全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
#"""($"!&
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#
!(!$"&(")
!!!!!!!!!!!!!!!
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$
#"*)+"+
%
,
*-../*#"""($"!&*!"#$*#!*!$"&
收稿日期$
!"#$(")(#"
&修改稿收到日期$
!"#$(#"(!)
基金项目$国家自然科学基金"
%#""")$&
#&国家麻类产业技术体系"
0123(#4(5#$
#
作者简介$龙松华"
#4)4
#!男!助理研究员!主要从事亚麻分子生物学研究
5(67-8
$
89/
:
.9/
:
;<7)4$&!
!
#+%*=96
"
通信作者$王玉富!研究员!主要从事亚麻育种和栽培研究
5(67-8
$
=;-/7>87?
!
#!+*=96
亚麻
$12
基因克隆及
%&#
遗传转化
龙松华#!李
!
翔!!陈信波#!%!乔瑞清#!邓
!
欣#!
邱财生#!郭
!
媛#!郝冬梅#!王玉富#"
"
#
中国农业科学院麻类研究所!长沙
$#"!"&
&
!
湖南环境生物职业技术学院!湖南衡阳
$!#""&
&
%
湖南农业大学 作物基因工程
湖南省重点实验室!长沙
$#"#!@
#
摘
!
要$该实验以前期克隆的亚麻
$!"
基因片段为靶序列!利用
2105
方法克隆其全长
=AB1
序列"
#4&)C
D
#!
EF/G7/H
登录号为
I0@%!@+$
!该序列含有
#+&"C
D
完整的开放阅读框系统进化树分析表明!亚麻
$!"
基因与盐
芥
$!"
基因亲缘关系较近!而与禾本科的水稻"
#$
%
&()*+
#等亲缘关系最远其编码蛋白预测分析结果显示!亚
麻
$!"
基因由
&$4
个氨基酸组成!相对分子量为
+"HA
!等电点为
&*%
!蛋白质二级结构以无规则卷曲比例最多!其
次是
"
(
螺旋以亚麻
$!"
基因编码区
$#%C
D
靶标序列作为干扰区段!扩增其正反向基因片段!构建植物干扰表达
载体
D
#%"#J($!"
通过农杆菌介导转入亚麻!
AB1
及
2B1
水平上分子检测发现!
2B1-
结构已经转入亚麻中!
并显著降低了其
$!"
基因的表达量
关键词$亚麻&木质素&
$!"
基因&序列分析&
2B1-
载体&遗传转化
中图分类号$
K)@&
文献标志码$
1
%()(*"+,-+!%&#./-+01"/2-3#"+"14*-5$126,+,
LMBE39/
:
;<7
#
!
LNO-7/
:
!
!
0P5BO-/C9
#
!
%
!
KN1M2<-
Q
-/
:
#
!
A5BEO-/
#
!
KNR07-.;F/
:
#
!
ERMS<7/
#
!
P1MA9/
:
6F-
#
!
T1BES<><
#
"
"
#U;FN/.V-V
D
.
!
0;-/F.F1=7YF6
Z
9>1
:
X-=<8V
0;7/
:
.;7$#"!"&
!
0;-/7
&
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VF=;/-=
5/\-X9/6F/V7/YG-989
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PF/
:Z
7/
:
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%0X9
D
EF/F5/
:
-/FFX-/
:
IF
Z
L7C9X7V9X
Z
9>P!
P1
:
X-=<8V
!
0;7/
:
.;7$#"#!@
!
0;-/7
#
703/-83
$
N/V;-.XF.F7X=;
!
7><8(8F/
:
V;=AB1.F
Q
:
/-/.
Z
/V;F.-.-.=89/FYC
Z
2105([02VF=;/-
Q
:
6F/V9>V;-.
:
F/F=89/FY>XF\-9<.8
Z
*U;F=96
D
8FVF=AB1.F(
Q
D
-/8F/
:
V;
!
