全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
!"#$*"+*!
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基金项目$国家林业公益性行业科研专项"
!"#)")#"&
#&江苏高校优势学科建设工程资助项目
!!
作者简介$杨秀莲"
#&+"(
#!女!博士!副教授!主要从事园林植物栽培应用的教学和研究工作
2*34/5
$
6
41
7
85%%&
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0/14,9:3
海州常山花粉低温贮藏及其生理生化特征研究
杨秀莲!林燕青!王良桂
"南京林业大学 风景园林学院!南京
!#""%+
#
摘
!
要$以海州常山花粉为研究材料!探究了贮藏方式(贮藏时间(贮藏温度及预冻方式(低温解冻方式对花粉萌发
率的影响!以及
(";
及
);
低温贮藏过程中海州常山花粉保护酶活性和渗透调节物质含量的变化!以筛选海州
常山花粉的培养方法及贮藏条件!为其杂交育种奠定基础结果表明$"
#
#进行低温贮藏时!花药和散粉两种贮藏
效果差异不显著&不同的预冷方式对花粉低温贮藏影响并不显著&
(";
贮藏条件下!
%+;
水浴解冻效果显著优
于室温解冻"
!
#海州常山花粉在
(";
低温下贮藏
&"<
后仍具有
+,&&=
的萌发率!更有效的保持了花粉萌发
率"
%
#随着低温胁迫时间的延续!
);
及
(";
两种低温条件下贮藏的海州常山花粉超氧化物歧化酶"
>?@
#活
性(过氧化物酶"
A?@
#活性均呈现出先升后降的趋势"
)
#
);
及
(";
两种低温贮藏的海州常山花粉可溶性糖
含量及
(";
低温贮藏的海州常山花粉可溶性蛋白含量!随着低温胁迫时间的延续!呈现出先升后降的趋势&
);
低温贮藏条件下的海州常山花粉可溶性蛋白含量呈现逐渐下降的趋势研究认为!海州常山花粉更适宜于在
(";
低温下长期贮藏!它可以通过提高自身的
>?@
(
A?@
活性!增加可溶性糖和可溶性蛋白累积来增强抗寒性!
维持自身活力
关键词$海州常山&花粉&花粉活力&低温贮藏&生理生化特征
中图分类号$
B&)$,-
C
-
!!!
文献标志码$
D
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海州常山"
!"#$%&#&$()*$+,-%*%)()XSI3Z
#为
马鞭草科"
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#大青属"
!"#$%&#&$()J,
#小
乔木或灌木)#*!是既可观花!又可冬季观果的优良花
木)!*海州常山具有多种抗逆性!如较强的抗旱(耐
瘠薄(耐盐碱能力!可用于城市盐碱地及矿区绿化美
化(废弃地恢复等!是一种很有应用潜力的植物树
种)#*此外!海州常山的茎叶均含有一些重要的药
用成分)%*!又是一种极具经济价值的野生植物!具有
较大开发潜力
花粉是植物重要的种质材料!其活力直接影响
到植物遗传(育种(进化(生殖等的效率)*-*花粉的
低温贮藏对人工授粉和杂交育种!以及解决花期不
遇现象有重要的意义!花粉的生活力及低温贮藏过
程中其生理生化反应特征的研究是育种过程的基础
性工作目前!对果树(药用植物(农作物(园林植物
花粉低温保存的研究已经逐步展开!并取得一定的
成果!如日本在取得桃花粉及美国山核桃花粉保存
#"
年仍具有活力!葡萄品种花粉保存
$
年活力仍然
保持不变的显著成果)-*唐菖蒲花粉于
(";
超
低温保存下可保持
#
年的生活力)+**等不同品种的
海州常山花期差异较大!其杂交育种普遍存在花期不
遇现象!但目前还没有海州常山花粉相关的研究报
道因此!本试验研究了贮藏方式(贮藏温度及时间
对海州常山花粉低温贮藏效果的影响!测定并记录了
);
及
(";
低温贮藏过程中海州常山花粉生理生
化特征变化!旨在为海州常山新品种培育(花粉库建
立及其杂交育种中花期不遇问题的解决提供参考
#
!
