全 文 ：书西北植物学报!
"#$
!
%$
"
&
#$
#"%(#")
!"#$%&#%&()$*+,""-.)/#0-/
!!
文章编号$
#"""*$"!+
"
!"#$
#
"&*#"%*",
!!!!!!!!!!!!!!!
!"#
$
#"-,&"&
%
.
-/001-#"""*$"!+-!"#$-"&-#"%
收稿日期$
!"#$*"!*!
&修改稿收到日期$
!"#$*"+*#)
基金项目$国家自然科学基金"
%#%&""+&
#&教育部高校博士学科点基金"
!"#!#+#+##""",
#&国家高技术研究发展计划"
!"##22#""!"%
#
作者简介$冯宗琪"
#),(
#!女!在读硕士研究生!主要从事植物分子生物学研究
3*45/6
$
781
9
:;1
9<
/8=
!
#&%->;4
"
通信作者$李国婧!博士!教授!博士研究生导师!主要从事植物分子生物学研究
3*45/6
$
6/
9
?;
.
/1
9!
/45?-8@?-->1
中间锦鸡儿
1-23%$%
基因克隆及表达分析
冯宗琪#!韩晓敏#!杨
!
杞#!邢丹丹#!齐力旺!!王瑞刚#!李国婧#"
"
#
内蒙古农业大学 生命科学学院!呼和浩特
"#""#
&
!
中国林业科学院林业研究所!北京
#""")#
#
摘
!
要$该研究以中间锦鸡儿"
!"#"
$
"%"&%(#)(*&"
#为材料!利用
A2B3
技术克隆了
!&+,-&
基因的全长序列
对
!&+,-&
的基因组
CD2
和
>CD2
全长分析显示!
&+,-&
基因无内含子!开放阅读框为
+!E
F
!编码
!$
个
氨基酸预测
!&+,-&
基因编码的蛋白质等电点为
-)+
!分子量约为
%#$+)-$C5
序列比对和系统进化分析表
明!该蛋白和大豆的
G4HIJ&
一致性最高!达到
&,K
构建了
!&+,-&
基因与
./0
融合表达质粒!激光共聚
焦显微镜观察发现!融合蛋白定位于细胞核用实时荧光定量
LBA
技术对在不同胁迫条件下
!&+,-&
基因的表
达检测结果表明!在干旱和低温处理下
!&+,-&
均受到不同程度的诱导!暗示
!&+,-&
基因可能与中间锦鸡儿
响应逆境胁迫有关
关键词$中间锦鸡儿&
HIJ
&基因克隆&表达分析
中图分类号$
M,+
&
M,&
文献标志码$
2
&"(#(
)
*(!+,
-
./00#"(1(*
2
0#0"31-23%$%
3."41$($
4
$/$-/#)(5).-$
N3DGO;1
9<
/
#
!
P2DQ/5;4/1
#
!
I2DGM/
#
!
QRDGC51@51
#
!
MRS/T51
9
!
!
U2DGA?/
9
51
9
#
!
SRG?;
.
/1
9
#
"
"
#B;68
9
8;7S/78V>/81>80
!
R118=H;1
9
;6/52
9
=/>?6W?=56X1/Y8=0/W
Z
!
P;[[;W"#""#
!
B[/15
&
!A8085=>[R10W/W?W8;7N;=80W=
Z
!
B[/*
18082>5@84
Z
;7N;=80W=
Z
!
J8/
.
/1
9
#""")#
!
B[/15
#
1506.*76
$
2HIJ81>;@/1
99
818T50>6;18@E
Z
A2B3
"
=5
F
/@54
F
6/7/>5W/;1;7>CD281@0
#
W8>[1/
<
?87=;4
!"#"
$
"%"&%(#)(*&"-\[8
9
CD251@7?6*681
9
W[>CD208
<
?81>85156
Z
0/0=8Y8568@W[5WW[/0
9
818>;1W5/10
1;/1W=;1-\[87?6681
9
W[]ANT50+!E
F
!
51@W[8@8@?>8@
F
=;W8/1>;4
F
=/08@!$54/1;5>/@0T/W[5>56*
>?65W8@4;68>?65=T8/
9
[W;7%#$+)-$C5
!
50T865051/0;868>W=/>
F
;/1W;7-)+-V8
<
?81>856/
9
1481W0[;T8@
W[5WW[/0HIJ
F
=;W8/1/0=865W/Y86
Z
>6;08W;G4HIJ&
!
T/W[51/@81W/W
Z
;7&,K
!
0;W[8
9
818T501548@50
!&+,-&1!&+,-&51@./07?0/;1Y8>W;=T50>;10W=?>W8@
!
51@GNL76?;=80>81>8T50;E08=Y8@/1W[8
1?>68/?1@8=>;17;>566508=0>511/1
9
4/>=;0>;
F
8-A856*W/48
<
?51W/W5W/Y8LBA5156
Z
0/00[;T8@W[5WW[8W=51*
0>=/
F
W;7!&+,-&T50/1@?>8@0W=;1
9
6
Z
?1@8=@=;?
9
[W51@>;6@W=85W481W-\[808=80?6W0/1@/>5W8@W[5W!&2
+,-&4/
9
[WE8/1Y;6Y8@/10W=800=80
F
;1080;7!1&%(#)(*&"-
8/
2
9".!0
$
!"#"
$
"%"&%(#)(*&"
&
HIJ
&
9
818>6;1/1
9
&
8^
F
=800/;15156
Z
0/0
!!
转录因子"
W=510>=/
F
W/;175>W;=
!
\N
#又称为反
式作用因子!是指能与基因启动子区域中的顺式作
用元件发生特异性结合!通过它们之间以及与相关
蛋白之间的相互作用!激活或抑制转录(#)转录因
子对动*植物的生长发育以及生理代谢调控都有十
分重要的作用
#)!
年!从禽成髓细胞瘤病毒"
5Y/*
514
Z
86;E650W;0/0Y/=?0
#中鉴定出第一个
+,-
基
因"
32)
4
5
#随后发现在正常的动物细胞中也存在
相应的原癌基因
62)
4
5