]-V;7=96
D
8FVF9
D
F/XF7Y-/
:
>X76F9>#+&"C
D
*U;FF/=9YFY
D
X9VF-/
=9/V7-/.&$476-/97=-Y.
!
]-V;7698F=<87X67..9>+"HA7/Y7
D
N9>&*%*27/Y96=9-87/Y
"
(;F8-?7XFV;F
67-/.F=9/Y7X
Z
.VX<=V
D
X9VF-/*[;
Z
89
:
F/FV-=7/78
Z
.-.-/Y-=7VFYV;7VV;FXF-.;-
:
;.-6-87X-V
Z
CF(
V]FF/>87?$!"
:
F/F7/YV;7V9>,-.//01
2
*.//-/3
4
-*/*U;F><8(8F/
:
V;=AB1.F
Q
-.(
VFXFY-/EF/G7/H
!
]-V;7/7==F..-9//<6CFX9>I0@%!@+$*1$#%C
D
0A3>X7
:
6F/V9>$!"-.76
D
8->-FYC
Z
[02V9=9/.VX<=VV;F2B1-/VFX>FXF/=F\F=V9X
D
#%"#J($!"
!
];-=;-.VX7/.>9X6FYV9>87?C
Z
7
:
X9C7=VFX-(
<6(6FY-7VFY6FV;9Y*3F\F/VX7/.
:
F/-=.FFY8-/
:
..F8F=VFYX7/Y968
Z
7XFYFVF=VFYC
Z
ER37/Y[02*U;FXF(
.<8V..;9]FYV;7VV;F2B1-\F=V9X=9/.VX<=V-9/;7.CFF/-/VF
:
X7VFY-/V9>87?
:
F/96F
!
];-=;8F7Y.V9F\-(
YF/V8
Z
YF
D
XF..-9/9>V;FF?
D
XF..-9/9>$!"
:
F/F-/>87?*
9,
:
;"/!0
$
>87?
&
8-
:
/-/
&
$!"
:
F/F
&
.F
Q
.-.
&
2B1-/VFX>FXF/=F\F=V9X
&
VX7/.>9X67V-9/
!!
亚麻"
"*1050(*))*((*505 L*
#是世界上除棉
花外最重要的纤维作物之一(#)亚麻纤维的开发利
用价值高!与其它纤维相比!具有许多独特的不可替
代的优点$吸湿性强*散热快*耐摩擦*不易裂*导电
性小*吸尘率低*抑菌保健等中国的亚麻无论种植
面积和产量都居世界最前列!但是中国的亚麻长麻
率和梳成率均较西欧低
%"^
以上!在纤维支数*纤
维强力*纤维单产等性状方面亟待提高作为世界
主要的亚麻加工国!目前中国每年进口亚麻原麻达
#&
#
!"
万锭!占原料需求量
+"^
#
)"^
(
!
)
木质素
是影响纤维质量的一个重要因素在脱胶过程中!
利用化学或机械方法将纤维分离出来!通过剧烈的
化学处理工艺除去纤维素中的木质素!需要消耗大
量能源和使用一些有毒化学物质!在抽提过程中一
般采用氯气或二氧化氯作为漂白剂除去细胞纤维间
的残留木质素!但氯气工艺废弃物中含有对环境有
害的二英类物质!而二氧化氯工艺则高成本*高能
耗!并且这些木质素抽提工序都具有降低细胞纤维
长度的弊端
木质素的生物合成是植物体内非常复杂的生理
生化过程!是在多种酶类和非酶类物质的共同协作
下进行的虽然现今对木质素的合成代谢途径尚存
争议!但普遍认为大致可分为
%
个途径$莽草酸途
径*苯丙烷代谢途径*木质素合成特异途径和木质素
单体糖基化途径据报道!
$(
香豆酸辅酶
1
连接酶
"
$(=9<67X7VF0918-
:
7.F
!
