全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
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基金项目$北京市科技提升计划 "
123!"#%+"#&!"(+""""(4
!
123!"#&+"#&!"(+""""*#
#&北京市属高等学校创新团队建设项目
"
5678!"#$"$"%
#&北京市教委科技创新平台项目"
123!"#&+"#&!"(+""""#*
#&城乡生态环境北京实验室项目"
123!"#$+
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#
作者简介$田
!
娜"
#4*4)
#!女!在读硕士研究生!主要从事花卉栽培与育种研究
9+:;.<
$
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!==
,>?:
"
通信作者$张克中!博士!教授!主要从事花卉育种与产业化研究
9+:;.<
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@A@@BC
!
D.
E
,/.0;,>?:
火鹤
!$0123
基因克隆及其在
体细胞胚胎发生中的表达分析
田
!
娜!王爱香!张克中"!崔金腾!贾月慧
"北京农学院 园林学院!北京
#"!!"
#
摘
!
要$为了探讨体细胞胚胎发生相关类受体蛋白激酶"
!"#$
#基因在火鹤体细胞胚胎发生中的作用!以火鹤胚性
愈伤组织为材料!利用
F8+1GF
结合
FHG9
技术!克隆了火鹤体细胞胚胎发生相关类受体蛋白激酶基因
"
%&!"#$
#!通过实时荧光定量
1GF
"
FI;#技术分析了
%&!"#$
的相对表达量结果显示$"
#
#该基因
全长为
#4&4K
E
!包含
#*K
E
开放阅读框!编码蛋白由
!!
个氨基酸组成"
!
#预测该基因具有
!"#$
家族典型
的结构域$
#
个信号肽(
#
个亮氨酸拉链结构域(
$
个富亮氨酸重复序列结构域(
#
个
L11
基序(
#
个跨膜结构域(含
##
个亚区的激酶结构域(
#
个
G
端结构域
6MH3HM
分析显示!该基因编码的氨基酸序列与其它植物的一致性
达到
$N
"
*4N
"
%
#在离体诱导体细胞胚胎发生的各阶段中!
%&!"#$
基因在诱导阶段及发育培养阶段微弱表
达或者几乎不表达!在继代培养第
%"
天的胚性愈伤组织中表达量最高推测该基因可以作为火鹤体细胞胚胎发
生的一个标记基因
关键词$火鹤&基因克隆&
%&!"#$
基因&体细胞胚胎发生
中图分类号$
O(*$
&
O(*4
文献标志码$
H
$%"&(&!)*
+
,--#"&".!$0123/&#&!/#45(-56
$/.($)$/56
)
-0"1(2#3)14,
5
"
6
&-#-
85HMM;
!
PHMQH.B.;0
R
!
S7HMQTI@U?0
R
"
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GV5W.0JI0
R
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W5HXYIUY.
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#
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FHG9
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#
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8
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R
I0I
&
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^
?
R
I0I/./
!!
火鹤"
%()*+,*-&.+&/&*-
#是经济价值较
高的重要观赏植物之一!目前多通过组培再生不定
芽方式繁育种苗!少见通过体细胞胚胎发生方式繁
育组培苗体细胞胚胎发生方式繁育组培苗具有如
下优点$再生植株起源于单个胚性细胞!不会出现遗
传嵌合&结合液体悬浮培养或生物反应器!能高通量
生产火鹤种苗&重现胚胎发生途径!再生苗生理年龄
较小(生活力更强
现已发现!许多基因参与体细胞胚胎发生的调
控!例如
!"#$
基因*#+(
3"%4567853"97:
基
因*!+(
;%;5;77<
基因*%+(
%=%<7>!?3,@/#$
*
&
+
(
%#4$&
基因*$+等!但这些基因多是在体细胞胚胎发
生后才起作用只有类受体蛋白激酶"
/?:;J.>I:+
K]
^
?
R
I0I/./]I>I
E
J?]+<.AIA.0;/I
!
