全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
#""")("!$
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#
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#"+,*"*
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-
+.//0+#""")("!$+!"#$+#!+!%&&
收稿日期$
!"#$)"1)!"
&修改稿收到日期$
!"#$)#")!!
基金项目$四川省科技厅国际合作项目"
!"#$22""(,
#
作者简介$周
!
婧"
#&&!
#!女!在读硕士研究生!主要从事植物分子生物学研究
3)45.6
$
7$&(*#%(1&
!
#*%+894
"
通信作者$李成磊!博士!讲师!主要从事植物分子生物学研究
3)45.6
$
%!1(###"
!::
+894
苦荞转录因子基因
1#2343$
的
克隆及其对非生物胁迫的应答
周
!
婧!高
!
飞!张润敏!雒晓鹏!黄云吉!李成磊"!吴
!
琦
"四川农业大学 生命科学学院!四川雅安
*!$"#(
#
摘
!
要$根据苦荞花期转录组数据!克隆得到
#
个苦荞
;2<2
类转录因子基因!命名为
!"#$%$(
采用实时荧光
定量
=>?
技术!分析了非生物胁迫对苦荞芽期
!"#$%$(
基因表达的影响序列分析表明!苦荞
!"#$%$(
基因
@AB
全长
#1$!;
C
!由
,
个外显子和
*
个内含子构成!符合
DE)BD
剪接原则&
8@AB
序列包含
#
个
#"*!;
C
的开
放阅读框!编码
%$%
个氨基酸!具有
;2<2
类蛋白典型的螺旋
)
环
)
螺旋保守结构域在脱落酸"
BFB
#(
A5>6
和
=3D
模拟干旱胁迫下!苦荞芽期
!"#$%$(
基因表达量均持续上升!至
(1G
时达最大!分别为胁迫前的
##+%
倍(
#!+"
倍和
*+#
倍而在冷胁迫和
HI)F
胁迫下!苦荞芽期
!"#$%$(
基因表达量迅速下降!分别于
*G
和
#!G
降
低至胁迫前的
!(J
和
!%J
研究推测
!"#$%$(
基因以不同机制参与了苦荞对非生物胁迫的应答过程
关键词$苦荞&转录因子
;2<2
&基因克隆&非生物胁迫
中图分类号$
K,1$
&
K,1*
文献标志码$
B
%&"#
(
)!*+
,
-.//#""01#2343$#1$
5
&
67
(89
#$#$(-"89)!1./
,
"/.2"34#"2#562-.//./
L2MHN.0
O
!
DBMPQ.
!
L2BAD?R04.0
!
C
Q0
O
!
2HBADTR0
-
.
!
GQ0
O
6Q.
"
!
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"
>96Q
O
Q9W<.WQX8.Q08Q
!
X.8GR50B
O
Y.8R6ZRY56H0.[QY/.Z
!
T5
)
50
!
X.8GR50*!$"#(
!
>G.05
#
34/2-)52
$
B889Y].0
O
Z9ZY50/8Y.
C
Z94Q]5Z59W!&

(
)*
+,-"&"&+./,-5ZW69^ QY.0
O
/Z5
O
Q
!
Q^8690Q]5;2<2
ZY50/8Y.
C
Z.90W58Z9Y
O
Q0Q50]]Q/.
O
05ZQ]5/!"#$%$(+EGQQ_
C
YQ//.90
C
5ZZQY0/9W!"#$%$(R0]QY5;.9Z.8
/ZYQ//Q/ Q^YQ]QZQY4.0Q];
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RQ08Q9W!"#$%$( 5^/#1$!;
C
.06Q0
O
ZG50]890Z5.0Q],Q_90/50]*.0ZY90/
!
50].06.0Q .^ZGZGQ
C
Y.08.
C
6Q9WDE)BD/
C
6.8.0
OC
Y.08.
C
6Q+
EGQ8@AB9W!"#$%$(890Z5.0/5#"*!;
C
M?P
!
G^.8GQ089]Q]%$%54.0958.]/YQ/.]RQ/
!
50]5890/QY[Q]
2Q6._)<99
C
)2Q6._]945.0+EGQQ_
C
YQ//.909W!"#$%$( 5^/R
C
)YQ
O
R65ZQ]R0]QYBFB
!
A5>650]=3D
/ZYQ//Q/+BWZQY;Q.0
O
ZYQ5ZQ] .^ZGBFB
!
A5>69Y=3DW9Y(1G
!
ZGQQ_
C
YQ//.906Q[Q69W!"#$%$(.08YQ5/Q]
Z9ZGQ45_.4R4
!
G^.8G 5^/##+%
!
#!+"50]*+#W96]/9WZGQ890ZY96
!
YQ/
C
Q8Z.[Q6
+29^ Q[QY
!
ZGQQ_
C
YQ//.90
9W!"#$%$( 5^/]9^ 0)YQ
O
R65ZQ]R0]QY896]50]HI)F/ZYQ//Q/+EGQQ_
C
YQ//.906Q[Q6]Q8YQ5/Q]Z9!(J
50]!%J9WZGQ890ZY965WZQY*G50]#!G/ZYQ//ZYQ5Z4Q0Z/
!
YQ/
C
Q8Z.[Q6
+EGQ/QYQ/R6Z//R
OO
Q/ZQ]ZG5Z!"0
#$%$(
C
5YZ.8.
C
5ZQ.0ZGQYQ/
C
90/Q
C
Y98Q//9W!1"&"&+./,-R0]QYZGQ5;.9Z.8/ZYQ//Q/.0].WWQYQ0Z4Q8G5)
0./4/+
7.
8
9"-!/
$
!&

