全 文 ：书西北植物学报!
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!"#$)"1)!" &修改稿收到日期$
!"#$)#")!! 基金项目$四川省科技厅国际合作项目"
!"#$22""(, # 作者简介$周
!
婧"
#&&!
#!女!在读硕士研究生!主要从事植物分子生物学研究
3)45.6
$7$&(*#%(1&
!
#*%+894
"
通信作者$李成磊!博士!讲师!主要从事植物分子生物学研究 3)45.6$
%!1(###"
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+894
苦荞转录因子基因
1#2343$的 克隆及其对非生物胁迫的应答 周 ! 婧!高 ! 飞!张润敏!雒晓鹏!黄云吉!李成磊"!吴 ! 琦 "四川农业大学 生命科学学院!四川雅安 *!$"#(
#
摘
!
要$根据苦荞花期转录组数据!克隆得到 # 个苦荞 ;2<2 类转录因子基因!命名为 !"#$%$( 采用实时荧光 定量 =>? 技术!分析了非生物胁迫对苦荞芽期 !"#$%$( 基因表达的影响序列分析表明!苦荞 !"#$%$( 基因 @AB 全长 #1$!;
C
!由
,
个外显子和
*
个内含子构成!符合
DE)BD
剪接原则&
8@AB
序列包含
#
个
#"*!;
C
的开
放阅读框!编码
%$% 个氨基酸!具有 ;2<2 类蛋白典型的螺旋 ) 环 ) 螺旋保守结构域在脱落酸" BFB #( A5>6 和 =3D 模拟干旱胁迫下!苦荞芽期 !"#$%$( 基因表达量均持续上升!至 (1G 时达最大!分别为胁迫前的 ##+% 倍( #!+" 倍和 *+# 倍而在冷胁迫和 HI)F 胁迫下!苦荞芽期 !"#$%$( 基因表达量迅速下降!分别于 *G 和 #!G 降 低至胁迫前的 !(J 和 !%J 研究推测 !"#$%$( 基因以不同机制参与了苦荞对非生物胁迫的应答过程 关键词$苦荞&转录因子
;2<2
&基因克隆&非生物胁迫
中图分类号$K,1$
&
K,1*
文献标志码$B %&"# ( )!*+ , -.//#""01#2343$#1$5 & 67 (89 #$#$(-"89)!1./
,
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8
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$!& ( )* +,-"&"&+./,- & ZY50/8Y. C Z.90W58Z9Y;2<2 & O Q0Q8690.0 O & 5;.9Z.8/ZYQ// !! 植物在生长发育过程中!经常会受到多种非生 物胁迫!包括干旱(高盐(低温和紫外等!导致生长发 育迟缓!产量和品质降低*#+在漫长的进化过程中! 植物对非生物胁迫的适应性应答主要是通过复杂的 信号通路!最终激活大量胁迫相关的基因!合成多种 功能性蛋白!从而产生不同的生理和代谢应答以适 应和抵御自然界中的各种逆境*!+ 植物转录因子作为一类重要的调控蛋白!它们 通过与靶基因互作以及和其他转录因子形成复合物 激活许多抗逆相关基因的表达!以应答激素刺激和 逆境胁迫 ;2<2 类转录因子构成了植物中最大 的转录因子家族之一*%+ ;2<2 结构域由 *" 个氨 基酸组成!形成,碱性区域 ) " 螺旋 ) 环 ) " 螺旋)结构 " ;5/.8)GQ6._)699 C )GQ6._ ! ;2<2 #!其中碱性区域与 @AB 结 合 相 关!能 够 识 别 不 同 形 式 的 3);9_ " >BAAED #核心序列! 2<2 结构是其形成同源或 异源二聚体所必需*(+ ;2<2 广泛参与植物的生 长发育(次生代谢产物的合成以及抗非生物胁迫等 多种生理生化过程的调控*$+目前!已从拟南芥和