#),
年!首次从植物中克隆
出
62)
4
5
的同源基因此后!大量的植物
+,-
基因
被发现!成为最大的植物转录因子家族之一(!*%)
HIJ
转录因子的
D
端具有一个特殊的
HIJ
保守结构域!含
+#
"
+!
个氨基酸!由一系列高度保
守的氨基酸残基和间隔序列组成每个
HIJ
结构
域折叠成螺旋
*
转角
*
螺旋空间结构!其中含有
%
个
色氨酸残基!这
%
个残基被
#
"
#)
个氨基酸残基隔
开!有着疏水核心的作用($)近年来!人们已从拟南
芥*玉米*大豆*番茄等植物中分离克隆了大量的
+,-
基因(+*,)!并对这些基因的功能进行了研究
S/5;
等()鉴定了
#+&
个
.)+,-
基因!其中有
$%
个基因的表达受高盐*
2J2
*干旱或低温的影响!
.)+,-,&
*
.)+,-)!
和
.)+,-#,,
以不同方式
结合在
+-78
"
%
B22BG
%
\G2
%
B
%
\2
%
B
%
#位
点!
.)+,-)!
与
)+9:#
"
BBG222222GG2#
或
+9:$
"
\B\B2BB\2
#结合!不同的结合能力
说明这些基因可能调控不同的下游基因())拟南芥
转录因子
;+,-$$
和
;+,-#+
在抗旱*盐胁迫
等非生物胁迫过程中发挥重要作用一些
HIJ
转
录因子也参与植物的抗病虫过程$拟南芥的
;2
+,-$&
*
;+,-,!
*
;+,-,%
和小麦的
<"08+0#
分别能对灰霉病菌*根腐离蠕孢菌*斑病菌的入侵作
出应答反应(#"*#!)但
HIJ
数量庞大*功能复杂!若
要对其在植物生长发育及生理代谢过程中的调控机
理进行深入研究和解析!尚有赖于更多
+,-
基因
的克隆和功能分析
中间锦鸡儿"
!"#"
$
"%"&%(#)(*&" _?51
9
8W
P-B-N?
#是一种重要的饲料和生物质能源原料!主
要分布在中国华北和西北的干旱和半干旱地
区(#%*#$)中间锦鸡儿抗旱*防风*耐寒!保水固土能
力极强!是中国中西部荒漠化地区广泛种植的人工
灌木林树种!在防风固沙*保持水土*改善土壤养分*
保护和恢复生态平衡等方面起着非常重要的作
用(#+)
!"##
年!中国林业科学院齐力旺研究员课题
组建立了一个中间锦鸡儿转录组数据库(#&)!本研究
组从中获得了一条
+,-
基因的中间片段!进一步
克隆获得了该
+,-
基因的全长序列!并对其表达
情况进行了初步研究!为研究其在中间锦鸡儿对非
生物胁迫耐受中的作用奠定了基础
#
!
材料和方法
:-:
!
植物材料及其处理方法
中间锦鸡儿种子采自内蒙古自治区乌兰察布市
四子王旗!播种于装有营养土
*
蛭石"
#` #
#的培养钵
中!置于
!+a
*
#&[
光照%
[
黑暗的条件下培养
选取
#
个月苗龄并且长势一致的中间锦鸡儿小
苗用于实验!分别进行干旱和低温处理处理方法
为$"
#
#小心地从蛭石中取出中间锦鸡儿小苗!清水
冲洗掉小苗上的蛭石"尽量避免损伤小苗#后摆放于
滤纸上!进行干旱脱水处理&"
!
#将中间锦鸡儿小苗
置于
$a
光照培养箱进行低温处理以上
!
种处理
的取样时间均为
"
*
#
*
%
*