(
)*
+,-"&"&+./,-
&
ZY50/8Y.
C
Z.90W58Z9Y;2<2
&
O
Q0Q8690.0
O
&
5;.9Z.8/ZYQ//
!!
植物在生长发育过程中!经常会受到多种非生
物胁迫!包括干旱(高盐(低温和紫外等!导致生长发
育迟缓!产量和品质降低*#+在漫长的进化过程中!
植物对非生物胁迫的适应性应答主要是通过复杂的
信号通路!最终激活大量胁迫相关的基因!合成多种
功能性蛋白!从而产生不同的生理和代谢应答以适
应和抵御自然界中的各种逆境*!+
植物转录因子作为一类重要的调控蛋白!它们
通过与靶基因互作以及和其他转录因子形成复合物
激活许多抗逆相关基因的表达!以应答激素刺激和
逆境胁迫
;2<2
类转录因子构成了植物中最大
的转录因子家族之一*%+
;2<2
结构域由
*"
个氨
基酸组成!形成,碱性区域
)
"
螺旋
)
环
)
"
螺旋)结构
"
;5/.8)GQ6._)699
C
)GQ6._
!
;2<2
#!其中碱性区域与
@AB
结 合 相 关!能 够 识 别 不 同 形 式 的
3);9_
"
>BAAED
#核心序列!
2<2
结构是其形成同源或
异源二聚体所必需*(+
;2<2
广泛参与植物的生
长发育(次生代谢产物的合成以及抗非生物胁迫等
多种生理生化过程的调控*$+目前!已从拟南芥和
水稻中分离得到耐盐*),+(抗旱*1)&+(耐冷*#"+和耐营
养缺乏*##+等参与逆境应答相关的
;2<2
类转录因
子!并通过
BFB
依赖型途径和
BFB
非依赖型途径
激活下游抗逆相关基因的表达!参与植物的抗逆生
理过程*#!+
苦荞"
!&

(
)*
+,-"&"&+./,-
#是一种食药兼用
的小杂粮!富含黄酮类化合物!极具作为功能性食品
原料开发的潜力*#%+苦荞抗逆能力强!适应高寒(
高海拔(强紫外和干旱等恶劣环境*#(+目前!关于
苦荞抗逆方面的研究主要集中在黄酮类化合物和抗
氧化酶对活性氧"
?MX
#的清除方面
E5Z/RY9
等*#$+
研究表明!苦荞在受到干旱(紫外和冷胁迫时!叶片
中的芦丁和槲皮素含量以及芦丁葡萄糖苷酶活性显
著上升!以此来清除胁迫条件下产生的
?MX
董新
纯等*#*+证明苦荞通过提高抗氧化酶活性!清除因
HI)F
胁迫产生的大量
?MX
!在胁迫中后期主要通
过清除
2
!
M
!
等活性氧来抑制过氧化作用而保护细
胞然而!对于苦荞抗逆分子机制!特别是转录因子
参与抗逆生理方面的研究报道甚少本研究根据获
得的苦荞花期转录组数据!采用
?E)=>?
和
=>?
技术克隆了苦 荞抗逆相关转录因子基因
!"0
#$%$(
!通过脱落酸"
BFB
#(
A5>6
(
=3D
模拟干旱(
冷和
HI)F
胁迫等非生物胁迫处理芽期苦荞!分析
了
!"#$%$(
基因表达对非生物胁迫的响应特征
#
!
材料和方法
:+:
!
材料及处理
,西荞二号)苦荞种植于光照培养箱!培养基为
#
%
!29
O
650]
培养液!培养条件为光照
#(G
%黑暗
#"
G
(温度"
!$` !
#
a
(相对湿度
*"J
!培养至
#"
日龄
备用
BFB
胁迫$使用含
#""
#
496
%
的
#
%
!
29
O
650]
培养液处理
#"]
龄苦荞
A5>6
胁迫$使
用含
#$"4496
%
6
的
#
%
!29
O
650]
培养液处
理
#"]
龄苦荞
=3D
胁迫$使用含
%"J=3D)*"""
的
#
%
!29
O
650]
培养液处理
#"]
龄苦荞
HI)F
胁
迫$使用
#"V HI)F
"
%"104
#
<3@
灯照射
#"]
龄
苦荞!光照距离
%"84

