全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
!"#$+"+!%
&修改稿收到日期$
!"#$+")+!#
!!
基金项目$国家自然科学基金"
%#!"#$((
#!国家葡萄产业技术体系"
2345+%"
#!中国农业科学院科技创新工程专项经费"
2335+35678+
!"#$+9:47
#
!!
作者简介$冯
!
虎"
#(("*
#!男!在读硕士研究生!主要从事葡萄抗白腐病方向研究
;+<=/>
$
?@1
A
BC"#
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#!-,DE<
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通信作者$刘崇怀!博士!研究员!主要从事葡萄资源育种方向研究
;+<=/>
$
>/CDBE1
A
BC=/
!
D==0,1@F,D1
刺葡萄抗白腐病转录因子
1.2345$%
基因克隆及表达
冯
!
虎!张
!
颖!樊秀彩!姜建福!孙海生!刘崇怀"
"中国农业科学院郑州果树研究所!郑州
$"""(
#
摘
!
要$利用同源克隆的方法!分别获得(刺葡萄
"(%
)的转录因子
!"#$%&$%
基因的编码区和启动子区域!分析
其序列特征!通过实时荧光定量检测其对白腐病菌侵染和水杨酸诱导的反应!并以感病品种欧亚种(黑比诺)为对
照!分析不同种质中转录因子
!"#$%&$%
基因序列及表达差异结果表明$(刺葡萄
"(%
)的
!"#$%&$%
基因!
在其编码区和启动子区域都有抗病基因的序列和位点特征!在
GH3
和氨基酸水平上与(黑比诺)
!#$%&$%
有
$
处差异!这
$
处氨基酸差异可能造成了其功能的差异&(刺葡萄
"(%
)和(黑比诺)中的
#$%&$%
基因启动子受葡萄
白腐病菌和水杨酸诱导后表达量增加!且
!"#$%&$%
基因表达量和趋势不同于(黑比诺)
IJK4LM$%
生物信息
学分析和实时荧光定量表明!在(刺葡萄
"(%
)抗病途径中
INK4LM$%
转录因子具有重要的生物学作用
关键词$中国野生(刺葡萄
"(%
)&转录因子&
#$%&$%
&白腐菌&启动子分析
中图分类号$
O)&-
&
O)&(
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文献标志码$
3
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)
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6704.*34
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A
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X
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A
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Y
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A
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Y
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A
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X
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A
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Y
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C=1F/F=F/J@824
=?F@W/1EDC>=F/1
A
[B/F@WEF?C1
A
/=1N0
Y
W=
X
/1
A
0=>/D
X
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Y
W@00/E1E?#$%&$%D=1Z@/1ZEFB
(
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(
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)
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W=
Y
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A
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X
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X
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C=1F/F=F/J@824J@W/?/D=F/E1,6B@2G5=1N
Y
WEN
A
W=
Y
@
(
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A
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A
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Y
@=1NFB@1CD>@/D=1N=1/0EN/??@W@1F,6B@0@N/??@W@1D@0<=
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Y
>=
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Y
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A
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A
W=
Y
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X
Z/E/1?EW<=F/D=1=>
X
0/0=1NW@=>+F/<@?>CEW@0D@1D@
C=1F/F=F/J@824,
8/
9
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A
W=
Y
@!()(*"+("(("(%
&
FW=10DW/
Y
F/E1?=DFEW
&
!"#$%&$%
&
[B/F@WEF?C1
A
/
&
Y
WE+

X
0/0
!!
葡萄是中国栽培最广泛的果树之一!葡萄生产
上面临的病害主要有炭疽病*灰霉病*白粉病和白腐
病等!其中白腐病是由真菌
-./(.)0
1
2(34"(
5
6,
."(766+
引起的病害!是危害葡萄最严重的病害之
一中国是葡萄的重要起源地之一!是葡萄属植物
种类和遗传资源最为丰富的国家+#,!经过对中国野
生葡萄系统的研究!发现在这些野生种中蕴含大量
的抗性资源!刺葡萄"
!()(*"+("((:E@^
#中存在对
白腐病抗性极强的株系+!!%,
植物先天免疫系统由
!
