｉｇ. ５　 Ｐａｒａｓｉｔｉｓｍ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ ＨＢＦ１ ｏｎ ｅｇｇｓ ｏｆ Ｍ. ｉｎｃｏｇｎｉｔａ
Ａ:Ｈｙｐｈａｌ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｔｏ ｅｇｇ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｄ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ｃｏｌｏｎｉｚｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｆｕｎｇｕｓꎻＢ:Ｈｙｐｈａｌ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ ｔｏ ｅｇｇ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｄ ｅｇｇ
ｃｏｎｔｅｎｔｓ ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎꎻＣ:Ｐｒｏｌｉｆｉｃ ｈｙｐｈａｅ ｇｒｏｗｎ ｕｐｏｎ ｅｇｇꎻ Ｄ: Ｅｇｇ ｃｏｌｏｎｉｚｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｆｕｎｇｉꎻ Ｅ:Ｃｏｎｉｄｉａ ｂｙ ｆｕｎｇｕｓ
ｃｏｌｏｎｉｚｉｎｇ ｅｇｇꎻＦ:Ｅｇｇ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｔｈｅ ｊｕｖｅｎｉｌｅ ｓｔａｇｅ ｗａｓ ｉｎｆｅｓｔｅｄꎻＧ:Ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ.Ｔｈｅ ｆｕｎｇｕｓ ｗａｓ ｓｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ａｎｉｌｉｎｅ ｂｌｕｅ.
７７

　
植物病理学报 ４６卷
Ｆｉｇ. ６　 Ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ
ｇｅｎｅ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ ＨＢＦ１
Ａ:Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｐｒｏｄｕｃｔꎻ Ｂ:Ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ＲＴ￣ＰＣＲꎻ Ｃ:３′ＲＡＣＥ￣ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔꎻ Ｄ: ５′ＲＡＣＥ￣ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔꎻ
Ｅ:ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ＯＲＦ. Ｌａｎｅ１:Ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｃＤＮＡꎬ Ｌａｎｅ２:Ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ＤＮＡ. Ａｌｌ ｍａｒｋｅｒ ａｒｅ ＤＬ２０００ ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒ.