(a
冷胁迫$将
#"]
龄苦荞
转移至培养条件为光照
#(G
%黑暗
#"G
!温度
(a
!
相对湿度
*"J
的光照培养箱分别于胁迫前
"G
(
胁迫后
*
(
#!
(
!(
和
(1G
分别取样品叶片!液氮冷冻
后置于
1"a
储存备用
:+;
!
方
!
法
:<;<:
!
苦荞
1#2343$
基因克隆
!
采用改良
X@X
法*#,+提取苦荞叶片总
@AB
!采用植物
?AB9RZ
试
剂盒提取各胁迫样品的总
?AB
!并以其为模板!使
用
=Y.4QX8Y.
C
Z?EYQ5
O
Q0Zb.ZV.ZG
O
@AB3Y5/QY
"
=QYWQ8Z?Q56E.4Q
#试剂盒反转录制备
8@AB
第一
链根据本实验室获得的苦荞花期转录组数据!设
计
#
对特异引物
!"#$%$(W
"
$c)B>BD>BB>BB>)
>>BBBBBDE>BB)%c
#和
!"#$%$(Y
"
$c)BEED)
EBBBB>EEBEBE>EE>EEB>DEDE>>E)%c
#!
分别以苦荞总
@AB
和
8@AB
第一链为模板!
=>?
扩增
!"#$%$(@AB
和
8@AB
序列
=>?
产物回
收纯化后连接至
C
d@#&)E
载体!阳性克隆送上海
英骏生物公司测序
:<;<;
!
苦荞
1#2343$
基因的生物信息学分析
!
利用
@ABdBA
"
IQY/.90$+!!
#确定
!"#$%$(
的
开放式阅读框"
M?P
#序列并推导相应的氨基酸序
列&利用
A>FU
在线工具
F65/Z
对
!"#$%$(
氨基酸
序列进行同源比对&使用
@ABdBA
进行多重序列
比对&采用
d3DB$+"
软件!根据邻接法"
0Q.
O
G;9Y)
-
9.0.0
O
!
AN
#重复
#""""
次构建
!"#$%$(
的系统
进化树
:<;<=
!
苦荞
1#2343$
基因表达检测
!
根据
!"0
#$%$(
基因序列!设计
#
对实时荧光定量
=>?
特
异引 物
!"#$%$(KW
"
$c)>>BBBB>>E>BBB>)
>>DBBBBB>)%c
#和
!"#$%$(KY
"
$c)>BBBBD)
""(!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
DEDBEB>>BBEED>ED>B)%c
#以
8@AB
第一
链为模板!采用
E5e5Y5
公司实时荧光定量
=>?
试
剂盒
XTF? =YQ4._3_2&
3
Ed
$
"
=QYWQ8Z?Q56
E.4Q
#!建立
#$
#
<
的反应体系!每个样品
%
个重
复以苦荞组蛋白
$%
基因*#1+为内参基因!引物为
2%KW
"
$c)DBBBEE>D>BBDEB>>BDBBDBD)
%c
#和
2%KY
"
$c)>>BB>BBDDEBED>>E>BD>)
%c
#!采用
FUM)?B@
公司的
>PS&*?Q56)E.4QX
/)
ZQ4
进行荧光定量
=>?
!并采用
!