个免疫反应组成!即病
原相关分子模式激发的免疫反应"
83_8+FW/
AA
@W@N
/<X
!
867
#和效应蛋白激发的免疫反应"
@??@D+
FEWFW/
AA
@W@N/<X
!
;67
#
867
途径中包含
_38L
"
A
@1+=DF/J=F@N
Y
WEF@/1]/1=0@0
#途径!
_38L
途径参与
K4LM
转录因子激活++-,!
;67
中
K4LM
蛋白可以和抗病蛋白"
4
蛋白#中的
H` 5+
U44
"
HCD>@EF/N@ /`1N/1
A
5/F@+U@CD/1@+4/DB 4@+
Y
@=F
#结合并参与到植物抗逆反应+),
867
和
;67
都属于系统获得性抗性"
0
X
0F@C/W@NW@0/0F+
=1D@
!
534
#!
534
是水杨酸"
53
#介导的植物对病
原菌的抗病反应!
K4LM
转录因子是
53
信号传递
过程中的重要转录因子
K4LM
转录因子广泛的
参与到植物防御反应中!其在非生物逆境中起重要
作用+&+#",!在生物逆境中
K4LM
蛋白广泛参与抵御
植物病原体的侵袭!例如细菌+##!#!,*真菌+#%+#$,和病
毒+#-!#),葡萄全基因组中属于
K4LM
家族有
&"
个成员+#&,葡萄中已有的关于
K4LM
基因研究表
明
K4LM
基因在抗逆途径中具有重要作用+#(+!#,
K4LM$%
是
K4LM
类转录因子重要的成员
之一!广泛的参与到植物的抗逆和衰老调控过程!是
衰老和病原响应的节点
3FK4LM$%
参与
53
信
号途径能够正调控拟南芥的抗细菌斑点病反应+!!,
过表达
5>K4LM$%
能增强番茄抵抗盐胁迫的能
力+!%,过表达
a0K4LM$%
能引起病程相关蛋白
的表达并能增强水稻抗稻瘟病的能力+!,
3F+
K4LM$%
参与拟南芥的衰老过程并可以被双氧水
诱导!能够负反馈调节自己的表达+!$,拟南芥中
3F_;LL#
可以与
3FK4LM$%
直接作用也可以结
合到
3FK4LM$%
启动子区域调节叶片衰老+-,分
析并验证水稻
a0K4LM$%
启动子发现其中
K+ZE^
起重要作用!说明其上游受其它
K4LM
转录因子
调控+!-,
3FK4LM#&
能与
3FK4LM$%
互作并在
拟南芥衰老调控网络中起作用+!),
本实验以抗葡萄白腐病的中国野生种(刺葡萄
"(%
)为主要试材!对照为感病欧亚种黑比诺!从序
列特 征*启 动 子 差 异*病 菌 和 水 杨 酸 诱 导 后
#$%&$%
基因表达差异和变化!探讨
#$%&$%
基
因在(刺葡萄
"(%
)抗病过程的调控机制
#
!
材料和方法
;,;
!
材
!
料
本实验材料为中国农业科学院郑州果树研究所
国家葡萄种质资源圃保存的(刺葡萄
"(%
)和(黑比
诺)针刺法接种白腐菌到(刺葡萄
"(%
)和(黑比
诺)成龄叶片!保温保湿!创造适合白腐菌发病的条
件+$,
53
喷施叶片浓度为
#<
A
%
U
+
!&
,
在
"
*
-
*
(
*
#!
*
!
和
&B
分别取白腐菌和
53
处理过的叶片!
迅速放到液氮中速冻!存放在
*&"b
冰箱中准备提
取总
4H3

;,<
!
方
!
法
;=<=;
!
>?6
!
@?6
提取和
3>?6
第一条链合成
!