$0L
#是苯丙烷代谢途径
的核心酶之一!参与木质素单体的合成(%($)目前已
从拟南芥等多种植物中克隆到
$!"
全长基因(&(#")!
而有关亚麻
$!"
全长基因克隆的研究尚未见报道
因此!本研究以亚麻为材料!利用
2105
方法对其
$!"
全长基因进行克隆!对基因功能进行生物信息
学分析$与其他植物
$!"
基因同源性*氨基酸组成
及蛋白质二级和三级结构预测并利用亚麻
$!"
基因构建
2B1-
载体!进行亚麻遗传转化研究!获得
了转基因苗!经分子检测!基因干扰片段已经转入亚
麻中!并显著降低了其
$!"
基因的表达量!这为培
育低木质素的亚麻材料和亚麻纤维品质改良的分子
育种奠定了基础
#
!
材料和方法
<*<
!
材
!
料
供试材料为亚麻品种+中亚麻
$
号,!种植在湖
南省长沙市中国农业科学院麻类研究所基地于
!"#!
年
##
月上旬播种!翌年
&
月上旬亚麻进入开
花中期时取样!去除茎的上下两端!剥取其韧皮!立
刻在液氮中冷冻!放置
@"_
保存
<*=
!
方
!
法
<>=><
!
%&
提取
!
取冷冻的亚麻茎皮组织!放入
干净的研钵中!加入适量液氮!快速研磨样品研磨
成粉末后!用称量纸取出适量样品粉末!放入液氮预
冷的
5[
管内!每管装入的组织样品量大约为
#""
6
:
具体方法按照
5*`*B*1*[87/V2B1I-V
试剂
盒"
M6F
:
7
公司#说明进行提取的
2B1
进行电泳
检测
<*=*=
!
引物合成
!
根据本课题组已经克隆的亚麻
$!"
基因片段序列(##)!分别设计了
%a(2105
*
&a(
2105
特异引物*扩增
$!"
全长序列及
2B1-
载体
构建所用的的引物"表
#
#
<>=>?
!
@AB%()
!
采用
&a(21053
Z
.VF6>9X27
D
(
-Y16
D
8->-=7V-9/9>=AB1 5/Y.
"
N/\-VX9
:
F/
公司
bFX.-9/!*"
#试剂盒获得该基因的
&a
端序列
使用
3R[52302N[U
$
2U
酶和引物
2&@#(#
对总
2B1
进行目的基因第一链
=AB1
合成按照
试验剂盒要求进行一系列处理!使用引物
2&@#(!
和
试剂盒里面带的桥连铆钉引物
11[
对已经加
Y0
尾的
=AB1
进行
[02
第一轮扩增扩增程序为
4$
_
预变性
!6-/
&
4$_
变性
%".
!
&&_
退火
%".
!
)!
_
延伸
+".
!
%"
个循环&最后
)!_
延伸
)6-/
将
第一轮
[02
产物稀释
#""
倍作为模板!使用引物
2&@#(%
和试剂盒里面带的桥连通用扩增引物
1R1[
进行巢式
[02
第二轮扩增"扩增程序同第
一轮#将
[02
产物进行电泳!回收纯化!连接到
D
JA
#@
U
载体上!进行
AB1
测序
<>=>$
!
?AB%()
!
采用
3J12UFX
UJ
2105=AB1
16
D
8->-=7V-9/I-V
试剂盒"
089/VF=;
公司#获得该基
因
%a
端序列使用逆转录酶
3J12U3=X-CF
UJ
2F(
\FX.FUX7/.=X-
D
V7.F
和引物
%a0A3
D
X-6FX1
对总
2B1
进行逆转录合成
=AB1
使用引物
%!$(#
和
R[J
!以上面合成的
=AB1
为模板进行第一轮
[02
扩增扩增程序为
4$_
预
变性
&6-/
&
4$_
变性
%".