材料和方法
;,;
!
试验材料
试验用花粉材料来自江苏盐城海州常山基地!
采集时间为
!"#)
年

月中下旬选择晴朗的天气!
使用铁镊子采集盛花期且生长健壮植株的花药!收
集于聚乙烯离心管中!迅速带回室内!铺于硫酸纸上
阴干
#
"
!<
后带回南京林业大学生理生化实验室!
于
!$;
下干燥
&S
!将花粉以散粉和花药的形式分
别收集于聚乙烯离心管中并贴标签!分别贮藏于
)
;
(
(#;
(
(";
恒温箱中基地地处中国东部
沿海!江苏省中北部!长江三角洲北翼!年平均气温
为
#%,+
"
#),$;
!极端最高气温为
%+,!;
!一年当
中以
+
"
&
月份为最高!
#!
(
#
(
!
月份为最低!年降水
总量为
+$,!
"
#%"&,$33
!无霜期长!土壤肥沃
;,<
!
试验处理
将采集的花粉样品先进行干燥!再进行不同温
度预冻(解冻!以及不同贮藏方式(温度处理!最后测
试萌发率本试验中!花粉萌发条件及干燥条件"
!$
;
下干燥
&S
#为海州常山花粉前期萌发试验所测
得的最佳条件
;,<,;
!
干燥脱水花粉预冻处理
!
将花粉干燥"
!$
;
下干燥
&S
#后!分别进行
)
种方式的预冻处理$
)
;
预冷
#!S
后投入
(";
&
(#;
预冷
#!S
后投
入
(";
&
);
预冷
#!S
!再经
(#;
预冷
#!S
后
投入
(";
&直接投入
(";
每处理
%
次重复!
处理结束后测定花粉的萌发率
;,<,<
!
低温贮藏花粉解冻处理
!
以
(#;
及
(";
下贮藏的花粉为试验材料!分别进行
)
种解
冻试验)+*$
%+;
水浴快速解冻(
);
缓慢解冻(流动
自来水"约
#+;
#解冻(
!$;
室温自然解冻!
%
次重
复!处理结束后测定花粉萌发率
;,<,=
!
不同贮藏方式!时间及温度处理
!
将干燥后
"
!$;
下干燥
&S
#的实验材料分别采取花药贮藏及
散粉贮藏两种方式!分别置于室温"
!$;
!
N]
#(
)
;
(
(#;
(
(";
环境下贮藏!然后分别于
%
(
$
(
+
(
##
(
#$
(
%"
(
-"
(
&"<
后将取出的花粉进行低温解
冻"
%+;
水浴解冻#试验
%
次重复!最后测定花粉
的萌发率
;,=
!
测定指标和方法
;,=,;
!
花粉萌发率
!
用移液枪分装
",#3J
液体
培养基"
#$"3
7
%
J
氯化钙
C#$"
7
%
J
蔗糖
C!""
3
7
%
J
硼酸#于每个双孔凹玻片孔内!使用牙签将待
试花粉均匀点入培养液中!使其充分混合!将凹玻片
放入铺有湿润滤纸的培养皿中!室温"
!$;
#有光条
件下培养
S
在
)"^
电镜下观察统计花粉萌发
率!每处理统计
%
个视野!每个视野花粉粒数不少于
$"
粒!每试验
%
次重复!花粉萌发以花粉管长度大
于花粉粒直径为标准
花粉萌发率"
=
#
_
萌发的花粉粒数%花粉粒总
数
#^""=
;,=,<
!
低温贮藏花粉的生理生化指标
!
由于可采
集的花粉量有限!本试验选取
);
(
();
低温下
&"#
&
期 杨秀莲!等$海州常山花粉低温贮藏及其生理生化特征研究
保存的花粉进行了花粉生理生化指标的测定!