!"#$
#基因是在体
细胞由营养生长向胚性生长的转化中以及早期的体
细胞胚胎发生中起作用人们最初在胡萝卜"
9&*A*B
A&+2(&
#中发现
!"#$
基因!发现其在胚性细胞中表
达且只表达到球形胚时期!在非胚性细胞及球形期后
的体细胞胚中不表达因此!
"#$
基因被认为是胡
萝卜体胞胚发生的标记基因*#+后来!人们在鸭茅
"
9&A(
C
D,B
E
D2-/+&(&
#
*

+
(蜜桔"
6,(+*B*B),*
#
*
(
+
(仙客
来"
6
C
AD&-/
F
/+B,A*-
#
*+
(马尾松"
G,*B-&BB2,?
&&
#
*
4
+等植物中!均发现
!"#$
基因也具有标记成胚
能力的作用目前!已经从多种植物中克隆到
!"#$
基因*+##+!但火鹤
%&!"#$
基因的研究还未见报道!
对于
%&!"#$
基因与火鹤体细胞胚胎发生之间的机
理研究也未见报道若能克隆火鹤
%&!"#$
基因!
有可能建立火鹤体细胞胚胎发生的分子标记!为火
鹤体细胞胚胎发生分子机理研究提供线索前期研
究中!我们已初步建立了火鹤,阿拉巴马)体细胞胚
胎发生的形态学标记和细胞学标记的关联体系*#!+
本研究以火鹤胚性愈伤组织为材料!采用
FHG9
技术克隆火鹤
%&!"#$
基因!检测其在在
诱导(继代(发育阶段的表达模式!为研究火鹤体细
胞胚胎发生分子机理提供线索
#
!
材料和方法
:,:
!
试验材料
试验材料来源于北京农学院火鹤种质资源圃收
集的火鹤盆栽品种,阿拉巴马)
胚性愈伤组织的获得$参照先前的研究*#!+!火
鹤幼嫩叶片切块接种到
#
%
!3L` ",:
R
%
[!
!
&+6
#`,":
R
%
[+\H
培养基!黑暗培养
!
个月左右!获
得光滑紧实愈伤组织"诱导阶段#&将上述愈伤组织
切割后转至
#
%
!3L` #,":
R
%
[+\H "`,#:
R
%
[
T8 "`,$:
R
%
[MHH
培养基上!培养
#
个月后!获
得粗糙疏松愈伤组织!经镜检为胚性愈伤组织*#!+
"继代培养阶段#&胚性愈伤组织转至
#
%
!3L` ",$
:
R
%
[+\H
培养基上!通过胚状体成苗方式产生根
芽齐全幼苗"发育阶段#以继代培养阶段获得的胚
性愈伤组织为材料!进行火鹤
!"#$
基因的克隆
:,;
!
试验方法
:<;<:
!
火鹤
!$0123
基因保守片段的扩增
!
以火
鹤胚性愈伤组织为材料!采用改良
G8H法提取总
FMH

%"
#
[FMH/I+Z]II
水溶解
FMH
!
#,!N
琼脂
糖凝胶电泳检测
FMH
纯度
采用
8;T;F;
公司的反转录试剂盒进行第一链
>6MH
的合成参考扩增胡萝卜及玉米
L9FT
保
守序列所用简并引物*#!#!+设计本研究引物共应用
到
%
条上游引物和
!
条下游引物"表
#
#!组成

个
引 物 对$
L9FT+F#
和
L9FT+a%
!
L9FT+F#
和
L9FT+a&
!
L9FT+F#
和
L9FT+a$
!
L9FT+F!
和
L9FT+a%
!
L9FT+F!
和
L9FT+a&
!
L9FT+F!
和
L9FT+a$
扩增反应体系为$第一链
>6MH#,"
#
[
!
b8&
H
Q]II03.B#!,$
#
[
!上游引物
#,"
#
[
!
下游引物
#,"
#
[
将混合物混匀!短暂离心后!放
入已预热的
1GF
仪中执行以下反应$
4&c
预变性
$
:.0
!
4&c
变性
&"/
!
&*c
退火
%"/
!
(!c
延伸
&"
/
!
%*
个循环!