水稻中分离得到耐盐*),+(抗旱*1)&+(耐冷*#"+和耐营
养缺乏*##+等参与逆境应答相关的
;2<2
类转录因
子!并通过
BFB
依赖型途径和
BFB
非依赖型途径
激活下游抗逆相关基因的表达!参与植物的抗逆生
理过程*#!+
苦荞"
!&

(
)*
+,-"&"&+./,-
#是一种食药兼用
的小杂粮!富含黄酮类化合物!极具作为功能性食品
原料开发的潜力*#%+苦荞抗逆能力强!适应高寒(
高海拔(强紫外和干旱等恶劣环境*#(+目前!关于
苦荞抗逆方面的研究主要集中在黄酮类化合物和抗
氧化酶对活性氧"
?MX
#的清除方面
E5Z/RY9
等*#$+ 研究表明!苦荞在受到干旱(紫外和冷胁迫时!叶片 中的芦丁和槲皮素含量以及芦丁葡萄糖苷酶活性显 著上升!以此来清除胁迫条件下产生的 ?MX 董新 纯等*#*+证明苦荞通过提高抗氧化酶活性!清除因 HI)F 胁迫产生的大量 ?MX !在胁迫中后期主要通 过清除 2 ! M ! 等活性氧来抑制过氧化作用而保护细 胞然而!对于苦荞抗逆分子机制!特别是转录因子 参与抗逆生理方面的研究报道甚少本研究根据获 得的苦荞花期转录组数据!采用 ?E)=>? 和 =>? 技术克隆了苦 荞抗逆相关转录因子基因 !"0 #$%$( !通过脱落酸" BFB #( A5>6 ( =3D 模拟干旱( 冷和 HI)F 胁迫等非生物胁迫处理芽期苦荞!分析 了 !"#$%$( 基因表达对非生物胁迫的响应特征 # ! 材料和方法 :+: ! 材料及处理 ,西荞二号)苦荞种植于光照培养箱!培养基为 # % !29 O 650] 培养液!培养条件为光照 #(G %黑暗 #" G (温度" !$` !
#
a
(相对湿度
*"J
!培养至
#"
日龄
备用
BFB
胁迫$使用含
#""
#
496
%
的
#
%
!
29
O
650]
培养液处理
#"]
龄苦荞
A5>6
胁迫$使 用含 #$"4496
%
6
的
#
%
!29
O
650]
培养液处
理
#"]
龄苦荞
=3D
胁迫$使用含 %"J=3D)*""" 的 # % !29 O 650] 培养液处理 #"] 龄苦荞 HI)F 胁 迫$使用
#"V HI)F
"
%"104
#
<3@
灯照射
#"]
龄
苦荞!光照距离
%"84

(a
冷胁迫$将 #"] 龄苦荞 转移至培养条件为光照 #(G %黑暗 #"G !温度 (a ! 相对湿度 *"J 的光照培养箱分别于胁迫前 "G ( 胁迫后 * ( #! ( !( 和 (1G 分别取样品叶片!液氮冷冻 后置于 1"a 储存备用 :+; ! 方 ! 法 :<;<: ! 苦荞 1#2343$
基因克隆
!
采用改良
X@X
法*#,+提取苦荞叶片总
@AB
!采用植物
?AB9RZ
试
剂盒提取各胁迫样品的总
?AB
!并以其为模板!使
用
=Y.4QX8Y.
C
Z?EYQ5
O
Q0Zb.ZV.ZG
O
@AB3Y5/QY
"
=QYWQ8Z?Q56E.4Q
#试剂盒反转录制备
8@AB
第一
链根据本实验室获得的苦荞花期转录组数据!设
计
#
对特异引物
!"#$%$(W
"
$c)B>BD>BB>BB>) >>BBBBBDE>BB)%c #和 !"#$%$(Y "$c)BEED)
EBBBB>EEBEBE>EE>EEB>DEDE>>E)%c
#!
分别以苦荞总
@AB
和
8@AB
第一链为模板!
=>?
