全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
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基金项目$国家自然科学基金新疆联合基金"
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作者简介$毕研飞"
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#!男!在读硕士研究生!主要从事园艺作物遗传育种与生物技术研究
3)45.6
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57+897+:0
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通信作者$钱春桃!博士!副教授!主要从事园艺作物遗传育种与生物技术研究
3)45.6
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:;70<5=
>!
0
-
57+897+:0
甜瓜蔓枯病抗性鉴定及
1!2
基因表达分析
毕研飞#!郭
!
静#!徐兵划#!张永兵!!伊鸿平!!钱春桃#"!陈劲枫#
"
#
南京农业大学 园艺学院作物遗传与种质创新国家重点实验室!南京
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!
新疆农业科学院 哈密瓜研究中心!乌鲁木齐
1%""""
#
摘
!
要$以甜瓜感病品种(白皮脆)*单基因抗源"
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#和聚合抗源
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和
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#为材料!采用梯度浓度蔓枯病菌孢子液接种鉴定以及
AB)?CA
技术!研究不同材料蔓枯病抗性表现以及抗蔓枯病基因"苯丙氨酸解氨酶基因!
!"#
#在不同材料及不同组
织中的表达情况结果显示$当接种蔓枯病菌孢子液浓度为
$D#"
& 个%
4E
时!单基因抗源已开始出现感病现象!
而聚合基因抗源仍表现为高抗或抗!其中
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"
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#抗性显著高于单基因抗源亲本和其它聚
合抗源材料!表现为高抗"
$%
#
#+"
#抗蔓枯病基因
!"#
在不同抗性材料根*茎*叶中的表达均呈先上调而后下降
并趋于稳定的变化趋势!但变化快慢和幅度均不同研究表明!甜瓜抗蔓枯病基因的聚合能够提高其对蔓枯病的
抗性!但不同抗病基因聚合后的抗性表现存在一定差异&抗蔓枯病基因
!"#
的表达与甜瓜蔓枯病抗性有密切关
系!其表达时间与表达量差异可能是影响不同材料抗病能力差异的重要因素&该研究鉴定筛选的高抗蔓枯病材料
#($)(,#
可用于甜瓜的抗蔓枯病聚合育种
关键词$甜瓜&聚合基因&抗性鉴定&苯丙氨酸解氨酶基因&表达分析
中图分类号$
F,1&
文献标志码$
G
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34"45-65)*&12
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N
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U54.9.0
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X
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蔓枯病"
N
744
X
/<84S6.
N
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#又称黑腐病!是影
响瓜类蔬菜生产的重要病害之一!它可以危害甜瓜*
黄瓜*西瓜*西葫芦等作物!大田发病率可达
!"^
"
%"^
!在连作地或温室高达
1"^
!病害严重的年份
常常会造成毁灭性减产+#)$,目前!生产上防治蔓枯
病的常用方法是化学防治!但化学防治效率低*易造
成环境污染另外!在公众食品安全意识日益强化
的社会背景下!使用化学农药防治蔓枯病的方法已
经越来越不适宜现代农业生产因此!筛选抗病资
源具有重要的生态价值和经济价值
国内外针对瓜类蔓枯病抗病资源鉴定的研究较
多!筛选获得了多份抗病材料戴富明等+*,对
!"
份
来自美国和中国的西瓜品种进行人工接种抗病性鉴
定!发现从美国引进的
GK
*
GV
*
GM
对蔓枯病的抗性
较强王晓东等+,,对新疆
#,
个哈密瓜品种进行抗
蔓枯病鉴定!筛选到(新蜜杂
#
号)和(新蜜
#&
号)
!
个抗蔓枯病品种李英等+1,从
!*
份黄瓜材料中筛
选出
(
份"酸黄瓜*(朝优
%
号)以及
!
个酸黄瓜回交
后代
QQ#)1)$,
和
QQ#)1)!
