全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 43(2): 187-191(2013)
收稿日期: 2012-09-15; 修回日期: 2013-01-06
基金项目: 国家科技支撑计划项目 ( 2007BAD30B00 ); 国家 863 计划课题 ( 2013AA102604 ); 国际合作项目 ( 2009DFA30820,
2013DFA31600); 广 西 自 然 科 学 基 金 创 新 团 队 项 目 ( 2011GXNSFF018002 ); 广 西 自 然 科 学 基 金 重 点 项 目
(2012GXNSFDA053011);自治区主席科技资金项目(11166-02); 广西科学研究与技术开发计划项目(桂科产 1123008-1);
广西科技攻关项目(桂科攻 1222009); 广西农科院团队项目(桂农科 2011YT01)
通讯作者: 杨丽涛,博士、教授、博士生导师,主要从事甘蔗生理生化和分子生物学研究; Tel:0771-3236407, E-mail: liyr@gxu. edu. cn;
李杨瑞,博士、教授、博士生导师,主要从事甘蔗育种和栽培研究; Tel: 0771- 3247689, E-mail:liyr@gxaas. net。
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■研究简报
甘蔗宿根矮化病菌多克隆抗体的制备
谢晓娜1,2, 陈明辉1,2, 周 丹1,2, 杨丽涛1,2,3∗, 孙 富1,2, 李杨瑞2,3∗, 陈保善1,2
( 1 广西大学农学院, 南宁 530005; 2亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室, 南宁 530005;
3中国农业科学院甘蔗研究中心 /广西农业科学院甘蔗研究所 /农业部广西甘蔗生物技术
与遗传改良重点实验室 /广西甘蔗遗传改良重点实验室 /广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室, 南宁 530007)
Preparation of antiserum against the bacteria of sugarcane ratoon stunting disease
XIE Xiao-na1,2, CHEN Ming-hui1,2, ZHOU Dan1,2, YANG Li-tao1,2,3, SUN Fu1,2, LI Yang-rui2,3, CHEN
Bao-shan1,2 　 ( 1 Agricultural College, Guangxi University, Nanning 530005, China; 2 State Key Laboratory of Subtropical
Agriculture Bioresources Conservation and Utilization, Nanning 530005, China; 3 Sugarcane Research Institute, Chinese Acade-
my of Agricultural Sciences / Sugarcane Research Center, Guangxi Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Sugar-
cane Biotechnology and Genetic Improvement (Guangxi), Ministry of Agriculture, China / Guangxi Key Laboratory of Sugarcane
Genetic Improvement / Guangxi Crop Genetic Improvement and Biotechnology Lab, Nanning 530007, China)
Abstract: To produce the antiserum of ratoon stunting disease (RSD) of sugarcane, RSD bacteria were iso-
lated from the cane juice of infected sugarcane plants using the improved SC medium, and then identified ac-
cording to PCR detection results. ELISA was used for the titer determination, and Tissue Blot Immunoassay
(TBIA) detection was done to compare the detection capacity between homedade RSD antiserums and the im-
ported one from USA. The results showed that the isolated pathogen is similar to the reported Leifsonia xyli
subsp. xyli (Lxx) in morphology. A specific PCR product with the molecular size of 438 bp was also ampli-
fied from both bacteria. The ELISA titer of antiserum against Lxx was greater than 1∶ 256 000. The TBIA de-
tection results using homemade RSD antiserum were consistent with those detected by RSD antiserum from
USA.