(#
;
低温下保存的花粉生理生化特征变化仍有待于进
一步研究将采集的新鲜花粉于
();
和
(";
两个温度进行贮藏!分别测定贮藏
"
(
#$
(
%"
(
-"
(
&"<
后花粉的超氧化物歧化酶"
>?@
#(过氧化物酶
"
A?@
#活性以及丙二醛"
`@D
#(可溶性糖(可溶性
蛋白含量相关生理生化指标的变化测定方法参考
李合生)&*的实验方法!采用氮蓝四唑光还原法测定
>?@
活性!采用愈创木酚法测定
A?@
活性!采用硫
代巴比妥酸法测定
`@D
含量!采用蒽酮法测定可
溶性糖含量!采用考马斯亮蓝
G!$"
法测定可溶性
蛋白质含量)+**!每个指标测定
%
次重复
;,>
!
数据处理
对试验所测定(记录的数据!运用
>A>>#&,"
软
件进行方差分析和多重比较!采用非参数检验方法
进行正态分布检验!并验证方差是否具有齐性!若数
据方差具有齐性即采用
@I1941
方差分析法进行处
理!若数据方差不具有齐性则采用
@I11OT0
+
0X%
非
参数检验法进行方差分析)#"*!使用
289O5
软件绘制
折线图
!
!
结果与分析
<,;
!
贮藏方式!时间及温度对海州常山花粉生活力
的影响
!!
如表
#
所示!就散粉低温贮藏方式而言!室温贮
藏"
N]
#花粉的萌发率在
##<
后接近
"
&在
);
(
(#;
和
(";
低温条件下!花粉萌发率在贮藏
$
"
&"<
后分别比贮藏
%<
下降了约
-,-=
"
&),-)=
(
#!,$$=
"
&#,+=
(
-,&-=
"
#,"!=
!并
且在贮藏
+<
或者
##<
后下降即达到显著水平!但
其在贮藏
&"<
时仍分别有
#,$=
(
!,"&=
和
$,&)=
的萌发率同时!与以上散粉低温贮藏相比!以花药
方式贮藏的花粉萌发率更高其中!室温贮藏"
N]
#
花粉的萌发率在
#$<
后接近
"
&在
);
(
(#;
和
(";
低温条件下!花粉萌发率在贮藏
$
"
&"<
后
分别比贮藏
%<
下降了约
#,)&=
"
,!%=
(
,!%=
"
),$%=
(
#,%+=
"
+$,#!=
!并分别在贮藏
+
(
##
和
#$<
后下降即达到显著水平!但其在贮藏
&"<
时
仍分别有
!,$=
(
),!%=
和
+,&&=
的萌发率可
见!花药贮藏与散粉贮藏效果无显著差异&海州常山
花粉活力随着贮藏时间的延长而逐渐降低!且下降
率逐渐升高&
(";
低温比
(#;
及
);
低温能
更有效地延缓花粉活力的丧失!且海州常山花粉适
宜在
(";
进行长期低温贮藏
<,<
!
预冻和解冻方式对海州常山花粉生活力影响
预冻处理旨在减轻低温对花粉细胞原生质的损
害!植物种类不同!预冻的效果也会有较大差异)##*
如图
#
所示!
)
种不同预冻处理方式对海州常山花
粉萌发率的提高效果差异并不显著!即程序性预冻
对海州常山花粉的活力无显著影响相对而言!
表
;
!
不同贮藏条件花粉萌发率
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!
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O
%
=
贮藏时间
>T:R4
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<
贮藏方式
>T:R4
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贮藏温度
>T:R4
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%
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N]
"
!$
#
) (# ("
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7
N ),!%a",%OP@2 +,&&a#,!-
7
@
!!
注$
A
代表散粉贮藏!
D
代表花药贮藏&同列不同大写和小写字母分别表示在
","#
和
","$
水平存在显著性差异下同
F:TO
$
ARO
Q
RO0O1T0+/+*$%
Q
RO0ORW4T/:1
!