#对蔓枯病有较高抗性
的材料
[8;08U
等+&,对田间
1$#
个黄瓜品系进行
蔓枯 病 抗 性 鉴 定!获 得
?@!""1#$
*
GA,&),$
和
BU50/548U.:5
等
&
个高抗品系
Z=6
X
M5;0
等+#",
通过田间和温室接种鉴定了
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份甜瓜资源!并从
中筛选出
(
份高抗材料 "
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*
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*
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*
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#
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等+##,通过接种鉴定
筛选出了
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*
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和
?@!$(,((
等
#"
个
抗病西瓜种质
蔓枯病病原菌+
/*0
1
),--234
1
.5*2,
"
G78U)
/#,存在生理小种的分化!若品种仅携带单个抗病
基因!则会导致其抗性降低甚至失去抗性+#!)#(,相
关研究表明!不同抗性基因的聚合有助于提高作物
的抗性和抗谱+#$)#1,因此选育聚合抗源是提高甜瓜
抗蔓枯病的有效途径之一然而!有关甜瓜不同聚
合抗源抗性的鉴定及筛选还鲜见报道抗蔓枯病基
因
!"#
的表达与植物的抗病性密切相关!当植物
受到病原菌侵染时
!"#
被诱导表达!以提高植物
的抗性!且其表达时间和表达量与植物抗性呈正相
关+#&)!!,但目前关于甜瓜
!"#
的研究较少!且主
要集中从生理生化角度研究不同诱导条件下其酶活
性变化!而从分子水平进行甜瓜
!"#
基因在蔓枯
病菌胁迫条件下表达特性的研究还未见报道
本实验通过对
$
份单基因抗源和
*
份聚合抗源
材料进行甜瓜苗期蔓枯病菌的梯度接种鉴定!并利
用
AB)?CA
技术对抗蔓枯病基因
!"#
在不同抗性
材料中的差异表达进行分析旨在筛选抗性显著提
高的聚合抗源!揭示其抗性提高的相关分子机制!为
甜瓜抗蔓枯病聚合育种提供理论依据
#
!
材料和方法
A+A
!
甜瓜抗源材料和接种菌株
$
份甜瓜单基因抗源材料
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*
?@#$,"1!
*
?@$##1&"
*
?@(1!%&1
和
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!分别含有抗病基
因
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*
6+37!
*
6+37%
*
6+3)(
+
#"
,和
6+3)*
+
!%
,
!其中
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*
?@#$,"1!
*
?@$##1&"
和
?@(1!%&1
由美国
康乃尔大学
Z=6
X
M=;0
教授提供!
?@(!"#($
是由本
课题组的
M=/8
T
;
等筛选得到!并命名为
6+3)*

*
份聚合基因材料分别由
$
份单基因抗源杂交并结合
相关分 子标 记筛 选获 得$
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"
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?@$##1&"
#*
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"
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#*
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"
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#*
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"
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?@#$,"1!
#*
#($)1&"
"
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#和
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"
?@$##1&"D?@(1!%&1
#感病品种(白皮脆)!由
项目合作单位新疆农业科学院提供
!"#%
年春季"
%
月
#"
号#*秋季"
1
月
#
号#在南
京农业大学人工气候室内进行育苗将种子消毒*
浸种后!
1_
催芽!挑选饱满*整齐一致的播种于
,!
孔穴盘中育苗期间平均昼%夜温度为
!( _
"
!1_
%
#,_
"
#&_
!光合有效辐射
$""
#
4=6
-
4
!
-
/
#
!相对湿度维持在
*"^
"
,"^
待幼苗第
一片真叶展平时!挑选长势较好且一致的植株移栽
至
#!:4D#":4D1:4
"口径%底径%高#营养钵中!
每钵
#
株基质由草炭*蛭石"
8`8a#`#
#混合
而成
试验用蔓枯病菌为本实验室分离纯化并保存的
G
型菌株!参照李英等+!(,的方法进行产孢培养用
解剖针挑取菌丝接种于
?bG
培养基平板的中央!
"(!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
表
A
!
防卫基因表达分析的引物序列及产物大小
B5S68#
!
?U.48U/8
>
780:8/509
T
U=97:X
8]
T
U8//.=05056
X
/./=J98J80/8
N
808/
基因
K808
登录号
K80H50d5::8//.=0
引物序列
?U.48UV8
>
780:8
扩增长度
?U=97:<680
N
<;
%
S
T
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$e)CBCCGCBGBCGBKCCGKCKBGB)%e
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$e)KBKGBKKBKBKGKBCGCGCBKBBC)%e
$e)GCKGCCGKCGGKKBCCGGGC)%e
1!
经
!$_
黑暗培养
,9
后!再在
("[
紫外灯下
%"
:4
间歇照射
(9
"
#!;
紫外%
#!;
黑暗#产生孢子
在显微镜下利用血球计数板将分生孢子悬浮液配成
$D#"
$ 个%
4E
*
$D#"
, 个%
4E
和
$D#"
& 个%
4E
备用
A+B
!
试验方法
A+B+A
!
苗期梯度接种鉴定
!
完全随机设计!试验材
料分为
G
*
H
*
C
等
%
组!每组每份材料
%$
株!均种植
于南京农业大学园艺学院牌楼试验基地温室内参
照
P;50
N
等+#!,的方法!待幼苗长到
%
"
(
片真叶时
进行人工喷雾接种!用微型喷雾器对
%
组分别喷洒
浓度为
$D#"
$
*
$D#"
, 和
$D#"
& 个%
4E
的蔓枯病
病菌孢子悬浮液接种后覆盖塑料棚膜遮光密闭!
相对湿度保持
&!^
"
&$^
!温度
!%_
"
!,_
!
