全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 42(3): 311-314(2012)
收稿日期: 2011-08-16; 修回日期: 2012-02-06
基金项目: 现代农业产业技术体系建设专项资金资助(CARS-20-2-2); 公益性行业(农业)科研专项资助(nyhyzx07-019); 云南省“人才
培养”项目(2008PY087)
通讯作者: 黄应昆,研究员,主要从事甘蔗病虫害防治研究; Tel: 0873-7227017, E-mail: huangyk64@163. com。
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췍研究简报
甘蔗白叶病植原体巢式 PCR检测方法的
建立及初步应用
卢文洁, 黄应昆*, 李文凤, 王晓燕, 罗志明
(云南省农科院甘蔗研究所,云南省甘蔗遗传改良重点实验室, 开远 661600)
Development and application of nested PCR assay for detection of phytoplasma of
sugarcane white leaf 　 LU Wen-jie, HUANG Ying-kun, LI Wen-feng, WANG Xiao-yan, LUO
Zhi-ming　 (Sugarcane Research Institute, Yunnan Province Academy of Agricultural Science, Yunnan Key Laboratory of Sug-
arcane Genetic Improvement, Kaiyuan 661600, China)
Abstract: Sugarcane white leaf (SCWL) is widespread in the major sugarcane growing areas in Asia coun-
tries caused destructive damage. For the purpose of SCWL phytoplasma detection in imported sugarcane varie-
ties and materials, two primer pairs were designed based on the 16S rRNA sequence of SCWL phytoplasma
and a nested PCR assay for detection of SCWL phytoplasma was developed. These two primer pairs were am-
plified 700 bp and 210 bp DNA fragments, respectively. The nested PCR assay was able to detect as low as
0． 28 fg·μL -1 of positive control DNA. With this assay, the SCWL phytoplasma of 36 imported sugarcane
varieties and materials were detected and 7 samples were positive.
Key words: sugarcane white leaf (SCWL); phytoplasma; nested PCR; detection
文章编号: 0412-0914(2012)03-0311-04
　 　 甘蔗白叶病( sugarcane white leaf, SCWL)是
由植原体引起的重要甘蔗病害[1] ,广泛分布在印
度、泰国等许多国家[1,2] 。 我国甘蔗产区的栽培
品种也有 SCWL 的发生[3] 。 甘蔗是无性繁殖作
物,植原体可通过繁殖种苗进行传播,台湾斑纹
叶蝉(Matsumuratetlix hiroglyhious )通过咬食感
染甘蔗植株的韧皮部可引起该病害[4]。 SCWL 是
甘蔗产业毁灭性病害之一,严重威胁着甘蔗种植
业,在泰国甘蔗种植区,发病率达 5% ~ 35% [2],在
新几内亚,该病害造成栽培品种拉格纳损失高达
100% [5],给甘蔗产业造成极大的经济损失。
近年来,云南省农科院甘蔗研究所加强了与亚
洲国家的国际合作,从泰国、菲律宾等许多国家不
断引进甘蔗品种与资源材料。 为了有效防控不同
遗传背景的植原体随引进的甘蔗品种 /材料侵入境
内,本课题组开展了 SCWL巢式 PCR方法研究,建
立了灵敏、快速的检测方法;同时应用建立的巢式
PCR方法对从国外引进的甘蔗品种 /材料进行了
SCWL植原体检测。
1　 材料与方法
1. 1　 样品来源
检测样本采自于云南省农科院甘蔗研究所昆
明检疫温室,为泰国、菲律宾、缅甸和柬埔寨引进的