*
#!
和
!$[
!每个时间点取
%
株中间锦鸡儿幼苗将采集到的小苗地上部分样
品于液氮中速冻!
("a
冰箱保存用于
AD2
提取
:;<
!
基因组
=>1
*总
?>1
提取及反转录
采用 天 根 植 物 基 因 组
CD2
提 取 试 剂 盒
"
CL%"+*"!
#进行中间锦鸡儿基因组
CD2
的提取!
操作按说明书进行
利用
\AR:;6
"
R1Y/W=;
9
81
公司#试剂提取中间锦
鸡儿小苗总
AD2
用
M?5T86
公司的
M+"""
分光
光度计对
AD2
进行浓度测定!
#K
浓度的琼脂糖凝
胶电泳检测
AD2
质量选用条带完整且清晰的
AD2
进行
>CD2
的合成
:;@
!
7=>1
末端快速扩增
在中间锦鸡儿转录组数据库"中国林业科学院
齐力旺研究员惠赠#中(#&)!得到一条与大豆
.)2
+,-&
基因同源的
3V序列!该序列长
#"+!E
F

利用该序列直接设计
A2B3
扩增引物
!&+,-&*
%b*;?W8=
*
!&+,-&*%b*/1W8=
和
!&+,-&*+b*;?W8=
*
!&+,-&*+b*/1W8=
"表
#
#
A2B3
扩增的具体实验
操作根据大连宝生物
A2B3
试剂盒"
\5_5A5
公
司#说明书进行将扩增产物连入
F
HC#)*载体
中!转化大肠杆菌
CP+
#
感受态细胞!菌落
LBA
及
酶切验证后!菌液送华大测序
:;A
!
1-23%$%
基因
7=>1
和
)
=>1
全长克隆
根据
%b*A2B3
和
+b*A2B3
测序获得的序列与
中间片段进行拼接!获得中间锦鸡儿
+,-&
基因
全长的
>CD2
序列!设计特异性的全长引物对拼接
结果进行验证以中间锦鸡儿
>CD2
为模板!以
N*
!&+,-&
和
A*!&+,-&
为引物"引物
+b
端分别加
=>?
$
和
7"6
$
酶切位点#!利用高保真酶
L=/48*
V\2A
"
\5_5A5
公司#进行
LBA
扩增扩增程序$
)a
预变性
!4/1
!
)a
变性
#"0
!
+a
退火
#+0
!
,!a
延伸
#4/1#"0
!
,!a
补充延伸
#"4/1
!
%+
个
循环
#K
浓度的琼脂糖凝胶电泳检测
LBA
产物
以中间锦鸡儿
9
CD2
为模板扩增基因组全长反
应条件同
>CD2
扩增!延伸时间改为
!4/1