%9
后揭开棚膜!于
,
和
#"9
调查统计病情
叶片侵染分级标准$
"
级
+
无可见侵染&
#
级
+
老
叶上边缘坏死或斑点
#
#"44
!新叶无病&
!
级
+
老
叶同上!新叶边缘坏死&
%
级
+
所有叶均有感染!叶坏
死面积
#
!$^
&
(
级
+
叶坏死面积
$
!$^
!
%
$"^
&
$
级
+
叶坏死面积
$
$"^

根据平均病情级别数"
$%
#确定蔓枯病抗性级
别$高抗"
QA
#
+$%
#
#+"
&抗"
A
#
+#+"
%
$%
#
!+"
&中
抗"
ZA
#
+!+"
%
$%
#
%+"
&感"
V
#
+%+"
%
$%
#
(+"
&高
感"
QV
#
+$%
&
(+"
平均病级计算公式$
$%a

"级值
D
株数#%总株数
根据接种鉴定结果!选取能准确区分聚合基因
材料和单基因抗源材料抗性差异的接种浓度进行再
次苗期接种!并于接种后
"
*
#!
*
!(
*
(1
*
,!;
!及
$
和
,9
取样!样品取后立即放入液氮速冻!置于
,"_
超低温冰箱保存备用每一时间点的样品进行
%
次
独立生物学重复
A2B2B
!
引物设计*
$C=
提取和
*DC=
合成
!
从
K80H50d
中"
;<<
T
$%%
\\\+0:S.+064+0.;+
N
=Y
%#搜
索苯丙氨酸解氨酶基因+
&:),-.
"
:50<56=7
T
8
#
T
56
4ARG
,的
4ARG
序列!利用
?U.48U*+"
软件设计
引物并由英潍捷基"上海#贸易有限公司合成!内参
基因参照
@/65436)V;5Ud5X
+
!$
,
"表
#
#利用
ARG
提取试剂盒"天根生化科技有限公司#提取总
ARG
!
并用
bR5/8
$
除去基因组
bRG
利用反转录试剂
盒"
B5d5U5
公司#进行反转录得到
:bRG
用于基因
的特异性表达分析!方法参照试剂盒说明书
A2B2E
!
4$C=
的
$FGHI$
扩增
!
利用
VIHA
KU880
试剂盒"
B5d5U5
公司#进行实时荧光定量
?CA
分析
!$
#
E
反应体系为
VIHA
%
?U84.]
"
!
D
#
!+$
#
E
!上下游引物"
!+$
#
4=6
-
E
#
#各
"+1
#
E
!
:bRG#+"
#
E
!
99Q
!
L&+&
#
E
!每个样本进行
%
次技术重复
AB)?CA
反应条件为
&$_
预变性
%"
/
!
&$_
变性
$/
!
*"_
退火
!"/
!
*$_
延伸
%"/
!进
行
("
个循环!在
*$_
延伸步骤收集荧光信号最
后!采用
!

&&
&
B法进行相对定量数据分析
!
!
结果与分析
B+A
!
不同抗性基因聚合后的抗病表现
不同抗性植株春*秋季的病级统计结果见表
!
!
当接种浓度为
$D#"
$ 个%
4E
时!只有感病品种(白
皮脆)出现病症!单基因抗源和聚合抗源都无发病症
状当接种浓度为
$D#"
, 个%
4E
时!
?@#$,"1!
平
均病级"
$%
#为
!+"
!表现为中抗!其他单基因抗源
$%
为
#+%
"
#+*
之间!表现为抗!而聚合抗源
#($)
(,#
*
"1!)1&"
*
1&")%&1
和
"1!)%&1
的平均病级
$%
#
#+"
!表现为高抗当接种浓度为
$D#"
& 个%
4E
时!不同抗源出现不同等级的病症!其中单基因抗源
?@(!"#($
与
?@#("(,#
的平均病级分别为
%+"
"
%+*
!表现为感病!而聚合抗源
#($)(,#
"
?@(!"#($D
?@#("(,#
#的平均病级为
"+%&
"
"+$#
!仍表现为高
抗!抗性显著高于单基因抗源亲本
B+B
!
防卫基因的表达分析
选取抗病基因聚合后抗性显著提高的聚合抗源
#($)(,#
"
?@(!"#($D ?@#("(,#
#*单 基 因 抗 源
?@(!"#($
*
?@#("(,#
和感病品种(白皮脆)为材料!
利用实时荧光定量
?CA
"
A856)<.48?CA
#技术!以
&)7"(9*5
为内参基因!分析
!"#
基因在甜瓜幼苗
根"图
#
!
G
#*茎"图
#
!
H
#*叶"图
#
!
C
#中的表达情
况结果表明!
!"#
在根*茎*叶中均有表达!但表
#(!
!
期
!!!!!!!!!!!!!