Key words: sugarcane; ratoon stunting disease; RSD antiserum; TBIA
文章编号: 0412-0914(2013)02-0187-05
　 　 甘蔗宿根矮化病 ( Ratoon stunting disase,
RSD)是甘蔗生产中最为严重的细菌病害之一,常
导致感病品种新植蔗减产 10% ~ 15% ,宿根蔗减
产 20% ~ 25% ,在干旱的情况下感病品种的宿根
蔗产量损失可达 60% [1]。 RSD病原菌为 Leifsonia
xyli subsp. xyli(Lxx),寄生于甘蔗木质部导管内,
革兰氏阳性[2],体外分离培养非常困难。 该病害
自从 1944 年首次在澳大利亚昆士兰州的甘蔗品种
Q28 上发现以来,在世界各产区普遍发生,现已广
泛分布于各甘蔗种植区。 该菌主要通过带菌种茎
和砍收工具传播[3],已感病的蔗株又无明显的外
部症状,从而导致该病害无意识地传播,造成病害
　
植物病理学报 43 卷
蔓延,对甘蔗生产危害极大。 甘蔗宿根矮化病的检
测方法主要有形态学、血清学、分子生物学等方法,
血清学由于具有操作简便、准确性高、灵敏度好,同
时能够处理大量样品而在国外被广泛采用。 目前
国内所用的 RSD 血清全部依赖于国外进口,检测
成本高,使得血清学方法无法在国内普及。 为此我
们分离纯化了 RSD 的病原菌并制备了 RSD 的多
克隆抗体,为甘蔗宿根矮化病敏感、稳定和快捷的
检测提供了必要的保证。
1　 材料与方法
1. 1　 材料
疑似感病的甘蔗蔗茎采自广西大学农学院试
验基地。 RSD 阳性对照和 RSD 对照血清由美国
农业部农业研究署(USDA-ARS)提供。
1. 2　 方法
1. 2. 1　 抗原的制备与纯化 　 选取经 PCR 检测有
特异条带的蔗茎(PCR 检测所用引物和方法参照
Pan等[4]报道),表面用 70%的酒精消毒,用利刀
去皮,切成 7 ~ 8 cm长,放进已灭过菌的 50 mL 的
离心管,3 500 rpm 离心 10 min,吸取蔗汁至 1. 5
mL的离心管中,3 000 rpm 离心 5 min,取上清至
一新的离心管,12 000 rpm离心 15 min,弃上清,沉
淀用 1 × PBS缓冲液稀释,振荡混匀,制成悬浮液,
留待备用。
把制备好的悬浮液一部分用 1 × PBS 缓冲液
按 10 -1 ~ 10 -9进行梯度稀释;另一部分经 0. 45 μm
的过滤器后,再用 1 × PBS缓冲液按 10 -1 ~ 10 -9进
行梯度稀释。 然后再将各个梯度浓度的菌液点滴
到改良的 SC 培养基上,等菌液完全被吸收后,倒
置于 28℃的恒温培养箱中进行培养。 上述操作步
骤所用器具均需消毒、灭菌处理。
待 45 d 后,取已经长出的 Lxx 菌体在改良的
SC培养基上进行扩大培养,4 ~ 6 周后收集菌体,
OD600值为 0. 25 (细菌约为 108 cfu·mL -1 )。 用
0． 1%的甲醛进行灭活,经 PCR鉴定后做免疫抗原。
1. 2. 2　 抗血清的制备与纯化 　 以纯化的甘蔗宿
根矮化病病菌作为免疫原,与等量福氏完全佐剂
混合乳化,皮下多点注射免疫。 3 周后,抗原与等
量的福氏不完全佐剂乳化,腿部肌肉多点注射免
疫,之后每隔 3 ~ 4 周加强免疫 1 次,共加强 2 次,
并于加强免疫后 7 ~ 10 d 从兔耳抽血样,采用间
接 ELISA进行多抗血清效价测定。 最后 1 次免
疫后 8 d,杀兔收集血清, - 20℃保存备用。 用
PBS溶液(pH7． 4)将血清稀释 2 倍,边搅拌边逐
滴加入饱和硫酸铵溶液( pH7. 4),使其饱和度达
到 50% ,静置 2 h以上,12 000 rpm 离心 20 min,
将沉淀溶于 2 倍的 PBS;加入饱和硫酸铵溶液至
溶液饱和度达到 33% ,静置 2 h以上,12 000 rpm
离心 20 min,沉淀用少量 PBS 溶解,再在大于 20
倍体积的 PBS溶液中透析 24 h,中间更换透析液