!
)"_
退火
%".
!
)!_
延
伸
#6-/
!
%"
个循环&最后
)!_
延伸
)6-/
将第一
轮
[02
扩增产物稀释
&"
倍!然后用引物
%!$(!
和
R[J
进行第二轮
[02
扩增"扩增程序同第一轮#
将第二轮
[02
产物进行电泳!回收纯化!连接到
D
JA
#@
U
载体上!进行
AB1
测序
<>=>@
!
$12
的全长拼接及测序
!
对
%a(2105
及
&a(2105
获得的
=AB1
片段进行拼接!并用引物扩
+"$!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
表
<
!
C(%
所用引物
U7C8F#
!
[02
D
X-6FX.
类型
U
ZD
F
编号
B<6CFX
引物序列
[X-6FX.F
Q
&a(%a
#
&a(2105
2&@#(# &a(U00UE10E10EEU1
2&@#(! &a(1E0101U0E101E010UEE0
2&@#(% &a(U0E0E0EUU0EEE110UUEU
%a(2105
%a0A3
D
X-6FX1 &a(11E01EUEEU1U0110E01E1EU10
"
U
#
%"bB(%a
%!$(# &a(00UU0001E111001E0EUEE1E1E1U
%!$(! &a(E1U100UE11UE1000EE11U00101
扩增全长引物
[X-6FX.9>76
D
8->-=7V-9/
><8(8F/
:
V;.F
Q
K0&@#2 &a(UEE1U0UE101EUU00U0E
2B1-
载体构建引物
[X-6FX.9>=9/.VX<=V-9/\F=V9X
$0LG763W &a(7V
::
7V==UE1000UE11U00101U0
$0LOC732 &a(7VV=V7
:
701UUEE01110U0UE0U0U
$0LO;91W &a(7V=V=
:
7
:
UE1000UE11U00101U0
$0LI
D
/12 &a(7V
::
V7=01UUEE01110U0UE0U0U
AB1
水平检测引物
[X-6FX.9>AB1YFVF=V-9/
%&3 &a(0E01011U00010U1U00U
$0L(2B1- &a(UE1000UE11U00101U0
2B1
水平检测引物
[X-6FX.9>2B1YFVF=V-9/
$!"(2B1(W &a(UEE010UEUUEU01EE11UE
$!"(2B1(2 &a(EUUEU0UE0UUUU10010E11U
!!
注$表中大写字母表示引物的序列!小写字母表示在引物上加的接头序列
B9VF
$
[X-6FX.F
Q
-V788FVVFX
!
7/Y
,
Q
X-9XV9
D
X-6FX.F
Q
图
#
!
2B1
干扰植物表达载体结构图
1*
正向片段&
3*
反向片段
W-
:
*#
!
3VX<=V
D
87/VF?
D
XF..-9/\F=V9X9>2B1-
1*W9X]7XY>X7
:
6F/V
&
3*2F\FX.F>X7
:
6F/V
增
$!"
全长序列!
[02
产物电泳检测!回收纯化片
段!连入载体
D
JA
#@
U
进行
AB1
测序
<*=*D
!
序列生物信息学分析
!
对获得的亚麻木质
素合成酶基因
$!"
的全长序列进行生物信息学分
析使用
B0GN
网站上的
G87.V/
进行核苷酸序列同
源性分析!利用
AB1..-.V
进行蛋白质的等电点*分
子量计算和一些理化性质预测!蛋白质的二级结构
采用
396
D
7
网站在线进行分析及预测"
;VV
D
$%%
/
D
.7(
D
C-8*-C=
D
*>X
%
=
:
-(C-/
%
/
D
.7
-
7
8
.
D
7
:
F
c/
D
.7
-
.9
D
67*;V68
#!蛋白质的三级结构预测使用
%A([33J
"
;VV
D
$%%
]]]*.C
:
*C-9*-=*7=*
D
;
Z
XF!
