全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 41(6): 645-648(2011)
收稿日期: 2010-12-02; 修回日期: 2011-09-30
基金项目: 国家自然科学基金(30970133)、高等学校博士学科点基金(20100204110004)和高等学校学科创新引智计划(B07049)
通讯作者: 吴云锋, 教授, 主要从事植物病毒方面的教学和研究; Tel: 02987092716, Fax: 02987092716, E-mail:wuyf@nwsuaf. edu. cn。
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췍研究简报
三叶草绿变病植原体的分子鉴定
李正男, 刘 萍, 吴云锋*
(旱区作物逆境生物学国家重点实验室 植保资源与病虫害治理教育部重点实验室 西北农林科技大学植物保护学院, 杨凌 712100)
Molecular detection and identification of a phytoplasma associated with Clover
phyllody　 LI Zheng-nan, LIU Ping, WU Yun-feng　 (State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas
and Key Laboratory of Plant Protection Resources and Pest Management, Ministry of Education, College of Plant Protection,
Northwest A&F University, Yangling 712100, China)
Abstract: Clover phyllody, suspected to be infected by phytoplasma, was observed in Yangling, Shaanxi
Province. Using phytoplasma universal 16S rRNA primer pairs R16mF2 / R16mR1 and R16F2n / R16R2, the
1. 2 kb product of expected size was amplified from clover exhibiting symptoms of phyllody. GenBank
BLASTn analysis revealed that the phytoplasma shared highest similarity with members of 16SrV-B subgroup.
Phylogenetic tree analysis indicated that the clover phytoplasma clustered together with the phytoplasmas of
16SrV-B subgroup. To our knowledge, this is the first report of phytoplasmas belonged to Elm Yellows group
infecting clover in China.
Key words: phytoplasma; Trifolium pratense Linn. ; nested PCR; phylogenetic tree
文章编号: 0412-0914(2011)06-0645-04
　 　 三叶草(Trifolium pratense Linn. )为车轴草
属,蝶形花科多年生草本植物,原产亚洲南部和欧
洲东南部,是一种世界性分布与栽培的优良牧草。
因其花叶兼优、草姿美、绿期长而具有较高的观赏
价值,近几年作为草坪用草被广泛种植。 在自然条
件下,三叶草很容易受到不同种植原体的侵染,国
外已报道的侵染三叶草的植原体有:三叶草绿变植
原体(Clover phyllody phytoplasma,CPh)和三叶草
增殖植原体(Clover proliferation phytoplasma,CP)
等,这些植原体分别属于 16SrI组和 16SrⅥ组[1,2]。
三叶草绿变现象在三叶草种植区普遍发生,为探究
其发生原因,本研究拟采用分子生物学方法对田间
采集到的表现绿变症状的三叶草植株进行植原体
16S rDNA序列的测定,明确其分类地位。
1　 材料和方法
1. 1　 材料来源
表现花器绿变症状的三叶草和无症状的三叶
草均采自杨凌地区草坪。
1. 2　 植物总 DNA的提取
参考 Gu 等[3] 的方法提取总 DNA, 并于
-20℃冰箱保存备用。
1. 3　 PCR扩增、克隆及序列测定
利用 Lee等[4,5]设计的植原体 16S rRNA基因
通用引物,通过巢式 PCR的方法扩增其 16S rRNA
基因。 直接 PCR 以植物总 DNA 为模板, 以
　
植物病理学报 41 卷
R16mF2 ( 5′-CATGCAAGTCGAACGGA-3′) 和
R16mR1 ( 5′-CTTAACCCCAATCATCGAC-3′) 为
引物进行扩增。 以枣疯病( Jujube witches′-broom,
JWB)病株总 DNA 为阳性对照,健康三叶草总
DNA为阴性对照,以超纯水为空白对照。 PCR 反
应体系为 50 μL,其中 10 × buffer(无MgCl2)5 μL,
0. 25 mol / LMgCl2 5 μL,2. 5mmol / L dNTP4 μL,模
板 DNA20 ng,10 pmol / L引物各 4 μL,TaqDNA聚
合酶 0. 4 μL,灭菌去离子水 23. 6 μL。 反应程序
为:94℃预处理 3 min,变性温度 94℃,复性温度
50℃,延伸温度 72℃,共 30 个循环。 前 5 个循环
变性 1 min,复性 1 min,延伸 1 min;后 25 个循环变
性 30 s,复性 1 min,延伸 2 min,最后 72℃延伸 10
min。 然后以此扩增产物稀释 30 倍后为模板,用引