２.４　 ＨＢＦ１几丁质酶基因的克隆
　 　 ＨＢＦ１ 菌丝经液氮研磨后采用 Ｔｒｉｚｏｌ 提取总
ＲＮＡꎬ１％琼脂糖凝胶电泳显示存在 ２８Ｓ、１８Ｓ ｒＲＮＡ
２ 条带ꎬ无 ５Ｓ ｒＲＮＡꎬ２８Ｓ ｒＲＮＡ 的亮度接近 １８Ｓ
ｒＲＮＡ亮度的 ２倍(图 ６￣Ａ)ꎬ说明 ＲＮＡ降解很少ꎮ
采用简并引物(ＴｌＪ１、ＴｌＪ２)以 ｃＤＮＡ 为模板ꎬ
通过 ＲＴ￣ＰＣＲ扩增出 ７７３ ｂｐ 基因片段(图 ６￣Ｂ)ꎮ
使用 ＲＡＣＥ技术将总 ＲＮＡ 反转成 ｃＤＮＡ 第一链ꎬ
结合 ＴｌＧＳＰ１、ＴｌＧＳＰ２、ＵＰＭ 分别扩增得到 ７８１ ｂｐ 的
３′端基因片段(图 ６￣Ｃ)和 １ １３１ ｂｐ 的 ５′端基因片
段(图 ６￣Ｄ )ꎬ３′端具有明显的 ｐｏｌｙＡ 序列ꎮ 使用
ＳｅｑＭａｎ拼接保守序列ꎬ３′端和 ５′端基因片段得到
全长的 ｃＤＮＡ １ ５９７ ｂｐꎮ 以上序列全部经 ＢＬＡＳＴ
比对ꎬ结果与其它木霉属几丁质酶基因的同源性很
高ꎮ 通过 ＯＲＦ Ｆｉｎｄｅｒ查找到 １ ２７２ ｂｐ的开放阅读
框ꎮ 跨越 ＯＲＦ设计引物 ＴｌＯＲＦ１ 和 ＴｌＯＲＦ２ꎬ分别以
５′￣ＲＡＣＥ￣Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ 和 ＤＮＡ 为模板扩增 ＯＲＦ
(图 ６￣Ｅ)ꎮ 通过 Ｍｅｇａｌｉｇｎ 比较 ｃＤＮＡ 和 ＤＮＡ 的
序列ꎬ得出该基因含 ３ 个内含子ꎬ分别为 ５９、６５ 和
６９ ｂｐꎬ每条内含子的 ５′端都存在 ＧＴ 以及 ３′端都
存在 ＡＧꎮ 几丁质酶基因的 ＤＮＡ 全长为 １ ７９３ ｂｐ
(图 ７)ꎮ 将几丁质酶基因的 ｃＤＮＡ和 ＤＮＡ序列提
交 ＧｅｎＢａｎｋꎬ 获 得 登 录 号 分 别 为
ＫＪ７８７１３１、ＫＪ７８７１３０ꎮ
２.５　 氨基酸序列分析
　 　 Ｔ. ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ ＨＢＦ１ 几丁质酶基因的
ＯＲＦ编码 ４２３个氨基酸残基ꎮ 推测氨基酸的等电
点和分子量分别为 ５.２３和 ４５.９ ｋＤａꎮ
ＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎ分析表明该蛋白有一个模式化结
构ꎬ即 Ｎ端由 ２２ 个残基组成的信号肽、一个催化
区域(ＣａｔＤ:残基 ４１—３８４)和一个碳端延伸区域
(残基 ３８５—４２４)ꎮ 信号肽的出现ꎬ表明该蛋白作
为前体蛋白合成并且可能由 ＨＢＦ１ 菌株分泌ꎮ
ＧＨ１８几丁质酶催化区域的存在表明该蛋白是
ＧＨ１８家族的新成员ꎬ分类归为几丁质酶 ｃｌａｓｓⅡꎮ
该蛋白在此定义为 ＴｌＣｈｉ４６(由于 ＨＢＦ１ 菌株分泌
的前体几丁质酶的分子量为 ４５.９ ｋＤａ)ꎮ
　 　 ＴｌＣｈｉ４６的催化区域 ＣａｔＤ Ｔ ｌＣｈｉ４６包含 ２ / ３ 的编
码蛋白ꎬＧＨ１８ 几丁质酶催化区域激活位点的信号
识 别 码 ( 共 有 序 列: [ ＬＩＶＭＦＹ ] ￣[ ＤＮ ] ￣Ｇ￣
[ＬＩＶＭＦ] ￣[ＤＮ] ￣[ＬＩＶＭＦ] ￣[ＤＮ] ￣ｘ￣ＥꎻＰＲＯＳＩＴＥ
登 录 号: ＰＳ０１０９５ ) 和 １６４ＦＤＧＩＤＩＤＷＥ１７２ 一 致ꎮ
ＧＨ１８家族几丁质酶催化区域中保守的 ４ 段共有