%
;V68
%
D
7
:
F*=
:
-
.
-Yc-/YF?
#!应用
J5E1
$*"
软件进行多序列比对!并构建系统进化树
<>=>E
!
$12
基因
%&#
载体构建
!
以
$!"
基因的
编码序列作为靶序列!通过引入不同的酶切位点"顺
式片段引入
65P
%
和
78
%
酶切位点!反式片段
引入
7-3
%
和
9
4
1
%
酶切位点#!以正向和反向分
别插入中间载体
D
G3I
连接的
%A(8-/HFX
片段"大约
#$"C
D
#两端!最后将
2B1-
片段"即顺式
d%A(L-/(
HFXd
反式#连接到表达载体
D
#%"#J
上"图
#
#将
表达载体转化大肠杆菌
AP&
"
!用菌落
[02
初步筛
选阳性克隆!送华大测序
<>=>F
!
$12
基因
%&#
载体转化亚麻
!
将筛选到
的正确克隆采用冻融法(#!)转化根癌农杆菌
5P1#"&
!
阳性转化菌株检测采用菌落
[02
方法(#%)采用根
癌农杆菌介导的下胚轴方法(#$)将外源基因导入亚
麻+中亚麻
$
号,组织!并在含潮霉素的
J3
分化培
养基上筛选转基因苗对浸染的材料进行
ER3
瞬
时检测!方法参考
eF>>FX.9/
等(#&)用
MJ5E1
试
剂盒提取亚麻总
AB1
!以转化植株的总
AB1
为模
板!用
%&3
上游引物和
$!"2B1-
下游引物进行
[02
验证用
MJ5E1
试剂盒提取亚麻总
2B1
!
$!"(2B1(W
和
$!"(2B1(2
为上下游引物!以亚麻
:;)*1
基因"登录号为
1S@&)@+&
#为内参基因!进行半
)"$!
#!
期
!!!!!!!!!!!!!!
龙松华!等$亚麻
$!"
基因克隆及
2B1-
遗传转化
定量
2U([02
分析(#+)验证
!
!
结果与分析
=><
!
总
%&
提取及亚麻
$12
基因的
%()
扩增
亚麻总
2B1
的提取电泳结果"图
!
#显示!提取
的亚麻总
2B1
的
!@3
和
#@3
条带清晰!表明所提
取的
2B1
完整性好经测定!所提取总
2B1
的
MA
!+"
%
!@"
为
#*4+
!说明提取
2B1
样品纯度较高适
合于
2105
操作根据已克隆的亚麻
$!"
基因片
段!设计
&a(2105
引物
E3[(#
*
E3[(!
和
E3[(%
以亚麻茎秆茎皮总
2B1
为模板!以引物
E3[(#
合
成第一链
=AB1
以
=AB1
第一链为模板!分别用
E3[(!
*
E3[(%
为引物进行两轮
&a(2105
扩增
[02
产物经
#^
琼脂糖凝胶电泳分析!检测到一条
#"""
#
!"""C
D
的特异扩增条带"图
%
#切胶回收
纯化测序之后证明是目的条带!克隆测序实际大小
为
##@"C
D
以亚麻茎秆茎皮总
2B1
为模板!分别
用
%!$(#
*
%!$(!
与
R[J
为引物进行两轮
[02
扩
增
[02
产物经
#*"^
琼脂糖凝胶电泳分析!得到
一条约
+""C
D
的特异扩增条带"图
$
#克隆测序实
际大小为
+$%C
D
=>=
!
亚麻
$12
基因的全长序列扩增及分析
以
&a(2105
及
%a(2105
的测序结果为依据设
计引物!进行亚麻木质素合成酶
$!"
的全长序列扩
增
#^
琼脂糖凝胶电泳检测
[02
产物!得到一条
长度在
#"""
#
!"""C
D
之间的片段"图
&
#测序
结果实际大小为
#4&)C
D
!