##
4
Z方法*#&+计算
检测数据
!
!
结果与分析
;<:
!
苦荞
1#2343$
基因克隆
以苦荞
8@AB
为模板!经
=>?
扩增后得到了
#
条约
#""";
C
的特异条带"图
#
#测序结果表明!
该
8@AB
序列全长
#"*!;
C
!与转录组数据完全一
致!命名为
!"#$%$(
基因!上述序列已提交
DQ0)
F50e
!登录号为
bE%$&$*&
以苦荞总
@AB
为模
板!经
=>?
扩增后得到
#
条约
!""";
C
的特异条带
"图
#
#测序结果表明!
!"#$%$(
基因的
@AB
全
长
#1$!;
C

根据已获得的苦荞
!"#$%$(
基因
8@AB
和
@AB
序列!利用在线软件
A>FU
进行
0R86Q9Z.]Q
;65/Z
比对!确定其全长
@AB
序列为
#1$!;
C
!由
,
个外显子!
*
个内含子构成"图
!
#!符合标准的
DE)
BD
剪切原则苦荞
!"#$%$(8@AB
序列包含
#
个
#"*!;
C
的
M?P
!编码
%$%
个氨基酸"图
%
#
F65/Z
C
比对结果表明!苦荞
PZ;2<2(
氨基酸序列
与其它
;2<2
蛋白在
;2<2
结构域处具有较高的
保守性选取
;2<2
家族中蒺藜苜蓿
;2<2##!
(
拟南芥
;2<2##!
和拟南芥
;2<2#!%
的保守结构
域进行多重序列比对"图
(
#!发现苦荞
PZ;2<2(
具有
;2<2
类蛋白典型的螺旋
)
环
)
螺旋"
GQ6._)699
C
)
图
#
!
苦荞
!"#$%$(
基因的扩增
P.
O
+#
!
B4
C
6.W.85Z.909W!"#$%$(
#
!
+8@AB
&
%
!
(+@AB
&
d+d5YeQY
%
图
!
!
苦荞
!"#$%$(
基因结构示意图
BED
表示起始密码子&
EBD
表示终止密码子
P.
O
+!
!
XZYR8ZRYQ].5
O
Y549W!"#$%$(
EGQBED4Q50/.0.Z.5Z9Y89]90
&
EBD4Q50//Z9
C
89]90
图
%
!
!"#$%$(
的
8@AB
序列及其推导的氨基酸序列
P.
O
+%
!
8@AB50]]Q]R8Q]54.0958.]/Q
:
RQ08Q/9W!"#$%$(
#"(!
#!
期
!!!!!!!!
周
!
婧!等$苦荞转录因子基因
!"#$%$(
的克隆及其对非生物胁迫的应答
图
(
!
!"#$%$(
保守结构域的多重序列比对
dZ;2<2##!+
蒺藜苜蓿&
BZ;2<2##!
(
BZ;2<2#!%+
拟南芥
P.
O
+(
!
>6R/Z56V56.
O
04Q0Z9W!"#$%$(90890/QY[Q]]945.0/
dZ;2<2##!+567./&

("+,8/&",9&
&
BZ;2<2##!
!
BZ;2<2#!%+:+&#.7(
)
;.;"<&9.&8&
图
$
!
!"#$%$(
与其他植物
;2<2
蛋白的系统进化树
分支上的数值代表自举置信度
P.
O
+$
!
=G
69
O
Q0QZ.8ZYQQ9W!"#$%$(.0890ZQ_Z .^ZG9ZGQYYQ65ZQ];2<2
C
Y9ZQ.0/
EGQ0R4;QY/.0ZGQ;Y508G.0].85ZQ];99Z/ZY5
C
[56RQ
GQ6._
#保守结构域以上表明!本研究获得的基因
序列属于
#$%$
基因家族
;<;
!
苦荞
1#2343$
基因的系统发育树的构建
根据
F65/Z
比对结果!选取与
!"#$%$(
编码的
氨基酸序列相似性较高的其它几种植物的
;2<2
进行进化树分析!这些植物
;2<2
的生物学功能均
已鉴定结果显示!该进化树聚为两大簇!
>6R/ZQY
&
和
$
"图
$
#
>6R/ZQY
&
由不同植物参与胁迫应
答相关的
;2<2
蛋白组成例如!在拟南芥中过表
达中国野生型山葡萄"
=.".;&-,+68;.;
#
=&>4?#
转
录因子能提高其抗冻性*!"+
>6R/ZQY
$
由矮牵牛(
苹果(拟南芥等植物参与花青素合成相关的转录因
子组成例如!矮牵牛"
@6",8.&<
*
#+.7&
#
@<:A#
在花的形态建成中是参与花青素合成的转录起始调
控所必须的一个转录因子*!#+
;<=
!
苦荞
1#2343$
基因在不同胁迫下的表达分析
在非生物胁迫下!苦荞
!"#$%$(
基因的表达
结果"图
*
#显示!
!"#$%$(
在
BFB
(
A5>6
和
=3D)
*"""
胁迫下表达量上升!而在冷胁迫和
HI)F
胁迫
图
*
!
!"#$%$(
基因在非生物胁迫下的表达分析
P.
O
+*
!
3_
C
YQ//.905056
/./9W!"#$%$(
ZYQ5ZQ] .^ZG[5Y.9R/5;.9Z.8/ZYQ//Q/
后下降在
BFB
和
A5>6
胁迫下!
!"#$%$(
基因
表达量在
*