>CD2
$"#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
表
:
!
本研究所用的全部引物
\5E68#
!
26W[8
F
=/48=0?08@/1W[/00W?@
Z
引物类型
L=/48=W
ZF
8
引物名称
L=/48=1548
引物序列"
+b*%b
#
L=/48=08
<
?81>8
"
+b*%b
#
%b*A2B3
引物
%b*A2B3
F
=/48=0
!&+,-&*%b*;?W8=
!&+,-&*%b*/1W8=
G2GBBB\G22G2GG2BG222
G2GB222\BB2\\BB2GG\B
+b*A2B3
引物
+b*A2B3
F
=/48=0
!&+,-&*+b*;?W8=
!&+,-&*+b*/1W8=
G2BB\GG22\GG2\\\GB\B2
GB\\B\\B22\G\\\BG\BB\B
全长引物
N?6*681
9
W[
F
=/48=0
N*!&+,-&
GBB\BG2G2\GG2\\BGGB222G222G2B
!!
=>?
$
A*!&+,-&
GB2B\2G\B\2B\B2\2\\\B\B\2B\BG2BBB!!
7"6
$
内参基因
R1W8=156>;1W=;6
F
=/48=0
N*:/#
!
*=W
A*:/#
!
*=W
\GGG\GGG2B2\\B\B\G2\GB2BGG\\B2B\\B\\B\\2GB
A\*LBA
引物
A\*LBA
F
=/48=0
N*!&+,-&*=W
A*!&+,-&*=W
B2GG\\BGG\22B22G\GGGB
2G2G\2\BBG\G2\GGB2G2GB2
GNL
引物
GNL
F
=/48=0
!&+,-&*#
GB2G2\B\B2\GG2\\BGGB222G222G2B
!!
-
$
@
%
!&+,-&*!
GB2B\2G\B\BG2BBB\GBB22\\BB
!!
7
A
(
$
和
9
CD2
扩增产物连入平末端载
F
32VI*J6?1W*"全式金公司#!转化大肠杆菌
CP+
#
感受态!菌落
LBA
及酶切验证后!菌液送测序
:-B
!
表达载体的构建
测序鉴定无误的菌液!提取质粒!用特异引物
!&+,-&2#
和
!&+,-&*!
扩增目的片段!连接到
F
32VI*J6?1W*上再次测序正确后!提取质粒!
与目的质粒
F
B54E/5#%"!
都用
-
$
@
%
和
7
A
(
$
共酶
切后!将目的片段依靠酶切位点的粘性末端连接到
F
B54E/5#%"!
上载体构建完成后!用质粒原有序
列和目的片段上的酶切位点进行酶切验证
:;$
!
1-23%$%
基因表达分析
利用得到的中间锦鸡儿
!&+,-&
基因序列设
计荧光定量引物
N*!&+,-&*=W
和
A*!&+,-&*=W

使用
VIJA
&
G=881R
荧光染料法!在
S/
9
[WB
Z
*
>68=$"
"
A;>[8C/5
9
1;0W/>0
#实时荧光定量
LBA
仪
上对中间锦鸡儿幼苗胁迫处理下基因的转录表达水
平进 行 分 析根 据
VIJA
&
L=84/^ 3^ <"
B
\H
"
\5_5A5
#试剂盒说明书配制反应体系!每个反应
%
个平行反应体系中含有
#"

SVIJA
&
L=84/^ 3^
<"
B
\H
!引物各
"-$

S
"
#"

4;6
%
S
#!稀释的
>CD2
模版
+

S
!灭菌水
$-!

S
!总体系
!"