EF/G7/H
登录号为
I0@%!@+$
!该序列含有
#+&"C
D
完整的开放阅读
图
!
!
亚麻总
2B1
W-
:
*!
!
U;F>87?V9V782B1
图
%
!
$!"
基因的
&a(2105
J*AL!"""
&下同
W-
:
*%
!
&a(21059>$!"
:
F/F
J*AL!"""
&
U;F.76F7.CF89]
框!
&a
非编码区长
#$$C
D
!
%a
非编码区长
#+%C
D
B0GN
上
G87.V/
结果分析表明!亚麻
$!"
基因的核
苷酸序列与
EF/G7/H
中其他生物的
AB1
或
=AB1
序列具有较高的相似性采用
J5E1$*"
软件对
基因序列进行比对!从系统进化树"图
+
#可以看出!
亚麻"
"*1050(*))*((*505
#与盐芥"
,-.//01
2
*.//
-/3
4
-*/
#聚为一支!表明其亲缘关系较近同属
禾本科的水稻"
#$
%
&()*+
#*玉米"
<.5
%
(
#*小
米"
=.)$**)/*;
#和黑麦草"
3/*05
4
.$.11.
#聚为
一支!表明他们与亚麻的亲缘关系最远
=>?
!
$(G
蛋白结构分析
=>?><
!
亚麻
$(G
蛋白氨基酸理化性质及亲水性分
析
!
利用生物信息学软件
AB1..-.V
对
$0L
蛋白氨
基酸理化性质进行预测!结果表明该蛋白由
&$4
个
氨基酸组成!相对分子量为
+"HA
!等电点为
&*%
由表
!
可知!亚麻
$!"
基因
=AB1
编码产物的氨基
酸组成!包括了
!"
种基本氨基酸其中亮氨酸出现
最多"
&$
个#!其次是异亮氨酸"
$"
个#和缬氨酸"
$"
个#!出现最少的是色氨酸"
!
个#从氨基酸的类型
来看!
4
种非极性氨基酸总共有
!4&
个!占总数的
&%*)^
&
+
种不带电的极性氨基酸有
#!%
个!占总数
的
!!*$^
&
%
种带正电荷的氨基酸有
+$
个!占总数
的
##*)^
&
!
种带负电荷的氨基酸有
+)
个!占总数
的
#!*!^
从整体上看!
$0L
蛋白中非极性氨基酸
的数量略高于极性氨基酸因此可以推断!
$0L
蛋
白的疏水部分略高于亲水部分
图
$
!
$!"
基因的
%a(2105
W-
:
*$
!
%a(21059>$!"
:
F/F
图
&
!
$!"
基因的全长扩增
W-
:
*&
!
16
D
8->-=7V-9/9>><8(8F/
:
V;$!"
:
F/F
@"$!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
图
+
!
植物
$!"
基因同源关系图
W-
:
*+
!
[;
Z
89
:
F/FV-=VXFF9>V;F$!"
:
F/F.
表
=
!
亚麻
$12
基因
8H&
编码产物的氨基酸组成
U7C8F!
!
096
D
9.-V-9/9>$!"76-/97=-Y.>X96>87?
氨基酸类别
07VF
:
9X
Z
9>76-/97=-Y
氨基酸
16-/97=-Y
数量
K<7/V-V
Z
类别总数
U9V78
所占百分比
[FX=F/V
%
^
非极性
B9/
D
987X
甘氨酸
E8
Z
=-/F %)
甲硫氨酸
JFV;-9/-/F #%
色氨酸
UX
ZD
V9
D
;7/F !
苯丙氨酸
[;F/
Z
8787/-/F !$
脯氨酸
[X98-/F %% !4& &%*)
异亮氨酸
N.98F<=-/F $"
亮氨酸
LF<=-/F &$
缬氨酸
b78-/F $"
丙氨酸
187/-/F &!