(!c
延伸
#":.0
!
&c
条件下保存
1GF
完成后!将产物于
#,!N
的琼脂糖凝胶中电泳
分离"图
#
!
H
#!按照北京全式金生物技术有限公司
说明书切胶回收该片段!将回收的片段连接到
E
36#*+8
载体上 "
8;T;F;
#!连接产物 转化到
J?
E
#"
感受态细胞中!挑取阳性克隆送上海英俊基
因测序中心进行测序保守片段的测序结果为后续
的
%d
端和
$d
端引物设计做准备
:<;<;
!
3=>7
末端扩增
!
根据已经获得的保守片
段分别设计
%d
端和
$d
端克隆的基因特异性引物"表
#
#!以火鹤胚性愈伤组织提取的
FMH
为材料!分别
进行
%d+FHG9
扩增和
$d+FHG9
扩增相关扩增反
应均按
8;T;F;
公司的
%d+FHG9+aY<[I0
R
JU>6+
MHT.J
"
6%#&
#和
$d+FHG9+aY<[I0
R
JU>6MHT.J
$(
&
期
!!!!!!!!!
田
!
娜!等$火鹤
%&!"#$
基因克隆及其在体细胞胚胎发生中的表达分析
"6%#$
#说明书进行这些反应包括$
%d+FHG9
的反
转录反应!
eYJI]1GF
反应!
500I]1GF
反应&
%d+
FHG9
去磷酸化处理!去帽子反应!
$d+FHG9HC;
E
+
J?]
的连接!反转录反应!
eYJI]1GF
反应和
500I]
1GF
反应将得到的扩增产物进行电泳分离!回收
扩增产物并连接至
E
36#*+8
载体!转化到
J?
E
#"
感
受态细胞中!选阳性克隆测序鉴定
:<;!
!$0123
基因
3=>7
全长的克隆
!
反转录
反应采用全式金反转录试剂盒反转录"
H8%"#+"#
#
将两端测序结果进行拼接得到全长
>6MH
序列!根
据此序列设计扩增完整
eFa
框的特异引物
a"!
(
F"!
"表
#
#!以火鹤的胚性愈伤组织
>6MH
为模版进
行全长克隆!
1GF
反应体系为$
CC7
!
e#&,(
#
[
!缓
冲液"含
3
R
!`
!
#"b8&
H
酶自带#
!,"
#
[
!
CM81/
"
#"::?<
%
[
#
",&
#
[
!上游引物
a"!
"
$"0
R
%
#
[
#
",*
#
[
!下游引物
F"!
"
$"0
R
%
#
[
#
",*
#
[
!
8&
H
聚合酶
"
$
#
%
#
[
#
",!
#
[
!
>6MH
模板
#,"
#
[
反应条件
为$
4&c
预变性
!:.0
!
4&c
变性
%"/
!
$"c
退火
%$
/
!
(!c
延伸
#!"/
!
%!
个循环!
(!c
延伸
#":.0
!
&
c
条件下保存目的片段与
8+
载体连接(转化大肠
杆菌
"0A2D,8?
E
#"
(阳性转化菌落检测阳性克隆
送上海英俊基因测序中心测序
:<;<@
!
荧光定量
A$B
验证实验
!
根据得到的
%&!"#$
基因
>6MH
全长设计实时荧光定量
1GF
特异引物
XQ+a#
(
XQ+F#
!预期扩增长度为
#!4K
E

1GF
反应体系"
!$
#
[
#$
LX\F
83
1]I:.B9B8&
H
$
"
!b
#
!,$
#
[
!
XQ+a#
"
#"
#
:?<
%
[
#
",$
#
[
!
XQ+F#
"
#"
#
:?<
%
[
#
",$
#
[
"表
#
#!
6MH
模板
!,"
#
[
!
CC7
!
e4,$
#
[
采用如下
1GF
反应程序$预变性
4$c%"/
!
4$c
变性
#"/
!
!c
退火
%"/
!