S
反应程
序为
)+a
预变性
%"0
!
)+a
变性
+0
!
&"a
退火
#+
0
!
,!a
延伸
%"0
!
$"
个循环反应结束后做溶解曲
线分析已报道的中间锦鸡儿
3N#
#
作为内参基
因(#,)!(##!W法分析数据
本实验所用引物由上海生工生物工程技术服务
有限公司合成!测序由华大基因研究中心"
JGR
#完
成实验所用引物见表
#

:-C
!
数据分析
本研究所用引物由软件
L=/48=+
设计利用
DBJR
"
[WW
F
$%%
TTT-1>E/-164-1/[-
9
;Y
%
E650W
%
J650W->
9
/
#进行序列比对分析!使用
DBJR
中的开放
阅读框查找工具
]AN7/1@8=
"
[WW
F
$%%
TTT-1>E/-
164-1/[-
9
;Y
%
9
;=7
%
9
;=7-[W46
#分析开放阅读框!并
利用
H3G2+
进行系统进化分析利用
3^ L2V
Z
"
[WW
F
$%%
T8E-8^
F
50
Z
-;=
9
%
F
=;W
F
5=54
%#数据库中的
L=;WL5=54
软件推导氨基酸序列的分子量*理论等
电点*氨基酸残基数等理化性质利用
3^ L2V
Z
数
据库中的
PDD
工具"
[WW
F
$%%
1
F
05*
F
E/6-/E>
F
-7=
%
>
9
/*E/1
%
1
F
05
+
5?W;45W-
F
6
,
F
5
9
8c
%
DLV2
%
1
F
05
+
[11-[W46
#分析预测蛋白质的二级结构利用
L=;WV>568
软件进行疏水性分析"
[WW
F
$%%
T8E-8^*
F
50
Z
-;=
9
%
F
=;W0>568
#
!
!
结果与分析
<;:
!
@DE?1&+
和
BDE?1&+
扩增
利用中间片段设计的引物进行
%b*A2B3
和
+b*
A2B3
扩增!电泳检测分别得到
!
条约
)""E
F
和
!+"E
F
的扩增产物"图
#
!
5
*
E
#!测序结果表明!这
!
个片段分别为
,$E
F
和
!)"E
F
将克隆得到的
+b*
A2B3
*
%b*A2B3
和中间片段拼接得到了中间锦鸡
儿
+,-&
基因设计引物对该基因序列的正确性
进行克隆验证以
9
CD2
和
>CD2
为模板!以
N*
!&+,-&
和
A*!&+,-&
为引物进行
LBA
扩增
测序结果显示!得到的
>CD2
序列长度为
#!")E
F

图
#
!
>
为中间锦鸡儿
!&+,-&
基因
>CD2
的
]AN
区域的琼脂糖凝胶电泳结果
+"#
&
期
!!!!!!!!!!!!!
冯宗琪!等$中间锦鸡儿
!&+,-&
基因克隆及表达分析
<;<
!
1-23%$%
基因序列分析
分析
9
CD2
全长和
>CD2
全长后发现该基因
无内含子将该基因的
>CD2
序列用
]AN7/1@8=
工具分析发现具备完整的开放阅读框!长度为
+!
E
F
"从
!#+
"
#"&,E
F
#!编码
!$
个氨基酸的蛋白质
"图
!
#将序列在
DBJR
上比较发现!该基因和大豆
.)+,-&
较相近!故将该基因命名为
!&+,-&
数
据库检索表明大豆的
+,-&
基因也不含有内含子
<;@
!
1-23%$%
基因生物信息学分析
对推导的氨基酸序列进行预测分析发现!该基
因编码蛋白的等电点为
-)+
!分子量为
%#$+)-$
C5
蛋白质的二级结构主要包括无规则卷曲*
#
螺
旋与
(
折叠!并且这
%
种结构均匀分布在蛋白质中!
分布比例详见表
!