极性不带电荷
[987X:
FY
丝氨酸
3FX-/F %&
苏氨酸
U;XF9/-/F !$
半胱氨酸
0
Z
.VF-/F 4 #!% !!*$
酪氨酸
U
Z
X9.-/F #&
天冬氨酸
1.
D
7XV-=7=-Y #4
谷氨酰胺
E8
[9.-V-\F8
Z
=;7X
:
FY
赖氨酸
L
Z
.-/F %"
精氨酸
1X
:
-/-/F !$ +$ ##*)
组氨酸
P-.V-Y-/F #"
带负电荷
BF
:
7V-\F8
Z
=;7X
:
FY
天冬氨酸
1.
D
7XV-=7=-Y
谷氨酸
E8
%%
+) #!*!
=>?>=
!
亚麻
$(G
蛋白二级和三级结构预测
!
利用
在线软件
396
D
7
分析
$0L
蛋白的二级结构参数
结果"图
)
#表明!该蛋白质的
"
(
螺旋"
"
(;F8-?
#占
%#*+4^
!延伸主链占
!"*"$^
!
&
(
转角"
&
(V
)*$)^
!无规则卷曲"
X7/Y96=9-8
#占
$"*@"^
$0L
的主要结构是无规则卷曲!其次是
"
(
螺旋蛋白质
的三级结构是蛋白质的多肽链在二级结构的基础上
再进一步盘曲*折叠形成具有一定规律的三维空间
结构稳定蛋白质三级结构主要是次级键!包括氢
键*疏水键*盐键以及范德华力等利用
%A([33J
预测
$0L
蛋白序列的三级结构"图
@
#以
=%/-!1
-
蛋白作为模体分析!与该蛋白相似度为
@"^
!预测
可信度为
#""^
预测结构包含了
&!@
个氨基酸!
占总数的
4)^
!
$!"
基因编码蛋白三级结构中含有
丰富的无规则卷曲和
"
(
螺旋!少量的
&
(
转角!与二级
结构预测结果一致
=>$
!
亚麻
$12%&#
表达载体构建及遗传转化
通过载体测序!载体插入的基因序列与目的基
4"$!
#!
期
!!!!!!!!!!!!!!
龙松华!等$亚麻
$!"
基因克隆及
2B1-
遗传转化
图
)
!
$0L
蛋白的二级结构
"
(
螺旋
*
蓝色&延伸主链
*
红色&
&
(
转角
*
绿色&无规则卷曲
*
紫色
W-
:
*)
!
U;F.F=9/Y7X
Z
.VX<=V
"
(;F8-?*G8
5?VF/YFY.VX7/Y*2FY
&
&
(V
27/Y96=9-8*[
8F
图
@
!
$0L
蛋白序列三级结构预测
W-
:
*@
!
[XFY-=V-9/9>%A.VX<=V
.F
Q
X9VF-/9>$0L
图
4
!
$!"(2B1-
转基因亚麻
[02
检测
J*J7XHFX
$
&
#*
质粒对照&
!*
非转基因野生型亚麻&
%
#
)*
转基因阳性植株&
@*
转基因假阳性植株
W-
:
*4
!
[027/78
Z
.-.9>$!"(2B1-VX7/.>9X6FY
D
87/V.
J*J7XHFX
$
&
#*[87.6-Y=9/VX98
&
!*T-8Y>87?
&
%)*UX7/.
:
F/-=
D
87/V.
&
@*BF
:
7V-\FVX7/.
:
F/-=
D
87/V.
图
#"
!
亚麻
$!"(2B1-
转基因植株
2U([02
结果
#*
非转基因野生型亚麻&
!
#
+*$!"(2B1-
转基因亚麻
W-
:
*#"
!
2U([027/78
Z
.-.9>$!"(2B1-VX7/.
:
F/-=>87?
#*B9/VX7/.