扩增
!"#$%$(@AB
和
8@AB
序列
=>?
产物回
收纯化后连接至
C
d@#&)E
载体!阳性克隆送上海
英骏生物公司测序
:<;<;
!
苦荞
1#2343$基因的生物信息学分析 ! 利用 @ABdBA " IQY/.90$+!!
#确定
!"#$%$(
的
开放式阅读框"
M?P
#序列并推导相应的氨基酸序
列&利用
A>FU
在线工具
F65/Z
对
!"#$%$(
氨基酸
序列进行同源比对&使用
@ABdBA
进行多重序列
比对&采用
d3DB$+" 软件!根据邻接法" 0Q. O G;9Y) - 9.0.0 O ! AN #重复 #"""" 次构建 !"#$%$( 的系统 进化树 :<;<= ! 苦荞 1#2343$
基因表达检测
!
根据
!"0
#$%$(
基因序列!设计
#
对实时荧光定量
=>?
特
异引 物
!"#$%$(KW
"
$c)>>BBBB>>E>BBB>) >>DBBBBB>)%c #和 !"#$%$(KY "$c)>BBBBD)
""(!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$卷 DEDBEB>>BBEED>ED>B)%c #以 8@AB 第一 链为模板!采用 E5e5Y5 公司实时荧光定量 =>? 试 剂盒 XTF? =YQ4._3_2& 3 Ed$
"
=QYWQ8Z?Q56
E.4Q
#!建立
#$# < 的反应体系!每个样品 % 个重 复以苦荞组蛋白$%
基因*#1+为内参基因!引物为
2%KW
"
$c)DBBBEE>D>BBDEB>>BDBBDBD) %c #和 2%KY "$c)>>BB>BBDDEBED>>E>BD>)
%c
#!采用
FUM)?B@
公司的
>PS&*?Q56)E.4QX
/)
ZQ4
进行荧光定量
=>?
!并采用
!

##
4
Z方法*#&+计算
检测数据
!
!
结果与分析
;<:
!
苦荞
1#2343$基因克隆 以苦荞 8@AB 为模板!经 =>? 扩增后得到了 # 条约 #"""; C 的特异条带"图 # #测序结果表明! 该 8@AB 序列全长 #"*!; C !与转录组数据完全一 致!命名为 !"#$%$( 基因!上述序列已提交 DQ0) F50e !登录号为 bE%$&$*& 以苦荞总 @AB 为模 板!经 =>? 扩增后得到 # 条约 !"""; C 的特异条带 "图 # #测序结果表明! !"#$%$( 基因的 @AB 全 长 #1$!;
C

根据已获得的苦荞
!"#$%$(
基因
8@AB
和
@AB
序列!利用在线软件
A>FU
进行
0R86Q9Z.]Q
;65/Z
比对!确定其全长
@AB
序列为
#1$!; C !由 , 个外显子! * 个内含子构成"图 ! #!符合标准的 DE) BD 剪切原则苦荞 !"#$%$(8@AB 序列包含 # 个 #"*!; C 的 M?P !编码 %$%
个氨基酸"图
%
#
F65/Z
C
比对结果表明!苦荞
PZ;2<2(
氨基酸序列
与其它
;2<2
蛋白在
;2<2
结构域处具有较高的
保守性选取
;2<2
家族中蒺藜苜蓿
;2<2##!
(
拟南芥
;2<2##!
和拟南芥
;2<2#!%
的保守结构
域进行多重序列比对"图
(
#!发现苦荞
PZ;2<2(
具有
;2<2
类蛋白典型的螺旋
)
环
)
螺旋"
GQ6._)699
C
)
图
#
!
苦荞
!"#$%$(
基因的扩增
P.
O
+#
!
B4
C
6.W.85Z.909W!"#$%$(
#
!
+8@AB
&
%
!
(+@AB
&
d+d5YeQY
%
图
!
!
苦荞
!"#$%$(
基因结构示意图
BED
表示起始密码子&
EBD
表示终止密码子
P.