GH3
提取采用
263`
法!总
4H3
提取采用
/`E
6@]@
植物
4H3
提取试剂盒提取用
6B@W@1F/?/DH=1ENWE
Y
#"""
微量紫外可见光分光光度计
测量浓度并进行琼脂糖电泳确定
4H3
完整性采
用
:@W<@1F=0
公司的
:/W0F5FW=1NDGH35
X
1FB@0/0
L/F
反转录得到
DGH3
第一条链
;,<,<
!
基因及启动子克隆
!
采用同源克隆法!根据
H2`7
中的
!#$%&$%
序列!使用
I@DFEWH67
中
的
Y
W/<@W?/1N
设计引物克隆
<4H3
序列!上游引
物 为
$c+36PP3P33236PPP33P66PPP+%c
!
下游引物为
$c+663333P3362223PP6PP6+
2P3+%c
根据
!#$%&$%
序列!采用
>`=0F
搜索
其上游
#$""Z
Y
左右序列!使用
I@DFEWH67
中
Y
W/<@W?/1N
设计引物!上游引物为
$
)
+236666P+
P26622663P236P6P+%
)!下游引物为
$
)
+P6+
62223326622236P662622+%
)
824
扩 增
使用
H;`
的
8BC0/E1
6_超保真酶扩增!反应体系为
Q:
缓冲液
#"
"
U
!
,$<
%
UNH680!,$
"
U
!模
板
!
"
U
!上下游引物"
#"<
%
U
#各
!,$
"
U
!
8BC+
0/E1
超保真酶
",$
"
U
!双蒸水补至
$"
"
U

824
反
应程序为
(&b
预变性
%&
(&b
变性
#"0
!
$&b
退火
#"0
!
)!b
延伸
%"0
!共
%#
个循环&最后
)!b
延伸
#"!
b
保存
824
产物经
!d
琼脂糖胶
电泳!使用
a<@
A
=P@>@^FW=DF
回收试剂盒回收扩增
产物!纯化后产物使用
6=L=4=
的
;R6=
6_聚合酶
加
3

824
产物平末端加
3
反应体系为
#"eZC??+
@W!
"
U
!
!,$<
%
U _
A
!f
!
"
U
!
!,$ <
%
U
NH680!
"
U
!模板
#
"
U
&反应程序$
)!b#"
参照
Y
P;_6+@=0
X
6_ 载体构建说明书构建
IN+
K4LM(+6
载体!转化
89:.6(GQ$
#
大肠杆菌进
行蓝白斑筛选!挑单克隆送生工生物工程"上海#股
份有限公司测序!测序引物为
6)
和
6)6@W
通用引物
;,<,%
!
基因序列和蛋白序列分析
!
测序结果使用
I@DFEWH67
拼接比对!得到
2G5
序列!并使用
&(#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
%$
卷
GH3<=1
软件分析
INK4LM$%
一级结构分析利
用瑞士生物信息学研究所"
5[/00710F/FCF@E? /`E/1+
?EW<=F/D0
!
57`
#提供的
8WEF8=W=<
软件+!(,"
BFF
Y
$%%
[@Z,@^
Y
=0
X
,EW
A
%
Y
WEF
Y
=W=<
%#在线分析氨基酸残基
数目和组成*蛋白质相对分子质量*分子式*理论等
电点及亲水性等理化性质二级结构分析预测采用
Y
B
X
W@!
+
%"
,
"
BFF
Y
$%%
[[[,0Z
A
,Z/E,/D,=D,C]
%
Y
B
X
W@
!
%
BF<>
%
Y
=
A
@D
A
/
-
/Ng/1N@^
#核定位信号分析预
测采用
HCD8W@N
"
BFF
Y
$%%
[[[,0ZD,0C,0@
%
$
<=D+
D=>W
%
1CD
Y
W@N
%
D
A
/+Z/1
%
0/1
A
>@,D
A
/
#
;,<,A
!
启动子分析
!
使用
8U32;
的
8>=1F-(*+
=DF/1
A
4@
A
C>=FEW
X
GH3 ;>@<@1F0
+
%#
!
%!