用
L=;WV>568
程序对
!&+,-&
编码的多肽链
进行亲水性分析"图
%
#正值越大表示该区域越疏
水!负值越大表示该区域越亲水!介于
d"-+
到
("-+
之间的主要为两性氨基酸位于第
!$#
位的
甲硫氨酸"
H8W
#具有最高分值
#-+$$
!疏水性最强&
分 别位于第
!",
*
!"
*
!")
位的甘氨酸"
G6
Z
#*脯氨酸
图
#
!
!&+,-&
基因克隆电泳结果
5-%b*A2B3
&
E-+b*A2B3
&
>-!&+,-&
的
]AN
区域电泳结果&
H-#eECD265@@8=
N/
9
-#
!
2
9
5=;08
9
86868>W=;
F
[;=80/0;7LBA
F
=;@?>W0;7W[8>6;18@!&+,-&
5-%b*A2B3
&
E-+b*A2B3
&
>-\[8LBA
F
=;@?>W0;7W[8]AN=8
9
/;1;7!&+,-&
&
H-#eECD265@@8=
图
!
!
!&+,-&
的
>CD2
序列及其编码的氨基酸序列
N/
9
-!
!
\[8>CD208
<
?81>851@/W081>;@/1
9F
=;W8/108
<
?81>8;7!&+,-&
&"#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
"L=;
#*天冬酰胺"
201
#具有最低分值
(!-%$$
!亲水
性最强而整个多肽链中亲水性氨基酸多于疏水性
氨基酸!预示着该蛋白整体上是亲水的
从
G81J51e
中检索其它植物中报道的
+,-
基因氨基酸序列!利用
H3G2+
进行系统进化分析
"图
$
#显示!
B/HIJ&
与同属豆科的大豆
HIJ&
亲缘关系最近!一致性达到
&,K
!在进化树中被聚
类在同一分支上
<;A
!
1-23%$%
基因的亚细胞定位
将质粒
F
32VI*J6?1W*!&+,-&
"图
+
!
5
#和质
粒
F
B54E/5#%"!
"图
+
!
E
#分别用
-
$
@
%
和
7
A
(
$
进
行双酶切!构建
!&+,-&
基因与
GNL
融合表达载
体!利用浸花法获得转基因拟南芥株系垂直培养
#"@
左右!在荧光显微镜下观察转基因幼苗根中的
绿色荧光"图
&
#结果表明!
B/HIJ&
与
GNL
融
合蛋白主要定位到细胞核中
<;B
!
1-23%$%
基因的表达分析
利用荧光定量
LBA
技术对
!&+,-&
基因在
干旱和低温处理下的表达进行分析!结果显示$
!&2
+,-&
的转录水平在干旱处理
#[
就明显上升!是
未处理时的
+
倍左右!并且一直到
!$[
仍保持高水
表
<
!
&#FGH$%
蛋白二级结构
\5E68!
!
\[808>;1@5=
Z
0W=?>W?=8;7B/HIJ&
F
=;W8/1
二级结构类型
V8>;1@5=
Z
0W=?>W?=8
B/HIJ&
氨基酸残基数
\[81;-;754/1;
5>/@=80/@?80
比例
L=;
F
;=W/;1
%
K
#
螺旋
#
[86/^ ##" %-,%
(
折叠
(
0[88W !$ -$+
无规则卷曲
A51@;4>;/6 #+" +!-!
图
%
!
B/HIJ&
氨基酸序列亲%疏水性分析图
I
轴
"
值以上表示疏水区域!
"
值以下表示亲水区域
N/
9
-%
!
P
Z
@=;
F
5W[
ZF
6;W;7@8@?>8@54/1;
5>/@08
<
?81>8;7B/HIJ&
I=8
9
/;105E;Y85[
Z
@=;
F
5W[
Z
0>;=8;7:8=;5=8[
Z
@=;
F
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!
=8
9
/;10E86;T5[
Z
@=;
F
5W[
Z
0>;=8;7:8=;5=8[
Z
@=;
F
[/6/>
平的表达在
$a
的低温处理下!
&+,-&
基因表
达量随着处理时间延长逐渐升高并在
!$[
达到最
高表达水平"图
,
#!表明
!&+,-&
基因参与植物对
干旱和冷的响应
%
!
讨
!
论
中间锦鸡儿植物在漫长的进化过程中适应了各
种严酷的生长环境!具有很强的抗逆性(#)所以研
图
$
!
B/HIJ&
与其它植物
HIJ
的系统进化分析
分支上的数字表示
J;;W0W=5
F
验证中基于
+""
次
重复该节点的可信度&标尺表示演化距离&
B/HIJ-
中间锦鸡儿&
G4HIJ-
大豆&
2WHIJ-
拟南芥
N/
9
-$
!
L[
Z
6;
9
818W/>5156
Z
0/0;7B/HIJ&
51@;W[8=e1;T1HIJ0
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F
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2WHIJ-;#"5&*?
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图
+
!
重组质粒
F
32VI*J6?1W*B/HIJ&
和质粒
F
B54E/5#%"!
双酶切"
-
$
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%
7
A
(
$
#
5-
酶切重组质粒
F
32VI*J6?1W*B/HIJ&
&
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酶切质粒
F
B54E/5
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&
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重组质粒&
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质粒&
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和
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酶切产物
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&
期
!!!!!!!!!!!!!
冯宗琪!等$中间锦鸡儿
!&+,-&
基因克隆及表达分析
究中间锦鸡儿植物的抗逆相关基因并进行功能分
图
&
!
B/HIJ&*GNL
融合蛋白定位于
转基因拟南芥细胞核中
5
*
E-
F
B54E/5#%"!
空载体转基因拟南芥&
>
*
@-B/HIJ&*GNL
融合载体转基因拟南芥&
5
*
>-
荧光激发光图像&
E
*
@-
明场图像
N/
9
-&
!
B/HIJ&*GNL7?0/;1
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&
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图
,
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检测干旱和低温胁迫下
!&+,-&
基因的表达
把两种处理的
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*
%
*