序列在 ＣａｔＤＴ ｌＣｈｉ４６中同样存在(图 ８)ꎬ分别是 ２ 个
催化水解区 ( ８８ ＳＩＧＧＷ９２、１２４ ＦＤＧＩＤＩＤＷＥ１３２ )和 ２
个几丁质酶结合区域 ( ２７４ ＧＳＷＥＮＧＶＷＤＹ２８３、
３２ＧＬＧＧＳＭＦＷＥＡＳ３４２)ꎮ１２４ ＦＤＧＩＤＩＤＷＥ１３２ 这段序
列符合 ＧＨ１８几丁质酶的活性位点特征ꎮ 数字分
别表示 ＣａｔＤＴ ｌＣｈｉ４６氨基酸残基的位置ꎮ
　 　 ＧＨ１８ 几丁质酶的催化区域通常采用(β / α) ８
磷酸丙糖异构酶(ＴＩＭ)桶状折叠和通用的酸 /碱ꎬ
底物协助￣双重替换的水解机制ꎬ从而导致异头碳
构型的保留[２３]ꎮ 区段 ＦＤＧＩＤＩＤＷＥ 形成了 ( β /
α) ８桶状的 β４ 链和催化的核心区域ꎬ而谷氨酸残
基(Ｇｌｕ１７２在 ＴｌＣｈｉ４６一级结构中)是催化的关键质
子给予体[２３]ꎮ 起关键催化作用的谷氨酸残基之前
的 ２ 个天冬氨酸残基(Ａｓｐ１６８和 Ａｓｐ１７０在 ＴｌＣｈｉ４６
８７

　
　 １期 朱先婷ꎬ等:寄生于南方根结线虫卵的长梗木霉几丁质酶基因 ＴｌＣｈｉ４６的克隆
一级结构中)在催化底物水解中同样发挥了重要
作用ꎮ 最靠近 Ｇｌｕ１７２的 Ａｓｐ１７０被称为稳定剂ꎬ它的
侧链具有以下作用:(１)将 ＧｌｃＮＡｃ 的 Ｎ￣乙酰官能
团定位于￣１ 亚位点ꎬ有利于和异头物中心的羧基
氧发生亲核反应ꎻ(２)稳定离子中间物ꎻ(３)降低谷
氨酸盐酸 /碱的 ｐＫａ 值ꎮ 被命名为稳定剂助剂的
第 ２个天冬氨酸残基 Ａｓｐ１６８可提高稳定剂残基的
ｐＫａ值[２３]ꎮ ＴｌＣｈｉ４６ 的催化区域与其他真菌几丁
质酶 ＧＨ１８ 催化区域序列一致性很高(８３. ６３％)
(图 ８)ꎮ ＴｌＣｈｉ４６几丁质酶序列分析表明 Ｔ. ｌｏｎｇｉ￣
ｂｒａｃｈｉａｔｕｍ ＨＢＦ１的 ＯＲＦ 能够编码具有结合与催
化几丁质水解功能的 ＧＨ１８几丁质酶ꎮ
　 　 ＧＨ１８几丁质酶划分以 ＣａｔＤ 内几丁质酶插入
区(ＣＩＤ)有无为标准ꎮ 约有 ７０－９０个残基的 ＣＩＤ区
域插入到 ＣａｔＤ (β / α)８ＴＩＭ桶状结构的 β７链和 α７
螺旋间ꎮ(α＋β)折叠插入区位于(β / α)８ＴＩＭ桶状
Ｆｉｇ. ７　 Ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｄｅｄｕｃｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｏｆ ＴＩＣｈｉ４６ ｆｒｏｍ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ ＨＢＦ１
Ｔｈｅ ｄｅｄｕｃｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｓ ｓｈｏｗｎ ｉｎ ｏｎｅ￣ｌｅｔｔｅｒꎬｔｈｅ ｉｎｔｒｏｎｓ ａｒｅ ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｌｉｎｅｓꎬ
ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｉｔｉｎ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ (ＣＩＤ) ｉｓ ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｄａｓｈｅｄ ｌｉｎｅ.