物对 R16F2n(5′-GAAACGCTGCTAAGACTGG-3′)
和 R16R2 ( 5′-TGACGGGCGGTGTGTACAAAC-
CCCG-3′)进行巢式 PCR。 反应体系和扩增条件同
直接 PCR,只是退火温度升高至 52℃。 1%琼脂糖
凝胶电泳检测 PCR产物。
PCR扩增产物通过 Bio Teke 公司生产的快捷
型琼脂糖 DNA 回收试剂盒纯化回收,克隆入
PMD18-T载体(TaKaRa 公司)中,通过 PCR 和酶
切鉴定后,选取 5 个阳性克隆进行测序,序列测定
委托北京奥克生物技术有限公司完成。
1. 4　 序列分析
利用国际基因数据库 GenBank 中的 BLAST
程序对测序结果进行相似性检索,通过 MEGA4. 0
软件进行相似性比较和进化树的构建。
2　 结果与分析
2. 1　 三叶草绿变植株症状表现
感病植株表现为头状花序完全绿变,单个白色
小花特化为绿色小叶,花柄膨大畸形(图 1)。
2. 2　 16S rDNA序列的扩增结果
三叶草绿变植株总 DNA的巢式 PCR产物,经
1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增出长度约为 1. 2 kb
的预期产物(图 2)。 从阳性对照枣疯病( JWB)植
原体中也扩增到了相同大小的片段,而从双蒸水和
健康三叶草中未扩增出特异条带。 这说明了植原
体存在于表现绿变症状的三叶草植株内。 将此植
原体命名为三叶草绿变植原体杨凌分离物(Clover
phyllody-yangling, Cph-yangling)。
Fig. 1　 Symptoms of Clover phyllody
Fig. 2 　 PCR amplification of 16S rDNA from
phytoplasma associated with Clover
phyllody
M: DNA Marker V; 1: Double distilled water as blank con-
trol; 2: DNA from healthy clover plants as negative control;
3: 16S rDNA of phytoplasma associated with Clover phyll-
ody; 4: 16S rDNA of phytoplasma associated with paulownia
witchesp broom as positive control .
2. 3　 植原体 16S rDNA基因片段的序列分析
通过对 5 个阳性克隆菌液进行测序,确定了
CPh-yangling的 16S rDNA序列含有 1 248 个核苷
酸,(G + C)含量为 45. 83% ,GenBank 登录号:
646
　
　 6 期 　 李正男,等:三叶草绿变病植原体的分子鉴定
FJ436792。 经 BLAST 在 GenBak 中进行同源搜
索,发现该株系与枣疯病植原体(FJ154844),樱桃
致死性黄化植原体(AY197659)均具有非常高的
相似性,说明该株系可能为榆树黄化组中的一员;
通过 DNAMAN 软件进行比对发现,CPh-yangling
与上述 2 个株系在第 7、8、111、609、1125 位发生碱
基的颠换 ( A-G、 C-T、 C-T、 A-G、 G-A) , 但与
AY197659 在第 795 位发生了碱基的颠换(T-C)而
与 FJ154844 在第 795 位碱基是相同的,与 2 个株
系的同源率分别为 99. 60%和 99. 52% 。
2. 4　 系统进化树构建
将获得的序列与榆树黄化组 ( EY 组,16Sr
Ⅴ))各亚组成员的 16S rDNA序列进行比较,利用
MEGA4. 0 软件构建系统发育进化树(图 3)。 从图
中可以看出 CPh-yangling 与 16SrⅤ-B亚组的枣疯
病(AY197661)、桃黄化 (AY197660)、纸桑丛枝
(AY576685)、樱桃致死性黄化(AY197659)聚集
为一簇,从而表明该分离物为 16SrⅤ-B亚组成员。
3　 讨论
本研究利用植原体 16S rRNA基因的通用引
物,通过巢式 PCR 的方法获得了 1 248 bp 的目标
片段,表明自然表现绿变症状的三叶草中存在植原
体,在此之前国内未见有植原体感染三叶草并造成
病害的报道。
本试验通过对植原体 16S rRNA 基因的核苷
酸相似性比较,发现该分离物与 16SrⅤ组的核苷
酸同源率均在 99%以上,与 16SrⅤ-B 亚组中的枣
疯病植原体( JWB)同源率高达 99. 60% ,故可将
CPh-yangling初步划分于 16SrⅤ-B 亚组,而三叶
草绿变病是否存在植原体的复合侵染还需要进一
步研究。 枣疯病病株在杨凌周边非常普遍,CPh-
yangling与 JWB 之间的关系还有待进一步研究,
目前还不能确定我国三叶草绿变病的传播介体。
CPh-yangling与 JWB 的 16S rRNA 基因间有高度
一致性,可以在这两种植物上取食危害的叶蝉、飞
虱类昆虫很可能是它们的共同传播介体。
参考文献
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Fig. 3　 Phylogenetic tree based on 16S rDNA nucleotide sequence of phytoplasmas
associated with Clover phyllody and other 11 EY phytoplasmas
746
　
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1991, 57:3565 -3569.
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organisms [J] . Phytopathology,1993, 83: 834 -842.
责任编辑:
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