毕研飞!等$甜瓜蔓枯病抗性鉴定及
!"#
基因表达分析
表
B
!
接种鉴定结果统计"
$%
#
B5S68!
!
3/<.45<.=0=J9./85/8U5<.0
N
"
$%
#
材料
Z5<8U.56
接种不同浓度"个%
4E
#菌液不同季节测定的
$%
B;8$%=J45<8U.56.0=:765<89\.<;
N
U59.80T
=U8/.09.JJ8U80$D#"
$
春
V
T
U.0
N
秋
G7<740
$D#"
,
春
V
T
U.0
N
秋
G7<740
$D#"
&
春
V
T
U.0
N
秋
G7<740
白皮脆
H5.
T
.:7. %+!"g"+#$# %+("g"+#1% %+*"g"+!"" %+&"g"+!#! (+,"g"+!$# (+&"g"+!%1
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内变化不大!
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时快速下降!
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时降至最低!但
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倍!
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低于
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*
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根中
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表达的变
化趋势基本一致!都在
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时达到最高峰!但峰值
却不同!
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分别为
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和
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的
#+$
倍和
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倍不同抗性材料茎中
!"#
表达变
化趋势基本一致!先上调!
(;
时达到最高峰!然后
下调!但变化幅度具有明显差异茎中表达量达到
最高峰时"
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*
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和
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分别为对照的
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倍*
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倍*
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倍和
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倍聚合抗源
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叶片中
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表达在
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时
达到最高峰!为对照的
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倍!而 (白皮 脆)*
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和
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在
!(;
时达到最高峰!分别
为对照的
!$
倍*
#(+!
倍和
#!
倍接种后!不同抗
性甜瓜中
!"#
的表达量均高于对照!且与感病品
种白皮脆相比!抗源中的表达量始终相对较高
%
!
讨
!
论
传统的甜瓜抗蔓枯病苗期接种鉴定孢子液浓度
为
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$ 个%
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!可以有效区分出抗*感材料的差
异!但不能准确区分抗性材料之间的差异+#!!*,本
研究利用
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$
*
$D#"
, 和
$
D#"
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#进行梯度接种鉴定实验!以准确鉴定
单基因抗源与聚合抗源以及不同聚合抗源之间的抗
性能力的差异结果表明!单基因抗源对不同蔓枯
病菌表现出一定程度的选择性抗性!而聚合抗源却
!(!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
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卷
一直表现为抗病!说明聚合基因可以提高甜瓜的抗
性与抗谱!这与
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朱明涛等+#,,在番茄方面的研究结果相一致另外!
不同聚合抗源之间的抗性表现也存在一定差异!
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对不同浓度病原菌抗性表现基本一致!均
为高 抗
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和
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时均表现为高抗!
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和
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表现为抗!而
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和
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表现为中抗本研究筛选到的聚合抗源
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可作为甜瓜优质*抗病和高产育种重要的
中间材料!为获得新的高抗甜瓜品种"系#奠定了
基础
基因表达分析表明!防卫基因
!"#
在甜瓜不
同组织均有表达!叶片的表达量最高!其次是茎!而
根中的表达量比较低接种蔓枯病菌后!不同抗性
甜瓜及不同组织中
!"#
表达量变化存在明显差
异聚合抗源
#($)(,#
叶片中
!"#
基因表达量在
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时达到最高峰!而单基因抗源
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和
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叶片中
!"#
基因表达的最高峰在
!(;

不同抗性甜瓜茎中
!"#
基因的表达在
!(;
时均达
到最高峰!而根
!"#
基因在
#!
"
!(;
表达变化幅
度较小由此可知!甜瓜幼苗对蔓枯病菌侵染的时
空响应或适应性存在一定差异防卫基因
!"#
表
达量在接种后呈现出先升高后降低的趋势!且后期
有所波动这可以有效避免基因表达产物的过度积
累而对植株自身造成损害!同时还可降低病原菌的
适应性!与王红英等+!,,在甜瓜和缪卫国等+!1,在棉花
上从生理生化方面研究酶活性变化的趋势基本
一致
本研究首次在转录水平上研究
!"#
与甜瓜蔓
枯病抗性的关系!聚合抗源
#($)(,#
中
!"#
基因的
表达量高于或表达时间早于单基因抗源
?@(!"#($
和
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!在一定程度上揭示了甜瓜聚合抗源抗
性提高的原因
AB)?CA
方法分析
!"#
转录水平
与研究
!"#
酶活性相比!方法简单*快捷*准确!为
进一步研究
!"#
与甜瓜抗病性的关系提供了技术
和理论支持另外!与感病品种(白皮脆)相比!抗病
材料中
!"#
基因的表达量始终相对较高!表明
!"#
与甜瓜蔓枯病抗性有密切关系!其表达量可作
为甜瓜前期蔓枯病抗性鉴定的重要参考指标
参考文献!
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