９７

　
植物病理学报 ４６卷
结构的顶端ꎬ形成隧道状底物结合裂解区ꎮ 而
没有插入区的几丁质酶有一个底物结合凹槽ꎮ
底物结合凹槽构造不同导致有 ＣＩＤ 几丁质酶外
切活性和无 ＣＩＤ 几丁质酶内切活性的形成 [２４] ꎮ
由于ＣａｔＤＴ ｌＣｈｉ４６有几丁质酶插入区(图 ７) ꎬ该酶
可能是外切型几丁质酶ꎮ 这一假设还需进一步
验证ꎮ
Ｓｉｇｎａｌ Ｐ在线预测 ＯＲＦ ＨＢＦ１ 编码蛋白 Ｎ 端
的信号肽序列ꎮ ＴｌＣｈｉ４６ 信号肽由 ２２ 个氨基酸残
基组成ꎬＮ、Ｈ、Ｃ区域分别包含 ３、１２、７ 个氨基酸残
基ꎮ 信号肽酶裂解位点位于 Ａｌａ２２￣Ｓｅｒ２３(Ｃ￣ｓｃｏｒｅ ＝
０.３６７ꎬ基于 ＳｉｇｎａｌＰ￣ｎｏＴＭ算法的神经网络模式)ꎮ
ＴｌＣｈｉ４６的信号肽具有产生几丁质结合和水解活
性的成熟胞外酶的作用ꎮ
Ｆｉｇ. ８　 Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ＴｌＣｈｉ４６ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｆｕｎｇｉ
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ (ＡＣＺ６３２６８.１)ꎬ Ｔ. ｇｈａｎｅｎｓｅ (ＡＤＦ５７３０９.１)ꎬ Ｔ. ｐｓｅｕｄｏｋｏｎｉｎｇｉｉ (ＢＡＢ４０５９４.１)ꎬ
Ｔ. ｃｉｔｒｉｎｏｖｉｒｉｄｅ(ＡＤＦ５７３１０.１)ꎬ Ｔ. ｓａｔｕｒｎｉｓｐｏｒｕｍ(ＡＤＢ８９２２０.１)ꎬ Ｔ. ｖｉｒｉｄｅ (ＢＡＢ４０５９３.１)ꎬＴ. ｈａｍａｔｕｍ(ＡＡＣ６０３８５.１)ꎬ
Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ(ＣＡＪ５７４２９.１)ꎬ Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｃｏｎｆｒａｇｏｓａ(ＡＦＲ１３０５２.１) . Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｍｏｔｉｆｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ
ａｎｄ ｃａｔａｌｙｓｉｓ ａｒｅ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｂｙ ｒｅｄ ｂａｒｓ. Ａｒｅａｓ ｓｈａｄｅｄ ｉｎ ｂｌａｃｋ ａｒｅ ｈｉｇｈ ｄｅｇｒｅｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ (１００％) ꎬａｒｅａｓ ｓｈａｄｅｄ ｉｎ ｒｅｄ
ａｒｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ７５％ꎬ ｉｎ ｇｒｅｅｎ ａｒｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ５０％ꎬａｎｄ ｕｎｓｈａｄｅｄ ａｒｅａｓ ａｒｅ ｒｅｇｉｏｎｓ
ｏｆ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｃｈｉｔｉｎａｓｅｓ.
０８

　
　 １期 朱先婷ꎬ等:寄生于南方根结线虫卵的长梗木霉几丁质酶基因 ＴｌＣｈｉ４６的克隆
Ｆｉｇ. ９　 Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｓｈｏｗｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ＴｌＣｈｉ４６ ｆｒｏｍ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ
ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ ＨＢＦ１ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｃｈｉｔｉｎａｓｅｓ
Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＴｌＣｈｉ４６ ｆｒｏｍ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ ＨＢＦ１ ｉｓ ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ.