%&
个循
环将所得产物进行琼脂糖电泳后进行常规切胶回
收(连接转化(蓝白斑筛选(菌落
1GF
!挑取阳性克
隆送出测序!经验证为火鹤
!"#$
基因的片段琼
脂糖凝胶电泳检测结果表明"图
!
!箭头所指#!引物
只扩增出预期大小的片段!没有引物二聚体和杂带!
可用于实时荧光定量
1GF
反应
:<;!
荧光定量
A$B
分析
!
取不同阶段叶片或愈
伤组织为材料$诱导培养阶段第
#"
天(第
%"
天的叶
片切块边缘!第
$"
天(第
("
天的愈伤组织&继代培
养阶段第
#"
天(第
!"
天(第
%"
天的愈伤组织&发育
培养阶段第
#"
天(第
!"
天(第
&"
天(第
"
天的愈
伤组织每个阶段的样品等量取
%
份材料!采用改
良
G8H法提取
FMH
!分别检测
!"#$
基因表达
量!检测值取
%
次平均值以零处理的叶片作为对
照!对其
##
个不同时期培养物的
%&!"#$
表达进
行定量分析
1GF
反应体系"
!$
#
[
#$
LX\F
83
1]I:.B9B8&
H
$
"
!b
#
!,$
#
[
!
XQ+a#
"
#"
#
:?<
%
[
#
",$
#
[
!
XQ+F#
"
#"
#
:?<
%
[
#
",$
#
[
"表
#
#!
6MH
模板
!,"
#
[
!
CC7
!
e4,$
#
[
火鹤
!"#$
基因和
内参基因"
#*L]FMH
基因#均采用如下
1GF
反应
程序$预变性
4$c%"/
&
4$c
变性
#"/
&
!c
退火
%"/
&
$"
个循环
:,;,D
!
生物信息学分析
!
获得
>6MH
全长序列
后!将
%&!"#$
序列在
MG\5
数据库中用
\[HL8
工具进行比对分析!发现许多相似度较高的序列
用
eFa
"
?
E
I0]I;C.0
R
Z];:I
#
Z.0CI]
软件寻找开放
阅读框&用
6MH3HM
进行氨基酸翻译和蛋白质疏
水性预测!用
1]?J
E
;];:
软件分析编码蛋白的理化
性质&用
1]IC.>J1]?JI.0
软件和
50JI]1]?L>;0
软件
分别预测蛋白质二级结构和结构域&应用
83
E
]IC
软件预测跨膜结构!应用
L.
R
0;51
软件预测信号肽&
运用
39QH&
软件构建系统进化树
表
:
!
A$B
扩增所用引物及其序列
8;K!
1].:I]/;0C/I
=
YI0>I/]I
=
Y.]IC.01GF;:
E
<.Z.>;J.?0
引物名称
1].:I]0;:I
引物序列
1].:I]/I
=
YI0>I
"
$d
#
%d
# 引物功能
1].:I]ZY0>J.?0
L9FT+F#
L9FT+F!
L9FT+a%
L9FT+a&
L9FT+a$
8Q87HGF8QQQ8F8GG88Q8HF8GGH8
GQF8Q3HGPQGGH8FG85H8GH8
Q8QHHXGG88QGHGH8QQ88XGH8Q8
GG38QXGG5QQH8G8GGGGG5888
H8Q8GHG8LHGXHH8H8XHGPHGXG88GHHQ
克隆保守区
GR
?Z>?0/I]DIC]I
R
.?0
%dQL1#
%dQL1!
GHQHGQQ88GHG88Q8QQGHQ8HH
HHGG8GG88GQGG88GQ8QQH8
%d+FHG9
$dQL1%
$dQL1&
HQHG888QGGHHH8GGHGG8G88GGGHH
GG8G8QQH8GG8G88GHQGHQQ8HGH8G
$d+FHG9
a"!
F"!
HQQ8QQ8QHQQQQHQHHQH8
GQQH8HHHHH8QHQQQQ8HH
开放阅读框
GR
?Z?