:
F/-=]-8YV
ZD
F>87?
&
!+*$!"(2B1-VX7/.
:
F/-=>87?
因一致本实验通过遗传转化体系的优化!获得一
些
$!"(2B1-
的转基因植株从中随机挑出
)
株
进行分子检测提取转基因亚麻苗的
AB1
!
[02
扩增结果"图
4
#表明!转基因亚麻除了
@
号泳道没
有检测出目的条带!其余
%
#
)
都扩增出
&#)C
D
的目
的条带说明
%
#
)
为亚麻转基因阳性植株为了
检测亚麻转基因阳性植株在
2B1
转录水平上是否
存在差异!以非转基因亚麻为阴性对照!采取
2U(
[02
半定量分析方法"图
#"
#!转入
$!"(2B1-
载体
的转基因阳性植株的
$!"
基因的表达量显著低于
非转基因植株说明转入
2B1
干扰片段明显影响
了
$!"
基因的正常表达
%
!
讨
!
论
本实验首次克隆到亚麻木质素合成关键酶基因
$!"
全长序列!并对其进行生物信息学分析!预测
了该基因的一些功能及特征近年生物信息学学科
得到了快速发展!通过把基因全长序列提交到各种
类型的数据库进行比对预测!得到了大量的与该基
因相关信息!一方面这些信息对我们有很好的参考
价值!但另一方面!这只是预测性结果!还有待于后
续实验进行验证因此我们以克隆的
$!"
基因作
为靶序列!通过引入不同的酶切位点"顺式片段引入
65P
%
和
78
%
酶切位点!反式片段引入
7-3
%
和
9
4
1
%
酶切位点#!构建了
2B1-
植物表达载体!
通过农杆菌介导法转化亚麻一方面可验证所克隆
$!"
基因功能!另一方面通过干扰基因表达而培育
低出木质素亚麻材料!为改良亚麻纤维分子育种提
供基础
以前!纤用亚麻中国主要分布在北方!如黑龙
江*新疆等地!近年来!利用南方冬闲田种植亚麻为
农民创收得到高度重视!亚麻进行南移!主要分布西
南地区亚麻移种虽然提供了一个机遇!也面临新
的问题$由于气候上的优势!西南种植的亚麻虽然产
量比北方有不小的提高!但木质素含量比北方要高
&"^
以上!这严重影响了纤维品质从而制约西南亚
麻产业的发展国外有通过转基因以降低亚麻木质
素的相关研究!
[XF-./FX8
等(#))抑制亚麻木质素合成
关键基因肉桂醇脱氢酶"
!:>
#基因表达!以降低亚
麻木质素含量而本实验并通过
2B1-
方法干扰
"#$!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
$!"
基因!以降木质素含量
!:>
和
$!"
基因都
是木质素合成苯丙烷途径中的核心酶之一!但
$!"
处于合成前期阶段!而
!:>
处于最后一阶段(#@)
因此以上所做的两个基因工程对亚麻木质素造成的
影响是不同的通过基因工程方法缩短常规育种所
需要的长周期!得到适合西南种植的亚麻品种!是加
快实施利用南方冬闲田发展亚麻产业的重要战略
木质素在植物组织中具有增强细胞壁及黏合纤
维的作用!对植物的生长起机械支持抗压的作用!还
对植物的抗逆起作用因此通过干扰基因表达降低
木质素含量对植物生长会产生负面的影响本实验
选择
$!"
基因作为干扰对象!是因为该基因在韧皮
部有一定的特异性表达!而在木质部的表达量比较
低(#4)!因此干扰作用主要针对于韧皮部!这样既改
善韧皮纤维的品质!又减小对植物正常生长的影响
本实验的后续研究将克隆亚麻韧皮部特异启动子!
代替正使用的
%&3
植物通用启动子!完善亚麻木质
素
2B1-
干扰转基因研究
参考文献!
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