２.６　 不同来源的几丁质酶系统进化分析
　 　 从 ＧｅｎＢａｎｋ 中筛选 １６ 条不同来源的几丁质
酶序列ꎬ经 ＭＥＧＡ４.０.２ 软件 Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ 比对ꎬ用邻
接法构建系统发育树ꎬ分析 １ ０００ 次比对后的
Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ值确定不同来源几丁质酶的进化距离ꎮ
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ (ＧｅｎＢａｎｋ: ＮＰ＿８２６８１３.１)
作为系统发育树的外群ꎮ
图 ９表明ꎬ不同来源的几丁质酶聚到 ２个大的
分支上ꎮ Ｉ分支主要是由菌寄生菌组成ꎬ木霉属真
菌既可防治植物病原菌ꎬ又可防治线虫ꎮ ＩＩ 分支主
要是由绿僵菌和虫生真菌组成昆虫寄生菌ꎮ
Ｔ. ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ ＨＢＦ１ 几 丁 质 酶 ＴｌＣｈｉ４６ 和
Ｔ. ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ(ＧｅｎＢａｎｋ:ＡＣＺ６３２６８.１)聚到同
一分支ꎬ说明两者的亲缘关系很近ꎮ 同种几丁质酶
基因的丰余性反映发生进化的几丁质酶功能的多
样性[２５]ꎮ
３　 讨论
木霉菌在根、土壤环境中是非常活跃的腐生性
真菌ꎬ已成功用于防治真菌、无脊椎动物和细菌为
主的土传植物病害[２６]ꎬ并可抑制根结线虫属的种
群数量[１３]ꎬ其开发利用可为农业病虫害的生物防
治开辟广阔的应用前景ꎮ 复杂且多层结构的线虫
卵壳在抵御杀线剂和生防制剂中发挥重要作用[２]ꎬ
但是线虫卵壳也可以成为具有强大酶解能力的微
生物的侵染位点ꎮ 食线虫真菌和木霉菌中已克隆
出多种几丁质酶基因[９ꎬ１０ꎬ １８ꎬ１９]ꎬ与重寄生过程有关
的哈茨木霉几丁质酶基因的调节作用已被
明确[１７]ꎮ
本研究通过培养性状、形态学和 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ、
ｔｅｆ１￣α序列分析鉴定的长梗木霉 ＨＢＦ１ 菌株ꎬ既可
以产生几丁质酶又可以寄生南方根结线虫卵ꎬ是一
株具有良好生防潜力的真菌ꎮ 卵和真菌相互作用
的显微观察表明ꎬＨＢＦ１ 菌寄生线虫卵的特征包括
卵被菌丝包裹、附着胞状结构的形成、卵内菌丝的
营养生长和卵内容物外泄ꎬ与棘孢木霉寄生爪哇根
结线虫卵的特征一致[１６]ꎮ 该菌对南方根结线虫卵
的寄生率为 ８０.４５％ꎬ与 Ｌｉｎ 等[２７]报道的高效菌株
Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｉｍｐｌｉｃａｔｕｍ对南方根结线虫卵的寄生
率为 ８２.１１％基本相符ꎮ 本研究中ꎬ长梗木霉 ＨＢＦ１
菌株在第 ６ ｄ表现出较高的几丁质酶活性ꎬ直到第
１６ ｄ 仍处于较高的活性水平ꎬ说明该酶具有较强
的耐蛋白酶解特性ꎮ 胞外几丁质酶的活性与卵寄
生率正相关ꎬ说明 ＨＢＦ１菌株产生的几丁质酶在侵
染线虫卵中发挥重要作用ꎮ 在重寄生关系中
Ｃｈｉ１８￣５几丁质酶可以由几丁质降解产物诱导[１９]ꎮ
１８

　
植物病理学报 ４６卷
Ｃｈｉ１８￣５可以降解外源的几丁质来满足营养需求而
不仅仅直接参与重寄生过程[２８]ꎮ 这个功能和本研
究结果并不矛盾ꎬＨＢＦ１ 几丁质酶可以降解南方根
结线虫卵壳的几丁质层来供给营养ꎬ有利于 ＨＢＦ１
菌株穿透线虫卵壳在卵内定殖ꎬ从而寄生线虫卵阻
碍线虫卵的孵化ꎮ
本研究通过简并引物设计和 ＲＡＣＥ 技术ꎬ从
ＨＢＦ１菌株中克隆得到几丁质酶基因ꎮ 序列分析
表明 ＴｌＣｈｉ４６ 有 ＧＨ１８ 家族几丁质酶的典型特征ꎮ
２２个氨基酸残基信号肽的存在表明 ＴｌＣｈｉ４６ 是一
种胞外酶ꎬ与真菌分泌的大多数几丁质酶的共有特
征一致ꎮ 多序列比对表明 ２ 个催化水解区域
( ８８ＳＩＧＧＷ９２、１２４ ＦＤＧＩＤＩＤＷＥ１３２ )在 ＧＨ１８ 家族几
丁质酶的氨基酸序列中高度保守(图 ８)ꎬ说明这 ２
个区域在几丁质酶的结构和活性中发挥重要作用ꎮ
定点诱变试验[２３] 和晶体学数据[２９] 表明ꎬ ＦＤＧＩ￣
ＤＩＤＷＥ序列中保守的谷氨基酸残基(Ｅ)很有可能
作为质子给予体参与了催化机制ꎮ 在 ＰＲＯＳＩＴＥ 数
据库中ꎬ真菌 ＧＨ１８家族几丁质酶活性共有序列特