3 次。 以上血清纯化过程均在 4℃进行。 收集透
析液, - 20℃保存备用。
1. 2. 3　 多克隆抗体的效价测定　 以蔗汁为包被抗
原,未加抗原的碳酸盐缓冲液为空白对照,免疫前
血清作为阴性对照,Lxx作为免疫原制备的多克隆
抗体为第一抗体,以辣根过氧化物酶(HRP)标记
的羊抗兔 IgG为酶标抗体。 多克隆抗体第一次稀
释 1 000 倍,以后采用 2 倍比稀释法。 在 96 孔酶
联板上检测兔抗 Lxx 多克隆抗体的效价,用 BIO-
RAD Model 550 型酶标仪测定 450 nm 波长下的
OD值。 计算 P / N =样品 OD 值 /对照 OD 值。 若
P / N≥2. 1,即为阳性。
1. 2. 4　 自制的与美国的 RSD 多克隆抗体 TBIA
检测的比较　 首先取甘蔗基部节间,用打孔器钻
取中心蔗茎,点压到硝酸纤维膜上,70℃烘干 30
min。 然后用封闭液(TBS 缓冲液 + 2% 脱脂奶
粉)封闭1 h,TBS缓冲液洗膜 1 min;接着 TBS缓
冲液 + 1%脱脂奶粉 +纯化后抗体(1∶ 2 000 TBS
稀释),室温反应 1 h,TBS 缓冲液洗膜 3 次,5
min /次;而后加入 TBS 缓冲液 + 1%脱脂奶粉 +
碱性磷酸酶(AP)标记的山羊抗兔的二抗(1 ∶ 5
000TBS缓冲液稀释),室温反应 1 h,接着用 TBS
缓冲液洗膜 3 次,15 min /次;将硝酸纤维膜置于
含有固蓝 BB盐的底物工作液中充分显色(置于
黑暗中),再将冲洗后的硝化纤维膜浸入 10%漂
白剂溶液中直至硝酸纤维膜变白(大约 5 min),
然后将其晾干、拍照、记录结果(暗蓝色维管束印
迹为阳性)。
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　 2 期 　 　 谢晓娜,等:甘蔗宿根矮化病菌多克隆抗体的制备
2　 结果
2. 1　 样品的 PCR检测结果
根据 PCR扩增产物有无 DNA 特异扩增条带
(438 bp),检测样品里是否含有 RSD 病原菌 Lxx,
PCR检测为阳性的,说明样本有 Lxx;PCR 检测为
阴性的,说明样本没有 Lxx(图 1);据此可选择感
染 RSD蔗茎的蔗汁来进行病原菌的培养。
2. 2　 菌落 PCR检测结果
根据 Pan 等[4]设计的 Lxx 的特异引物,以所
培养的 RSD病原菌为模板进行 PCR 扩增,其结果
如图 2。 从图 2 中可以看出,待测菌液均能扩增出
与阳性对照一致的目标片段,由此判定,本实验所
用抗原为甘蔗 RSD的病原菌 Lxx。
2. 3　 Lxx多克隆抗体的效价测定结果
将纯化后的 Lxx 菌液免疫兔子,获得特异性
较好的多克隆抗体。 用间接 ELISA 法在 96 孔酶
联板上检测兔多克隆抗体的效价,结果如表 1 所
示:将抗血清稀释至 256 000 倍时,仍有明显的阳
性反应,而阴性对照 OD 值无明显梯度,表明本研
究所制备的兔多克隆抗体的效价大于 1∶ 256 000。
2. 4　 自制 RSD 多克隆抗体与美国 RSD 多克隆
抗体 TBIA检测结果的比较
图 3-A、C为从美国引进的 RSD 的多克隆抗
体为一抗,图 3-B、D 为自制的 RSD 多克隆抗体作
作为一抗,二抗都是碱性磷酸酶(AP)标记的山羊
抗兔,经 TBIA检测结果从图 3 中可以看出,1 号、2
号、5 号、6 号、7 号、8 号、12 号以及 13 号甘蔗都有
暗蓝色维管束印迹,为阳性。 3 号、4 号、9 号、10 号
和 11 号甘蔗没有暗蓝色维管束印迹,为阴性。 并
且自制 RSD 多克隆抗体与从美国引进的 RSD 多
克隆抗体结果一致,只是在 RSD 多克隆抗体稀释
倍数一致的情况下,从美国引进的RSD多克隆抗
Fig. 1　 Electrophoresis pattern of PCR products of sugarcane samples
M: DNA marker; 1: Negative CK; 2: Positive CK; 3-9: Sugarcane samples.