E
I0]I;C.0
R
Z];:I
XQ+a#
XQ+F#
GHQHGQQ88GHG88Q8QQGHQ8HH
H8GGHGQHHQQGQHHQQHQQ88
实时荧光定量
1GFFI;<+J.:I1GF
#*L]FMHa
#*L]FMHF
GG8QHQHHHGQQG8HGGHGH8
GHGGHQHG88QGGG8GGH
内参基因
FIZI]I0>I
R
I0I/
(
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
!!
结果与分析
;<:
!
火鹤
0123
基因的克隆及序列分析
以火鹤叶片胚性愈伤组织的
>6MH
为模板进
行
F8+1GF
扩增!取

#
[
扩增产物进行琼脂糖凝
胶电泳检测
1GF
扩增结果显示$引物
L9FT+F#
和
L9FT+
a%
扩增得到
#!!&K
E
和
*!$K
E
的
!
条片段"图
#
!
H#
#!
L9FT+F#
和
L9FT+a&
扩增得到
#
条
(!K
E
条带"图
#
!
H!
#!
L9FT+F#
和
L9FT+a$
未扩增到条
带"图
#
!
H%
#!
L9FT+F!
和
L9FT+a%
扩增得到
#
条
4!!K
E
条带"图
#
!
H&
#!
L9FT+F!
和
L9FT+a&
扩
增得到
#
条
&%K
E
的条带"图
#
!
H$
#!
L9FT+F!
和
L9FT+a$
未扩增到条带"图
#
!
H
#
\[HL8M
分
析发现!扩增的
$
条序列中!有
&
条序列"除
*!$K
E
片段外#与其它植物
!"#$
基因具有较高的相似
度&
(!K
E
片段与其它植物
!"#$
基因相似度最
高!故以其作为
%d+FHG9
和
$d+FHG9
引物设计的
参照序列
通过
%d+FHG9
与
$d+FHG9
扩增!电泳均检测
到大小约
#"""K
E
左右的扩增产物!与预计大小相
符!测序后得到了长度分别为
#"*$K
E
"图
#
!
箭头
所指#和
#"4*K
E
"图
#
!
G
箭头所指#的火鹤
%&!"#$
基因
%d
端和
$d
端序列
将以上克隆到的
%
段序列通过
6MH3HM
拼
接后得到一个长度为
#4&4K
E
%&!"#$
基因全长
>6MH
序列"图
%
#将拼接片段在
MG\5
上进行
eFaa.0C.0
R
查找得到
#*4K
E
eFa
分别在起
始密码子和终止密码子附近设计全长引物!最后扩
增得到包括
#*4K
E
在内的
#4&4K
E
基因全长片
段!其中起始密码子位于
#4K
E
处!终止密码子位于
#***K
E
处!共编码
!!
个氨基酸"图
#
!
6
箭头所
指#!将 相 关 序 列 提 交
QI0\;0A
"登 录 号 为
T1&#*$&
#
1]?J
E
;];:
软件分析表明$
%&!"#$
基因编码
蛋白质分子量为
*"%(,*6
!等电点为
$,($
!为亲
水性蛋白
1]IC.>J1]?JI.0
软件预测表明$编码蛋白
的二级结构以环形结构最多!所占比例为
$4,$N
&
其次为
%
+
螺旋结构!占
!$,**N
&而
&
+
折叠占的比例
较少!仅为
#&,&(N
&具有由前
!&
个氨基酸组成的
信号肽!是具有
%
个跨膜螺旋的跨膜蛋白
50JI]1]?L>;0
等软件分析表明$
%&!"#$
具有
典型
!"#$
基因结构!包含
#
个信号肽"
/.
R
0;<
E
I
E
+
J.CI
!
L1
#(
#
个亮氨酸拉链结构域"
EE
I]
!
S51
#(
$
个富亮氨酸重复序列"
U]I
E
I;J
!
[FF
#结构
域(
#
个
L11
"
LI]+1]?+1]?
#基序的富脯氨酸结构域!
#
个跨膜结构域"
J];0/:I:K];0I]I
R
.?0
!
83
#(含
##
个亚区的激酶结构域"
A.0;/IC?:;.0/
#和
#
个
G
端结构域"图
&
#
6MH3HM
分析表明!