征是[Ｌ / Ｉ / Ｖ / Ｍ / Ｆ / Ｙ] －[Ｄ / Ｎ] －Ｇ－[Ｌ / Ｉ / Ｖ / Ｍ /
Ｆ]－[Ｄ / Ｎ]－[Ｌ / Ｉ / Ｖ / Ｍ / Ｆ]－[Ｄ / Ｎ]－ｘ－Ｅ(ＰＲＯＳ￣
ＩＴＥꎬ ＰＳ０１０９５)ꎬ而残基 Ｅ 是活性位点残基ꎮ 活性
位点残基 Ｄ和 Ｅ 高度保守ꎬ对于几丁质酶活性是
必须的ꎮ
编码几丁质酶的基因家族庞大ꎬ来自同种或不
同种家族的几丁质酶基因已发生变异ꎮ ＴｌＣｈｉ４６
和其他真菌几丁质酶的序列一致性 ６７％ ~ ９９％ꎬ但
它们都有共同的底物结合与催化区域(图 ８)ꎮ 系
统发育树(图 ９)表明 ＴｌＣｈｉ４６ 和菌寄生菌聚到一
支ꎬ而和虫寄生菌的亲缘关系较远ꎬ说明该菌产生
的几丁质酶在侵染植物病原线虫方面和重寄生菌
的功能相似ꎮ 具有深度催化裂解的高度保守的几
丁质酶可以和几丁质紧密结合ꎬ木霉属不同种之间
几丁质酶基因的微小改变与酶的持续合成能力有
关ꎬ与底物专一性没有关系[３０]ꎮ
本研究首次从寄生于南方根结线虫卵的长梗
木霉 Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ ＨＢＦ１ 菌株中克
隆到几丁质酶 ＴｌＣｈｉ４６ 基因ꎬ并阐明 ＴｌＣｈｉ４６ 的氨
基酸序列以及和其他 １８ 家族几丁质酶的亲缘关
系ꎮ 长梗木霉的几丁质酶 ＴｌＣｈｉ４６ 具有供进一步
研究的功能域ꎬＴｌＣｈｉ４６ 可以作为新的生防分子抵
御南方根结线虫ꎮ
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[２７] Ｌｉｎ Ｓꎬ Ｗｕ Ｘꎬ Ｃａｏ Ｊ Ｚꎬ ｅｔ ａｌ. Ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ
ｃｈｉｔｉｎａｓｅ￣ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｎｅｍａｔｏｐｈａｇｏｕｓ ｆｕｎｇｕｓ Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ
ｉｍｐｌｉｃａｔｕｍ ａｇａｉｎｓｔ Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｉｎｃｏｇｎｉｔａ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ)
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[２９] Ｔｅｒｗｉｓｓｃｈａ ｖａｎ Ｓｃｈｅｌｔｉｎｇａ Ａ Ｃꎬ Ｋａｌｋ Ｋ Ｈꎬ Ｂｅｉｎｔｅｍａ
Ｊ Ｊꎬ ｅｔ ａｌ. Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｈｅｖａｍｉｎｅꎬ ａ ｐｌａｎｔ ｄｅ￣
ｆｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ ａｎｄ ｌｙｓｏｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙꎬ ａｎｄ
ｉｔｓ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ [ Ｊ] . Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅꎬ １９９４ꎬ２
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[３０] Ｉｈｒｍａｒｋ Ｋꎬ Ａｓｍａｉｌ Ｎꎬ Ｕｂｈａｙａｓｅｋｅｒａ Ｗꎬ ｅｔ ａｌ.
Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ
ｃｈｉｔｉｎａｓｅｓ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｍｙｃｏｐａｒａｓｉｔｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ[Ｊ] .
Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｏｎｌｉｎｅꎬ ２０１０ꎬ６:１－２６.
责任编辑:于金枝
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