YS/5ODRO
Q
RO0O1T0/141TSOR0T:R4
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I313O410/
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!
RO0
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,XSO043O40ZO5:Y,
"##
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
%$
卷
);
预冷
#!S
后投入
(";
处理"
#
#下的花粉萌
发率较高"
!),!=
#!表明经过
);
预冷
#!S
后!花
粉细胞进行了保护性脱水!从而避免了低温贮藏过
程中结冰造成的伤害)!#*可见!海州常山花粉于
(";
低温贮藏时较宜采用
);
预冷
#!S
的预冻
方式
同时!花粉的解冻方式对其活力也有重要影响!
而植物的种类及花粉的含水量决定花粉解冻方式的
选择)##*图
!
显示!
(";
低温贮藏条件下!
%+;
水浴快速解冻"
#
#后的花粉萌发率最高!并极显著
高于
!$;
室温自然解冻"
$
#后的花粉萌发率!其余
解冻方式处理间无显著性差异&在
(#;
低温贮藏
条件下!
)
种解冻方式间花粉萌发率差异均不显著!
但仍以解冻方式
#
最高!方式
$
最低可见!在两种
花粉低温贮藏条件下!
%+;
水浴解冻效果均相对最
图
#
!
不同预冷方式下花粉萌发率的变化
#
,);
预冷
#!S
后投入
(";
&
%
,(#;
预冷
#!S
后投入
(";
&
&
,);
预冷
#!S
!再经
(#;
预冷
#!S
后投入
(";
&
$
,
直接投入
(";
U/
7
,#
!
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RO9::5/1
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$
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IT/1T:(";
图
!
!
不同解冻方式下花粉萌发率的变化
#
,%+;
水浴解冻&
%
,);
解冻&
&
,
自来水解冻&
$
,
室温解冻
U/
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!
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&
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,XS4Y4T);
&
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,XS4Y4TT4
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Y4TOR
&
$
,XS4Y4TR::3TO3
Q
OR4TIRO
佳!室温解冻效果相对最差!其余两种解冻效果差异
不明显!即
%+;
水浴解冻能更有效地保持花粉活
力!海州常山花粉低温保存的解冻方式较宜选用
%+;
水浴快速解冻
<,=
!
低温贮藏对海州常山花粉抗逆性生理生化指
标的影响
!
&@A
和
-@A
活性
!
>?@
具有特殊的生理
活性!对生物体内自由基的清除具有极其重要的意
义!通过测定
>?@
活性水平高低可检测生物体衰老
与死亡状态特征)#!*#%*如图
%
!
D
所示!
(";
及
)
;
低温保存过程中!海州常山花粉
>?@
活性均呈现
先升后降的趋势其中!在
(";
低温条件下!贮
藏
#$<
后花粉
>?@
活性上升幅度较大!与新鲜花
粉相比显著上升了
#",&=
&之后
>?@
活性开始下
降!且下降幅度逐渐加剧&贮藏
&"<
后花粉
>?@
活
性相比新鲜花粉显著下降了
)),"&=
在
);
低温
条件下!贮藏
#$<
后花粉
>?@
活性略有上升!其活
性相比新鲜花粉仅上升了
",&$=
&之后
>?@
活性
下降幅度以缓慢
*
急剧
*
缓慢的趋势波动&贮藏
&"<
后
>?@
活性下降了
&,&#=
因此!海州常山花粉
在低温保存初期能通过自身协调
>?@
活性清除体
内的自由基以适应低温环境!但随着低温长时间胁
迫!花粉受到了一定程度的冻害!
>?@
合成受到了
抑制!其活性不断下降&
(";
低温下保存的花粉
>?@
活性始终明显高于
);
下低温保存的花粉
A?@
对各种不良环境十分敏感!在受低温刺激
时活性发生改变!可以作为花粉受伤害程度及其抗
性大小的指标)#)*#$*图
%
!
b
显示!