*
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和对照
"[
的
!&+,-&
基因的表达水平分别进行.学生

检验/分析显著性!
其中
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""
表示
0
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&
""
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1/7/>51W@/778=81>854;1
9
054
F
6805W"-"#68Y86
析!可以从分子机制上进一步了解中间锦鸡儿的抗
逆机理本研究利用
A2B3
技术克隆了中间锦鸡
儿
+,-
基因的
>CD2
和
9
CD2
的全长序列!其开
放阅读框长
+!E
F
!预测其编码
!$
个氨基酸序
列比对和系统进化分析表明该基因和大豆的
G4*
HIJ&
一致性最高!将克隆得到的中间锦鸡儿
+,-
基因命名为
!&+,-&

许多
HIJ
转录因子参与植物的抗逆过程
HIJ
转录因子参与的干旱胁迫应答大多与
2J2
有关!
;+,-&"
和
;+,-)"
通过
2J2
信号级联
放大调控气孔运动从而参与干旱胁迫(#))
;2
+,-#%
*
;+,-#+
*
;+,-%%
和
;+,-#"#
参与
2J2
介导的应答环境信号反应(!")
;+,-&!
参
与对磷酸盐缺失的应答(,)
;+,-#"
参与了生
物和非生物胁迫的应答(!#)水稻中的
ED)
4
5$
基
因过表达能显著提高植物对低温的耐受性(!!)序
列比对和系统进化分析说明
!&+,-&
与大豆
.)2
+,-&
亲缘关系最近!与拟南芥
;+,-$$
的亲缘
关系也较接近!一致性达到
$)K

.)+,-&
和
;+,-$$
都属于
A!A%*HIJ
的
!!
亚族(!%)
;2
+,-$$
调节
2J2
介导的气孔关闭来应答生物胁
迫!同时还可能调节同亚族的其他基因"
;+,-,"
*
;+,-,%
和
;+,-,,
%
;+,-9!
#的 应 激 反
应(!$)
;+,-&
在拟南芥根的中柱鞘中负调节木
质素的沉积(!+)
;+,-&
在高温胁迫下的表达增
强!说 明 参 与 了 高 温 应 答 反 应(!%)而 大 豆 的
+,-&
目前还没有研究报道通过荧光定量
LBA
技术检测了
!&+,-&
在干旱和低温逆境胁迫下的
表达情况!结果显示
!&+,-&
都被不同程度的诱
导!表明
!&+,-&
基因在植物对这
!
种逆境的耐
受中可能起作用此外!用
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的
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溶
液*
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溶液*
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S
的
G2
%
溶液
和高温"
$!a
#处理了中间锦鸡儿一月龄苗!但在上
述处理下
!&+,-&
的表达量没有明显的变化!表
明该基因可能特异地参与了对干旱和低温的响应
!&+,-&
具体的生物学功能还有待进一步验
证为深入揭示该基因在中间锦鸡儿抵抗非生物胁
迫中的作用!我们已经构建了该基因的双元表达载
体并转化了拟南芥野生型!为后续通过转基因植物
验证该基因的功能做准备
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