%&!"#$
基因编码的氨
图
!
!
实时荧光定量
1GF
反应
3,6[!"""
&
#,1GF
扩增产物!箭头所指为目标片段
a.
R
,!
!
FI;<+J.:I1GF
E
]?CY>J
3,6[!"""
&
#,1]?CY>J?Z1GF
&
8UI;]]?_
/U?_/JUIJ;]
R
IJZ];
R
:I0J
图
#
!
%&!"#$
基因扩增结果
H,
保守区片段&
\,%d+FHG9
&
G,$d+FHG9
&
6,>6MH
全长&
35,6[#$""
&
3,6[!"""
&箭头所指为目标片段
a.
R
,#
!
H:
E
<.Z.>;J.?0]I/YH,G?0/I]DIC]I
R
.?0Z];
R
:I0J/
&
\,%d+FHG9
&
G,$d+FHG9
&
6,aY<R
JU?Z>6MH
&
35,6[#$""
&
3,6[!"""
&
8UI;]]?_//U?_JUIJ;]
R
IJZ];
R
:I0J/
((
&
期
!!!!!!!!!
田
!
娜!等$火鹤
%&!"#$
基因克隆及其在体细胞胚胎发生中的表达分析
图
%
!
火鹤
%&!"#$>6MH
全长核苷酸序列及其推导氨基酸序列
标识长方形的碱基序列
H8Q
和
8QH
分别表示起始密码子和终止密码子
a.
R
,%
!
aY<+R
JU>6MH/I
=
YI0>I?Z%0&.+&/&*-!"#$
R
I0I;0CJUI
E
YJ;J.DI;:.0?;>.C
8UI0Y>=
YI0>IH8Q;0C8QH:;]AIC_.JU]I>J;0
R
?C?0;0CJI]:.0;J?]>?C?0
!
]I/
E
I>J.DI<
^
基酸序列与其它植物的一致性达到
$N
"
*4N

应用
39QH&
软件对火鹤
H;L9FT
与其它植物
L9FT
氨基酸序列进行系统进化分析!结果显示"图
$
#$二穗短柄草(高粱(玉米(小麦等禾本科植物的
!"#$
基因聚在一起!禾本科植物与菠萝"凤梨
科#(椰子"棕榈科#及火鹤"天南星科!单子叶植物#
聚为一类蔷薇科(芸香科(茄科等双子叶植物聚为
另一类这与普通分类的结果一致
;<;
!
火鹤
0123
基因的表达分析
火鹤
%&!"#$
基因在不同培养阶段材料中的
=
F8+1GF
检测结果表明"图

#$在加有
!
!
&+6
的诱
导培养阶段的第
#"
(
%"
天!几乎检测不到
%&!"#$
表达&此时叶片切块边缘诱导出愈伤组织!但这些愈
伤组织经镜检为非胚性愈伤组织*#!+!可见在火鹤非
胚性愈伤组织中!检测不到
%&!"#$
表达随着
诱导培养时间增加到第
$"
(
"
天!检测到
%&!"#$
少量表达&经镜检!此时愈伤组织已有不定芽原基的
分化*#!+!某些愈伤组织表面甚至长出了不定芽!可
见不定芽分化期
%B!"#$
会有少量表达在撤掉
!
!
&+6
的继代培养第
#"
天(第
!"
天!几乎检测不到
%&!"#$
表达在继代培养第
%"
天!老愈伤组织
切块边缘长出新鲜疏松愈伤组织!经镜检新鲜愈伤
组织中已分化出大量多细胞原胚*#!+!鉴定为胚性愈
伤组织&我们在此胚性愈伤组织中检测到
%&!"#$
基因的最高表达进入发育培养阶段!仅在末期"发
育培养第
&"
天(第
"
天#检测到
%&!"#$
基因的
微弱表达!此时胚状体已开始进行根芽的分化可
见!火鹤
%&!"#$
基因在旺盛分化多细胞原胚的
*(
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
胚性愈伤组织中大量表达!在器官分化阶段"不定芽 分化(胚状体根芽分化#仅少量表达
图
&
!