(1G
趋势一致!总体随处理时间呈现
逐渐增加的趋势!而
!"#$%$(
表达量在
=3D)*"""
胁迫后
*

(1G
持续上升!但均在
(1G
时达到最大
值!分别为胁迫前的
##+%
(
#!+"
和
*+#
倍可见!苦
荞
!"#$%$(
对
BFB
(
A5>6
和
=3D)*"""
胁迫有着
!"(!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
相似的应答模式!但应答程度仍存在明显差异在
冷胁迫和
HI)F
胁迫
*G
后!
"#$%$(
基因表达量
均有所下降!分别于
*
和
#!G
迅速降低至最小值!
约为处理前的
!(J
和
!%J
!之后略有上升!但均在
#!G
后趋于稳定!表现出对持续性冷胁迫和
HI)F
胁迫的适应性
%
!
讨
!
论
高等植物对非生物胁迫的适应性应答最终通过
编码多种功能性蛋白来实现
LGR
*
!!
+研究表明!植
物在受到高盐和干旱胁迫时!会通过一系列信号转
导途径进行渗透调节!最终激活大量抗逆相关基因
的表达!合成多种功能性蛋白!来实现植物的抗逆生
理应答植物应答胁迫的调控机制表明!通过在早
期激活体内转录因子的表达!进而与各类胁迫相关
基因启动子区域内的顺式作用元件相结合!通过转
录因子在转录水平上对下游耐受性效应基因进行激
活或抑制显然!转录因子在非生物胁迫中扮演了
重要的角色
近年来!植物转录因子参与植物抗逆已成为研
究热点关于植物参与逆境胁迫的转录因子家族
中!研究较多的有
;LU=
类(锌指蛋白"
V?bT
#类(
B=!
%
3?3F=
类(
AB>
类和
dTF
类转录因子
$
大
类*!%+目前对于
;2<2
类的转录因子参与植物抗
逆方面的研究主要集中在拟南芥和水稻等模式植
物!对于苦荞中该类蛋白的功能研究报道尚少本
实验根据苦荞花期转录组数据克隆得到的
;2<2
类蛋白基因
!"#$%$(
的
8@AB
和
@AB
序列!其
编码蛋白具有
;2<2
类蛋白的典型特征保守基序
多序列比对结果表明!
PZ;2<2(
和其它
;2<2
蛋
白仅在
;2<2
结构域处保守性较高!而在其它区域
保守性较低!这也决定了该类蛋白质功能的多样性
系统进化树分析表明!苦荞
PZ;2<2(
与抗逆相关
的
;2<2
蛋白聚为一簇!推测
PZ;2<2
可能和
BZU>3#
等
;2<2
蛋白具有类似的功能!参与苦荞
抗逆的调控
;2<2
转录因子参与的胁迫应答信号通路可
根据对
BFB
的依赖情况分为两类$
BFB
依赖型途
径和
BFB
非依赖型途径*#!+研究表明!隶属于
;2<2
家族的
BZBUF
转录因子受到外源
BFB
诱
导后表达量上升!过表达和基因敲除均改变了植物
对
BFB
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BFB
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得胁迫信号!进而参与
BFB
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和
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胁迫有着相反的应答模
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理过程可见!在不同逆境条件下!苦荞转录因子
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基因响应性表达的复杂性因此!本研
究拟进一步开展抗逆相关生理生化和效应基因的深
入研究!为从分子水平理解苦荞抗逆生理机制和分
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