,
"
BFF
Y
$%%
[[[,N1=,=??WD,
A
E,
.Y
%
8U32;
%
0/
A
1=>0D=1,BF<>
#
预测作用元件!选取起始密码子前(刺葡萄
"(%
)的
#%Z
Y
!黑比诺的
#!%Z
Y
用来分析
;=<=$
!
1.2345$%
实时荧光定量
B&@
分析
!
实
时荧光定量的仪器为罗氏
&"
!试剂盒选择
/`EF=]@
的
5M` 44@=>+F/<@8248W@!正向引物
$c+
PP33P66PPP3323333P+%c
!反 向 引 物
$c+
26666PP32233PP3662+%c
&内 参 基 因 为
;:#
!内参基因正向引物
$c+P3326PPP6P266+
P363PP2+%c
!反向引物
$c+332233336362+
2PP3P63333P3+%c
反应体系为
5M` 44@=>+
F/<@8248W@"
!e
#
"
"
U
!上游和下游引物
各
!
"
U
!
DGH3
模板
!
"
U
!无菌水

"
U
每个样品
设置
%
次重复反应条件为
($b
预变性
$&
($
b
变性
!"0
!
-"b
退火
!"0
!
)!b
延伸
!"0
!共
$
个循环数据分析方法采用相对定量的方法!采用
!
*
##
26方法分析相对基因表达差异
!
!
结果与分析
<,;
!
基因序列和蛋白序列分析
!"#$%&$%
与
!#$%&$%
核酸序列比对分
析显示"图
#
#!可以看出有
(
处差异"细线框圈的为
图
#
!
(刺葡萄
"(%
)和(黑比诺)编码序列及氨基酸序列比对
:/
A
,#
!
2EN/1
A
0@
C@1D@=1N=C@1D@=>/
A
1<@1FE?
(
!9"+("(("(%
)
=1N
(
8/1EFHE/W
)
((#
&
期 冯
!
虎!等$刺葡萄抗白腐病转录因子
!"#$%&$%
基因克隆及表达
差异点#
INK4LM$%
与
IJK4LM$%
蛋白序列
比对分析结果"图
#
#可以看出!氨基酸序列存在
$
处差异在氨基酸序列中(刺葡萄
"(%
)中
-&
位为
组氨酸"
Q
#!(黑比诺)为谷氨酰胺"
O
#&(刺葡萄
"(%
)
%
位为丝氨酸"
5
#!(黑比诺)为甘氨酸"
P
#&
(刺葡萄
"(%
)
&
位为缬氨酸"
I
#!(黑比诺)为异亮
氨酸"
7
#&(刺葡萄
"(%
)
#(&
位为
Q
!(黑比诺)为
O
&
(刺葡萄
"(%
)
%""
位为
P
!(黑比诺)为精氨酸"
4
#
)%
位的
5
和
P
都是极性不带电氨基酸!
)&
位都是
非极性氨基酸!这
!
个位点不同对氨基酸的功能影
响不大(刺葡萄
"(%
)中
-&
和
#(&
位的
Q
为极性
带正电荷氨基酸!
%""
位
P
为极性不带电荷氨基酸&
(黑比诺)
-&
位的
P
和
#(&
位的
O
为极性不带电荷
氨基酸!
%""
位的
4
为极性带正电荷氨基酸
IN+
K4LM$%
和
IJK4LM$%
保守域和
GH3
结合域完
全 一致!氨基酸序列的差异位点不在
K4LM
蛋白
图
!
!
(刺葡萄
"(%
)
INK4LM$%
蛋白氨基酸组成分析
:/
A
,!
!
INK4LM$%=Y
E0/F/E1=>/
A
1<@1FE?
(
!9"+("(("(%
)
图
%
!
葡萄与其他植物
K4LM$%
蛋白序列比对
图中从上至下依次代表的是琴叶拟南芥*拟南芥*天蓝遏蓝菜*芜菁*麻风树*黑比诺和刺葡萄
"(%
:/
A
,%
!
6B@=>/
A
1<@1FE?