不同植物
L9FT
氨基酸序列比对
图中从上至下依次代表的是玉米(菠萝(火鹤(二穗短柄草(番木瓜(甜橙(温州蜜桔(椰子(龙眼(湖北海棠(
犬蔷薇(西红柿(秘鲁番茄(马铃薯(高粱(小麦中相应的
L9FT
氨基酸序列&序列上部标出的分别为信号肽(
亮氨酸拉链结构域(富亮氨酸重复序列结构域(
L11
基序的富脯氨酸结构域(跨膜结构域(激酶结构域
"其
##
个亚区用罗马数字标记#(
G
端结构域&两对半氨酸残基用三角符号标记
a.
R
,&
!
H<.
R
0:I0J?Z;:.0?;>.C/I
=
YI0>I/?Z!"#$Z]?:C.ZZI]I0J
E
<;0J/
8UI;:.0?;>.C/I
=
YI0>I/.0JUI:;
E
/_U.>UZ]?:JUIJ?
E
J?JUIK?JJ?:]I
E
]I/I0J./
$
I/&-&
C
B
!
%&&BA2-2B*B
!
%0&.+&/&*-
!
;+&A)
CF
2.,*-.,B(&A)
C
2
!
6&+,A&
F
&
F
&
C
&
!
6,(+*BB,/B,B
!
6,(+*B*B),*
!
62A2B*A,
J
/+&
!
9,-2A&+
F
*B
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&
!
<&D*B)*
F
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#2B&A&,&
!
2D&*-D
C
A2
F
/+B,A*-
!
2D&*-
F
/+*1,&*-
!
2D&*-(*K/+2B*-
!
2+
E
)*-K,A2D2+
!
8+,(,A*-&/B(,1*-
&
8UI/.
R
0;=
YI0>I
!
.0I@.
EE
I]C?:;.0
!
U]I
E
I;JC?:;.0/
"
[FF#+[FF$
#!
L11:?J.ZC?:;.0
!
J];0/:I:K];0IC?:;.0
!
A.0;/IC?:;.0
"
JUII#!
;0CG+JI]:.0;<
C?:;.0;]I.0C.>;JIC?0JUIJ?
E
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=
YI0>I/
&
8_?
E
;.]/?Z>
^
/JI.0I]I/.CYI/;]I:;]AIC_.JUJ].;0
R
4(
&
期
!!!!!!!!!
田
!
娜!等$火鹤
%&!"#$
基因克隆及其在体细胞胚胎发生中的表达分析
图
$
!
!"#$
基因编码的氨基酸序列系统进化树
图中分支点的数字表示
\??J/J];
E
验证中基于
#"""
次重复
该节点可信度的百分比&括号内的编号为氨基酸登录号
a.
R
,$
!
1U
^
R
I0IJ.>J]II?Z;:.0?;>.C
/I
=
YI0>II0>?CICK
^
!"#$
R
I0I
8UI0Y:KI]?0JUIK];0>UI/.0C.>;JIJUI]I<.;K.<.J
^
E
I]>I0J?Z\??J/J];
E
D;E
<.>;J.?0/
&
8UI;>>I//.?0M?,_;/
R
.DI0.0K];>AIJ/
图

!
火鹤体胚发生过程中
%&!"#$
基因的相对表达
5
(
L
(
6
分别代表诱导培养(继代培养(发育培养阶段&
5)#"
代表诱导培养第
#"
天
a.
R
,
!
FI<;J.DIIB
E
]I//.?0;:?Y0J?Z%&!"#$CY].0
R
/?:;J.>I:K]
^
?
R
I0I/./.0%0&.+&/&*-
5
!
L;0C6.0C.>;JICJUI.0CY>J.?0>Y!
JUI/YK>Y;0CJUICIDIE
:I0J;<>YR
I/]I/
E
I>J.DI<
^
&
5)#"
.0C.>;JICJUIJI0JUC;
^
.0JUI.0CY>J.?0>YR
I/
%
!
讨
!