(";
低温条件
下!海州常山花粉
A?@
活性呈现急剧上升后又急剧
下降趋势!并于保存
%"<
时达到峰值!此时其活性
比新鲜花粉上升了
!+),%&=
!但在贮藏
&"<
后其活
性比新鲜花粉下降了
!+,!+=
在
);
低温条件
下!花粉
A?@
活性先缓慢上升!并于
-"<
时达到峰
值!之后又急剧下降&在保存
-"<
后其活性比新鲜
花粉上升了
#"$,+!=
!贮藏
&"<
后相比新鲜花粉下
降了
-",-#=
可见!海州常山花粉
A?@
活性在
(
";
保存条件下始终显著高于
);
下保存!
("
;
比
);
能更有效地刺激了花粉
A?@
活性的提高!
更有利于花粉细胞产生胁迫反应
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!
可溶性糖和可溶性蛋白含量
!
如图
)
!
D
所
示!
);
和
(";
低温条件下!海州常山花粉可溶性
糖含量均呈现出先升后降的趋势!且
(";
贮藏花
粉始终低于
);
花粉含量其中!在
(";
低温条
件下!贮藏
%"<
后花粉可溶性糖含量达到最大值!且
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期 杨秀莲!等$海州常山花粉低温贮藏及其生理生化特征研究
图
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低温保存下花粉
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和
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比新鲜花粉增加了
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在
);
低温条件下!贮
藏
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后花粉可溶性糖含量达到最大值!比新鲜花
粉增加了
)!,#+=
这表明花粉在低温贮藏初期能通
过积累可溶性糖含量来提高自身抗寒性!但随着时间
的延续!持续低温对花粉细胞造成了一定程度的伤
害!可溶性糖含量逐渐降低!但
(";
比
);
低温贮
藏花粉的可溶性糖含量更高&
(";
低温可以更有
效(更长时间地刺激可溶性糖含量的积累!使花粉细
胞对低温胁迫产生更有效的适应性反应
可溶性蛋白具有较强的亲水性!其在低温胁迫
下能得到不断积累!从而提高花粉细胞保水性及抗
寒性图
)
!
b
显示!
(";
低温条件下!花粉可溶
性蛋白含量呈现先升后降的趋势!并于贮藏
%"<
后
达到最大值!此时其含量比新鲜花 粉 增 加 了
#),$)=
!而贮藏
&"<
后的花粉可溶性蛋白含量比
新鲜花粉下降了
$&,##=

);
低温条件下!花粉可
溶性蛋白含量呈现逐渐下降的趋势!贮藏
&"<
后其
含量比新鲜花粉下降了
-,#&=
同时!
(";
下
贮藏的花粉可溶性蛋白含量在贮藏过程中明显高于
);
下保存的花粉以上结果表明!花粉于
(";
低温贮藏初期能通过不断积累自身可溶性蛋白含量
来提高细胞抗寒性!以避免细胞受到不可恢复的伤
害!但贮藏
%"<
后可溶性糖含量不断下降!花粉细
胞受到了较严重伤害&在
);
低温贮藏过程中!花粉
的可溶性糖含量不断降低!花粉细胞在
);
低温下
受到的伤害逐渐加重且不可逆
%
!
讨
!
论
一般来讲!低温贮藏可以有效地降低花粉呼吸
强度和酶活性!以延续花粉的衰老进程!且温度越
低!花粉保存效果越好)+!#-*#*随着贮藏时间的推
移!花粉生活力会不断降低!研究花粉低温贮藏的相
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西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
%$
卷
关技术及机理特性对花粉种质资源保存(杂交育种
等具有重要意义
花粉细胞在低温状态下!其体内新陈代谢基本
停止)##*!赵婵璞等)#&*研究发现
(";
低温可使有
斑百合花粉保持
!
年的活力本试验中!
(";
低
温比室温"
!$;
#(
);
(
(#;
能更有效刺激花粉
细胞对低温胁迫的应激反应!有效降低花粉呼吸作
用!延续了花粉寿命!总体而言!