O
+!
!
XZYR8ZRYQ].5
O
Y549W!"#$%$(
EGQBED4Q50/.0.Z.5Z9Y89]90
&
EBD4Q50//Z9
C
89]90
图
%
!
!"#$%$(
的
8@AB
序列及其推导的氨基酸序列
P.
O
+%
!
8@AB50]]Q]R8Q]54.0958.]/Q
:
RQ08Q/9W!"#$%$(
#"(!
#!
期
!!!!!!!!
周
!
婧!等$苦荞转录因子基因 !"#$%$( 的克隆及其对非生物胁迫的应答 图 ( ! !"#$%$( 保守结构域的多重序列比对 dZ;2<2##!+ 蒺藜苜蓿& BZ;2<2##! ( BZ;2<2#!%+ 拟南芥 P. O +( ! >6R/Z56V56. O 04Q0Z9W!"#$%$(90890/QY[Q]]945.0/ dZ;2<2##!+567./& ("+,8/&",9& & BZ;2<2##! ! BZ;2<2#!%+:+&#.7( ) ;.;"<&9.&8& 图$
!
!"#$%$(
与其他植物
;2<2
蛋白的系统进化树
分支上的数值代表自举置信度
P.
O
+$! =G 69 O Q0QZ.8ZYQQ9W!"#$%$(.0890ZQ_Z .^ZG9ZGQYYQ65ZQ];2<2 C Y9ZQ.0/ EGQ0R4;QY/.0ZGQ;Y508G.0].85ZQ];99Z/ZY5 C [56RQ GQ6._ #保守结构域以上表明!本研究获得的基因 序列属于 #$%$基因家族 ;<; ! 苦荞 1#2343$
基因的系统发育树的构建
根据
F65/Z
比对结果!选取与
!"#$%$(
编码的
氨基酸序列相似性较高的其它几种植物的
;2<2
进行进化树分析!这些植物
;2<2
的生物学功能均
已鉴定结果显示!该进化树聚为两大簇!
>6R/ZQY
&
和
$"图$
#
>6R/ZQY
&
由不同植物参与胁迫应
答相关的
;2<2
蛋白组成例如!在拟南芥中过表
达中国野生型山葡萄"
=.".;&-,+68;.;
#
=&>4?#
转
录因子能提高其抗冻性*!"+
>6R/ZQY
$由矮牵牛( 苹果(拟南芥等植物参与花青素合成相关的转录因 子组成例如!矮牵牛" @6",8.&< * #+.7& # @<:A# 在花的形态建成中是参与花青素合成的转录起始调 控所必须的一个转录因子*!#+ ;<= ! 苦荞 1#2343$
基因在不同胁迫下的表达分析
在非生物胁迫下!苦荞
!"#$%$(
基因的表达
结果"图
*
#显示!
!"#$%$(
在
BFB
(
A5>6
和
=3D)
*"""
胁迫下表达量上升!而在冷胁迫和
HI)F
胁迫
图
*
!
!"#$%$(
基因在非生物胁迫下的表达分析
P.
O
+*
!
3_
C
YQ//.905056
/./9W!"#$%$(
ZYQ5ZQ] .^ZG[5Y.9R/5;.9Z.8/ZYQ//Q/
后下降在
BFB
和
A5>6
胁迫下!