Fig. 2　 Electrophoresis pattern of PCR products of bacteria
M: DNA marker; 1: Positive CK; 2: Negative CK; 3-9: To be identified bacteria.
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植物病理学报 43 卷
Table 1　 Titer determination of polyclonal antibody by ELISA
Sample
Diluted multiple / × 103
1 2 4 8 16 32 64 128 256 512
Immune serum 2. 091 1. 979 1. 794 1. 406 1. 202 0. 918 0. 466 0. 336 0. 209 0. 151
Normal serum 0. 109 0. 085 0. 073 0. 060 0. 075 0. 066 0. 065 0. 072 0. 071 0. 075
Blank 0. 091 0. 091 0. 091 0. 091 0. 091 0. 091 0. 091 0. 091 0. 091 0. 091
P / N 19. 183 23. 282 24. 575 23. 433 16. 027 13. 909 7. 169 4. 667 2. 943 2. 013
Note: The data are optical density values at 450 nm.
体暗蓝色维管束印迹比自制 RSD抗体暗蓝色维管
束印迹颜色深。 这说明自制 RSD抗体可以用来检
测田间甘蔗宿根矮化病的发生情况,并且检测结果
可靠,只是从美国引进的 RSD 多克隆抗体效价稍
大于自制的 RSD多克隆抗体。
3　 讨论
由于感病的蔗株并不表现明显的外部症状,所
以随着国内外蔗区间频繁的调种、引种,导致甘蔗
宿根矮化病病菌随蔗茎在蔗区迅速扩展蔓延, 因
此,有效控制该病害首先需要对种茎进行准确灵敏
的检测,确保种茎健康无菌,而 RSD多克隆抗体能
特异性地识别蔗茎内的 RSD 病菌,并与其特异性
地结合,从而提高了检测的正确性与灵敏度。
RSD病原菌体外分离培养很难成功,一方面
与自身缺失很多关键基因有关,如编码 L-半胱氨
酸、甲硫氨酸的基础性基因[5];另一方面 RSD病原
菌生长缓慢,从开始培养到能看到菌落,往往需要
3 ~ 4 周,这就使得控制污染成为整个分离培养的
关键。 由于 Lxx 生长十分缓慢,使得其竞争力特
别弱小,在分离培养的过程中只能一次性得到纯的
RSD菌落,一旦有杂菌的污染,再次分离 Lxx 已不
能再进行生长。
本试验以纯化后的甘蔗 RSD 病原菌 Leifsonia
xyli subsp. xyli 为抗原,通过多次免疫新西兰大白
兔,获得了 RSD抗体,用 ELISA 方法检测 RSD 多
克隆抗体的效价,确定其效价大于 1∶ 256 000;并用
TBIA的方法比较自制的 RSD多克隆抗体与从美
国引进的 RSD 多克隆抗体检测不同蔗茎感染
RSD的情况,结果二者的检测结果一致。 RSD 多
克隆抗体的成功制备解决了 RSD 多克隆抗体全
部依赖进口,检测成本高等问题,使免疫学检测
在甘蔗宿根矮化病检测中的运用得到实现,为甘
蔗宿根矮化病敏感、稳定和快捷的检测提供了必
要保证,并为逐渐解决 RSD多克隆抗体和酶联免
疫试剂盒的国产化问题,降低国内该病菌检测成
本,促进该类试剂盒在我国的运用提供了有力的
技术支撑。
Fig. 3　 The results of TBIA with antiserum from homemade and USA
A, C: The results of TBIA with antiserum from USA; B, D: The results of TBIA with homemade antiserum;
1-13: The results of TBIA of sugarcane.
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　 2 期 　 　 谢晓娜,等:甘蔗宿根矮化病菌多克隆抗体的制备
参考文献
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Sugar Cane, 1997, (4): 9 -14.
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责任编辑:曾晓葳
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