(";
可实现海州
常山花粉较长时间的贮藏有研究)!"*发现花药在
低温条件下可有效地降低花粉的失水率!本试验结
果发现海州常山花粉进行低温贮藏时!选用花药贮
藏效果与散粉贮藏效果差异不显著!仍有待于进一
步研究确定
本试验中
)
种预冻处理效果差异并不显著!经
过变温预冻的花粉贮藏效果均略优于直接投入
(";
低温下花粉贮藏效果赵婵璞等)#&*发现有
斑百合花粉采用液氮预冻再投入
(";
中贮藏!且
采用
%$;
水浴解冻可有效的提高花粉萌发率本
试验中!在
(#;
低温贮藏条件下!不同的解冻方
式对花粉萌发率的影响并不显著&而在
(";
低温
贮藏条件下!不同的预冻方式对花粉萌发率的影响
并不显著!
%+;
水浴快速解冻效果极显著高于室温
自然解冻的效果!采用
%+;
水浴解冻效果相对较
佳!可有效避免次生结冰对细胞的致死性破坏)!#*!!*
低温贮藏过程中!花粉细胞会发生一些生理生
化反应!参与呼吸作用等生理过程的脂(糖(蛋白质
等生物大分子与酶活性均会发生一系列的变化有
学者研究表明!低温贮藏时切花寒菊小花花粉
>?@
活性)#+*随着温度的降低而持续上升!而福建山樱
花)#!%*(唐菖蒲花粉)*及卷荚相思)!)*!$*花粉的
>?@
和
A?@
活性则呈现先升后降的趋势!可能是由于切
花寒菊小花对于低温胁迫的适应性较强!更适宜于
在低温条件下长期贮藏本试验测得海州常山花粉
在
);
和
(";
低温贮藏过程中!其
>?@
和
A?@
活性均呈现先升后降的趋势!且
(";
低温保存下
的花粉
>?@
和
A?@
活性上升幅度较高!比
);
低温
更有利于刺激花粉细胞产生较大幅度的胁迫反应
另外!海州常山花粉在
(";
及
);
低温贮藏
过程中!其可溶性糖含量均呈现先增后降的趋势!贮
藏初期可溶性糖含量显著增加!之后逐渐下降!可见
在短期低温胁迫下海州常山花粉通过可溶性糖含量
的积累增加了自身的抗寒能力!维持了自身活力!但
持续低温对其造成了伤害!影响了海州常山花粉的
代谢活动福建山樱花)#!%*及唐菖蒲花粉)+*&*的低
温贮藏研究证实了花粉可溶性糖含量与其抗寒性的
正相关性!本试验也证实了这一结论另外!詹福建
等)!-*的研究曾表明植物体内的可溶性蛋白的增加
能够平衡细胞质与液泡间的渗透势!降低细胞伤害
程度!增强其抗寒性切花寒菊小花)#+*(唐菖
蒲)+**(福建山樱花)#!%*等花粉在低温贮藏过程中
的可溶性蛋白含量呈现先增后减的趋势本试验
中!
(";
低温贮藏的海州常山花粉可溶性蛋白含
量呈现先上升后下降的趋势!表明低温贮藏过程中
其体内的渗透调节作用较活跃!更好地适应了低温
条件!但随着低温胁迫时间的延续!细胞原生质结冰
加剧!对细胞造成了不可逆的伤害!可溶性蛋白质含
量不断降低
);
低温保存条件下!海州常山花粉
可溶性蛋白质含量呈现不断下降的趋势!说明
);
低温胁迫不足以刺激其启动自身的应激机制!没有
促进一些新蛋白的合成
综上所述!海州常山进行杂交育种时!出现花期
不遇现象时!可将海州常山的花粉贮藏于
(";
低
温下!可在短期内"约
%
个月#保持一定的活力试
验中海州常山花粉萌发率总体偏低!贮藏时间较短!
可能与花粉品种(材质相关!或是因长距离携带使花
粉活力降低!还需进一步研究
参考文献"
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