!"#$%$(
基因
表达量在
*

(1G
趋势一致!总体随处理时间呈现
逐渐增加的趋势!而
!"#$%$(
表达量在
=3D)*"""
胁迫后
*

(1G
持续上升!但均在
(1G
时达到最大
值!分别为胁迫前的
##+%
(
#!+"
和
*+#
倍可见!苦
荞
!"#$%$(
对
BFB
(
A5>6
和
=3D)*"""
胁迫有着
!"(!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$卷 相似的应答模式!但应答程度仍存在明显差异在 冷胁迫和 HI)F 胁迫 *G 后! "#$%$( 基因表达量 均有所下降!分别于 * 和 #!G 迅速降低至最小值! 约为处理前的 !(J 和 !%J !之后略有上升!但均在 #!G 后趋于稳定!表现出对持续性冷胁迫和 HI)F 胁迫的适应性 % ! 讨 ! 论 高等植物对非生物胁迫的适应性应答最终通过 编码多种功能性蛋白来实现 LGR * !! +研究表明!植 物在受到高盐和干旱胁迫时!会通过一系列信号转 导途径进行渗透调节!最终激活大量抗逆相关基因 的表达!合成多种功能性蛋白!来实现植物的抗逆生 理应答植物应答胁迫的调控机制表明!通过在早 期激活体内转录因子的表达!进而与各类胁迫相关 基因启动子区域内的顺式作用元件相结合!通过转 录因子在转录水平上对下游耐受性效应基因进行激 活或抑制显然!转录因子在非生物胁迫中扮演了 重要的角色 近年来!植物转录因子参与植物抗逆已成为研 究热点关于植物参与逆境胁迫的转录因子家族 中!研究较多的有 ;LU= 类(锌指蛋白" V?bT #类( B=! % 3?3F= 类( AB> 类和 dTF 类转录因子$
大
类*!%+目前对于
;2<2
类的转录因子参与植物抗
逆方面的研究主要集中在拟南芥和水稻等模式植
物!对于苦荞中该类蛋白的功能研究报道尚少本
实验根据苦荞花期转录组数据克隆得到的
;2<2
类蛋白基因
!"#$%$(
的
8@AB
和
@AB
序列!其
编码蛋白具有
;2<2
类蛋白的典型特征保守基序
多序列比对结果表明!
PZ;2<2(
和其它
;2<2
蛋
白仅在
;2<2
结构域处保守性较高!而在其它区域
保守性较低!这也决定了该类蛋白质功能的多样性
系统进化树分析表明!苦荞
PZ;2<2(
与抗逆相关
的
;2<2
蛋白聚为一簇!推测
PZ;2<2
可能和
BZU>3#
等
;2<2
蛋白具有类似的功能!参与苦荞
抗逆的调控
;2<2
转录因子参与的胁迫应答信号通路可
根据对
BFB
的依赖情况分为两类$BFB 依赖型途 径和 BFB 非依赖型途径*#!+研究表明!隶属于 ;2<2 家族的 BZBUF 转录因子受到外源 BFB 诱 导后表达量上升!过表达和基因敲除均改变了植物 对 BFB 的敏感性!表明 BZBUF 可能通过 BFB 获 得胁迫信号!进而参与 BFB 依赖型信号途径*!(+ 本研究中获得的苦荞 !"#$%$( 基因在 BFB 处理 芽期苦荞后其表达量上升!可能对 BFB 的诱导起 到了正调控的作用与 A5>6 和 =3D 胁迫后 !"0 #$%$( 基因表达量的变化趋势分析表明! PZ) ;2<2( 对 A5>6 和 =3D 胁迫与 BFB 胁迫有着相 似的应答模式!这与 dQ0 O 等*!$+关于陆地棉
B<0
#$%$#
基因被
A5>6
和
=3D
胁迫后其参与
BFB
或
BFB
介导应激信号通路的研究结果相似此
外!本研究发现苦荞
!"#$%$(
基因表达在冷胁迫
和
HI)F
胁迫下与
BFB
胁迫有着相反的应答模
式!其可能存在其他的应答调控机制来实现抗逆生
理过程可见!在不同逆境条件下!苦荞转录因子
!"#$%$(
基因响应性表达的复杂性因此!本研
究拟进一步开展抗逆相关生理生化和效应基因的深
入研究!为从分子水平理解苦荞抗逆生理机制和分
子育种奠定基础
参考文献!
*
#
+
!
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"光杨其#!
XMADD>2
"宋桂成#!
L2BADNP
"张金凤#!
6"&9+d96Q8R65Y8690.0
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