36 个甘蔗品种 /材料,泰国:UT1、UT2、UT3、KK1、
CHINAT1;菲律宾: PSR01-46、 PSR01-51、 PSR01-
　
植物病理学报 42 卷
82、RSP01-105、PSR01-149、PSR02-99、PSR02-112、
PSR02-158、 PSR02-237、 PSR02-247、 PSR2000-23、
PSR2000-53、PSR2000-71、PSR2000-161、PSR2000-
171、 PSR2001-70、 PSR2001-188、 PSR2001-195、
PSR2001-240;缅甸:Ampov keochnot、PMA96-48、
PMA96-56、 PMA98-40、 PMA98-44、 PMA99-207、
PMA00-159、PMA01-145、PMA01-183、Phil 74-64;
柬埔寨:Ampov TaLan、Ampov Kmoa。 阳性对照为
感染 SCWL 的甘蔗材料 B24 的叶片总基因组
DNA,由云南省甘蔗遗传改良重点实验室提供。
1. 2　 巢式 PCR检测
1. 2. 1　 引物设计　 根据 SCWL 植原体 16S rRNA
序列设计引物对 MLOX / MLOY 和 P1 / P2,分别作
为巢式 PCR扩增的外侧引物对和内侧引物对,由
上海生物工程公司合成。
1. 2. 2 　 总基因组 DNA 的提取、巢式 PCR 扩增
取 0. 1 g 感病的新鲜叶片,采用改进的 CTAB 法提
取叶片总基因组 DNA。 第一次 PCR 反应体系 20
μL:模板总基因组 DNA 1 μL,10 × PCR buffer 2． 5
μL,MLOX(20 μmol·L -1)1 μL,MLOY(20 μmol
·L -1) 1 μL,MgCl2 (25 mmol· L -1 ) 0. 5 μL,
dNTPs(10 mmol·L -1)1 μL,Taq 酶(5 U·μL -1)
0. 2 μL,ddH2O 12. 8 μL。 第一次 PCR 扩增程序
为:94℃预变性 5 min;94℃变性1 min,55℃退火 1
min,72℃延伸 1 min,25 个循环;最后 72℃延伸 10
min。 第二次 PCR 反应体系 20 μL:取 1 μL 第一
次 PCR扩增产物(稀释 100 倍)作为模板 DNA,P1
(20 μmol·L -1)1 μL,P2(20 μmol·L -1)1 μL,
其他试剂用量同第一次 PCR 扩增。 第二次 PCR
扩增程序为:94℃预变性 5 min;94℃变性 1 min,
62℃退火 1 min,72℃延伸1 min,35 个循环;最后
72℃延伸 10 min。 用 1. 5%的琼脂糖凝胶电泳检
测扩增产物。
1. 2. 3 　 灵敏度检测 　 按照 1. 2. 2 建立的扩增体
系,以阳性对照总基因组 DNA 为标准模板进行灵
敏度试验,基因组 DNA 用 DU-800 紫外分光光度
计测定浓度,逐级稀释至 0. 28 × 10 -1、0. 28 ×
10 -2、0. 28 × 10 -3、0. 28 × 10 -4、0. 28 × 10 -5、0. 28
×10 -6、0. 28 ×10 -7和 0. 28 ×10 -8ng·μL -1。
1. 2. 4　 样品检测　 按照 1. 2. 2 建立的扩增体系对
从泰国、菲律宾、缅甸和柬埔寨引进的 36 个甘蔗品
种 /材料进行 SCWL植原体检测。
1. 2. 5　 巢式 PCR 扩增产物序列分析　 巢式 PCR
产物用上海生工回收试剂盒 ( EZ Spin Column
DNA Gel Extraction Kit)回收纯化后,送上海生工
生物工程有限公司测序,所得序列进行 BLAST
后,应用 DNAMAN6. 0 软件和 Clustal2. 0 软件进
行分析。
2　 结果与分析
2. 1　 巢式 PCR检测方法的稳定性
经过第一次 PCR 扩增后,引物对 MLOX /
MLOY以阳性照基因组 DNA 为模板扩增到 1 条
700 bp的预期条带,而未能从带病的检测样品中
扩增到预期条带(图 1-A),巢式引物对 P1 / P2 能以
第一次扩增产物为模板扩增到 1 条 210 bp 的预期
条带(图 1-B)。
Fig. 1　 Nested PCR detection for SCWL phytoplasma of samples with primers
A: PCR with external primer pair MLOX / MLOY; B: Nested PCR with external primer pair MLOX / MLOY and internal
primer pair P1 / P2; M:DNA marker;PC:Positive control;NC:Negative control;1:UT3;2:KK1.