论
!"#$
基因最早由
L>U:.CJ
从胡萝卜中克隆
出!他们发现
!
!
&+6
处理后!胡萝卜实生苗下胚轴中
能发育成体细胞胚的单个感受态细胞开始表达
!"#$
&感受态细胞分裂前膨大到
%$b4"
#
:
时!检
测到
!"#$
表达&当感受态细胞分化成
!
"
*
个细
胞原胚以及约
#""
个细胞的小球形胚时!
"#$
均
显著表达&当体细胞胚进入球形胚中后期及鱼雷形
胚!
"#$
表达消失*#+鸭茅中也发现$叶肉组织
上单个胚性细胞(
!
细胞原胚!球形胚均能检测到
!"#$
的表达&球形胚后的棒形胚!仅在茎分生组
织处有少量表达*+蜜桔
6,!"#$&
基因在简单增
殖的愈伤组织中检测不到!但在胚性愈伤组织内能
检测到*(+仙客来"
6
C
AD&-/
F
/+B,A*- 3.<,
#的
6
F
!"#$&
和
6
F
!"#$K
基因!均能在具有胚性发
生能力的组织中检测到!而未获得或丧失胚性能力
的组织中检测不到表达*+因此!
"#$
基因可能
是某些植物体细胞胚胎发生的早期标记基因
在本研究中!火鹤继代培养第
%"
天获得的新愈
伤组织为胚性愈伤组织!里面有大量发育不同步的
多细胞原胚*#!+!而此时我们检测到了
%&!"#$
的
最高表达!其相对表达量约是诱导培养第
("
天非胚
性愈伤组织中的
#"
倍马尾松
G-!"#$#
在诱导
培养的非胚性愈伤组织中不表达!而在经继代培养
的胚性愈伤组织中表达量很高且逐渐增加!且在培
养第
!"
天时达到最高*4+我们的研究结果与其非
常相似因此!初步确定克隆的火鹤
%&!"#$
基
因可作为火鹤体细胞胚胎发生的早期标记基因
最开始人们认为
!"#$
仅具有标记体细胞胚
胎发生的功能!后来发现
!"#$
基因也具有多功能
性$其表达与-细胞重新编程."
>IE
]?
R
];:+
:.0
R
#相关!其通常在-发育转换区域."
CIDIE
+
:I0J;#或-发育转换时期."
CIDI<+
?
E
:I0J;E
I].?C
#表达量上调*#%+#(+本研
究中!诱导培养第
$"
和
("
天!检测到了
%&!"#$
的轻微表达!可能是因为此时愈伤组织开始了芽原
基分化&发育培养阶段第
&"
和
"
天!
"#$
基因表
达有少量上调!可能是因为胚性愈伤组织开始向胚
芽和胚根发育上述分化或发育均是-细胞重新编
程.!出现了-发育转换区域.或-发育转换时期.!所
以能检测到
%&!"#$
的轻微表达
本研究在前期研究*#!+的基础上!首次从火鹤胚
性愈伤组织克隆到了
%&!"#$
基因!并检测到旺
盛分化的胚性愈伤组织中高表达!在其它时期不表
达或弱表达!初步认为克隆
%&!"#$
基因可作为
火鹤体细胞胚胎发生的标记基因这将为研究火鹤
体细胞胚胎发生的分子机理提供线索
!"#$
基因属于富亮氨酸重复序列受体类蛋
白激酶"
.0I+].>U]I
E
I;J/I
=
YI0>I]I>I
E
J?]+<.AI
A.0;/I
!
[FF+F[T
#家族中的第二亚类*#*+#4+受配
体诱导!
"#$
基因可能与膜上的其它
F[T/
形成
二聚体或多聚体!引起胞内激酶域磷酸化!激活了下
游的信号转导途径拟南芥中!
"#$
基因可能通
"*
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
过芸苔素"
K];//.0?/JI]?.C
!
\F
#信号转导途径!激发
了体细胞胚的发生*!"+!%+
%&!"#$
基因通过何种
信号转导途径介导火鹤体细胞胚胎发生!将是我们
下一步研究的方向
参考文献!
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