213
　
　 3 期 　 　 卢文洁,等:甘蔗白叶病植原体巢式 PCR检测方法的建立及初步应用
2. 2　 灵敏度检测
将阳性对照基因组 DNA 连续稀释后,进行巢
式 PCR两次扩增,结果表明,第一次 PCR 扩增可
检测到 0. 28 ×10 -4 ng·μL -1浓度的模板 DNA(图
2-A);将第一次 PCR 扩增产物稀释 100 倍作为模
板进行第二次 PCR 扩增后,阳性对照模板最低检
测浓度为 0. 28 × 10 -6 ng·μL -1 (图 2-B),比第一
次 PCR扩增提高了 100 倍。
2. 3 　 国外引进甘蔗品种 /材料的 SCWL 植原体
检测
应用本研究建立的巢式 PCR 方法对从泰国、
菲律宾、缅甸和柬埔寨引进的 36 个甘蔗品种 /材料
进行了 SCWL植原体检测,结果表明,阳性对照和
7 个 甘 蔗 品 种 /材 料 UT3、 KK1、 PSR02-112、
PSR2001-70、 PSR2001-188、 PSR2001-195、 Ampov
keochnot 扩增到 210 bp预期条带,其余甘蔗品种 /
材料和阴性对照未出现预期条带;同时对检测带病
的甘蔗品种 /材料进行了隔离处理。
2. 4　 序列分析
将检测为阳性的 7 个样品巢式 PCR 产物进行
了测序,得到的 7 条序列大小均为 210 bp,序列完
全一致。 BLAST 检索结果表明,该片段是导致
SCWL的甘蔗白叶病植原体基因组的部分序列,与
GenBank中公布的缅甸、泰国 SCWL 致病分离物
的基因组(登录号 AB646271、HQ917068)相应区
段的核苷酸序列相似性为 100% ,与印度分离物
(登录号 DQ380345、AM269742)和夏威夷分离物
(登录号 JN223448)的相似性均在 99%以上。
3　 结论与讨论
SCWL是甘蔗上分布广泛[1,2],危害严重的重
要病害,极大威胁着甘蔗的生产和发展[2,5]。 甘蔗
白叶病植原体不能人工组织培养,早期主要通过电
镜技术进行鉴定[3],但费工费时,效率低。 随着分
子生物技术的不断发展,PCR 检测方法已广泛应
用于植物植原体的检测,具有很高的准确性和灵敏
度。
本研究结合甘蔗检疫工作的需要,经过不断探
索研究,建立了 SCWL 巢式 PCR 检测方法。 从本
试验中可以看出,以待测样品 DNA 为模板,用外
侧引物对MLOX / MLOY进行第一次PCR扩增 ,
Fig. 2　 Sensitivity of nested PCR to different positive control DNA
A: By PCR with external primer pair MLOX / MLOY; B: By nested PCR with external primer pair MLOX / MLOY and
internal primer pair P1 / P2. M: DNA marker; 1-8: 0. 28 ×10 -1,0. 28 ×10 -2,0. 28 ×10 -3,0. 28 ×10 -4,
0. 28 ×10 -5,0. 28 ×10 -6,0. 28 ×10 -7 and 0. 28 ×10 -8 ng·μL -1; 9: Negative control .
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植物病理学报 42 卷
无条带产生,可能是样品植原体含量低,无法达到
第一次 PCR检测的最低量。 以外侧引物对的扩增
产物为模板,用内侧引物对 P1 / P2 再次进行 PCR
扩增,扩增到明显的预期条带。 可以看出,通过第
二次 PCR扩增,不但确证了第一次 PCR 扩增的特
异性,同时检测的稳定性也大大高于第一次 PCR
扩增。 以阳性对照 SCWL 植原体基因组 DNA 为
模板,经过第一次 PCR 和第二次 PCR 两次扩增,
结果表明,巢式 PCR 检测的灵敏度明显高于第一
次 PCR扩增,比第一次 PCR扩增提高了 100 倍。
应用建立的巢式 PCR 检测方法,对从国外引
进的甘蔗品种 /材料进行了 SCWL 植原体检测,发
现有带病的甘蔗品种 /材料,并对带病的甘蔗品种 /
材料进行了隔离处理,有效控制了 SCWL 随引进
的甘蔗品种 /材料侵入境内蔓延危害。
参考文献
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责任编辑:曾晓葳
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