Y
WEF@/10@
C@1D@0K4LM$%?WE<
A
W=
Y
@=1NEFB@W
Y
>=1F0
6B@=C@1D@0/1FB@<=
Y
0[B/DB?WEY
FEFB@ZEFFEY
W@0@1F
$
;96
1
2+)+
!
;2+<(".
5
*(*)0+6(+/+
!
=.::+7+:+72367*:7/*
!
>2+**(:+2+
5
+
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5
0+:+2:+*
!
()(*(/(
@
72+
!
9"+("((
""$#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
%$
卷
的保守域!但是氨基酸极性的改变和所带电荷的改
变可能会改变蛋白结构
)%
位的
5
和
P
都是极性
不带电氨基酸!
)&
位都是非极性氨基酸!这
!
个位
点不同对氨基酸的功能影响不大(刺葡萄
"(%
)
中
-&
和
#(&
位的
Q
为极性带正电荷氨基酸!
%""
位
P
为极性不带电荷氨基酸&(黑比诺)
-&
位的
P
和
#(&
位的
O
为极性不带电荷氨基酸!
%""
位的
4
为极
性带正电荷氨基酸
INK4LM$%
和
IJK4LM$%
保
守域和
GH3
结合域完全一致!氨基酸序列的差异
位点不在
K4LM
蛋白的保守域!但是氨基酸极性
的改变和所带电荷的改变可能会改变蛋白结构
INK4LM$%
蛋白氨基酸组成成分如图
!
所
示通过
8WEF8=W=<
工具分析该蛋白分子量为
%(()&,!G=
!分子式为
2
#)%
Q
!-)&
H
(-
a
$-!
5
#-
!原子
总数为
$&-
个!理论等电点为
$,$#
!消光系数
!)#&"
"
!&"1<
#!不稳定系数
$-,-#
!即该蛋白不稳定!总
平均亲水性为
*",-(%
!为亲水性蛋白氨基酸组分
中!
5@W
和
P>
X
含量最高!
6W
Y
和
2
X
0
含量最低&酸
性氨基酸残基总数"
30
Y
fP>C
#为
"
个!碱性氨基
酸"
3W
A
fU
X
0
#为
%#
个
图
%
为葡萄与其他植物
K4LM$%
蛋白序列比
对结果!从图中可以看出这些
K4LM$%
的保守域
具有较高的同源性不同植物
K4LM$%
共有序列
图

!
K4LM$%
蛋白序列系统发育树
图中标尺代表遗传距离&从上至下依次代表的是琴叶拟南芥*
拟南芥*天蓝遏蓝菜*芜菁*麻风树*(黑比诺)和(刺葡萄
"(%
)&
分支上数值表示遗传距离
:/
A
,
!
8B
X
>E
A
@1@F/DFW@@E?K4LM$%
Y
WEF@/10@
C@1D@0
6B@0D=>@Z=WW@
Y
W@0@1F0
A
@1@F/DN/0F=1D@
&
6B@=0@
C@1D@0/1FB@<=
Y
0[B/DB?WEY
FEFB@ZEFFE<
W@
Y
W@0@1F
$
;96
1
2+)+
!
;9)0+6(+/+
!
=9:+72367*:7/*
!
>92+
5
+
!
?9:+2:+*
!
9(/(
@
72+
!
9"+("((
&
1C<@W/D=>J=>C@0
E1FB@ZW=1DBW@
Y
W@0@1F
A
@1@F/DN/0F=1D@
表
;
!
顺式作用元件统计
6=Z>@#
!
-(*=DF/1
A
@>@<@1F0F=F/0F/D0
顺式作用元件名称
-(*=DF/1
A
@>@<@1F
出现次数
:W@
C@1D
X
E?EDDCWW@1D@
INK4LM$% IJK4LM$%
功能
:C1DF/E1
3` 4;U36;4G# # # 3` 3
诱导
3` 3/1NCD@
32P636;4G# & &
叶片衰老!水胁迫
U@=?0@1@0D@1D@
!
[=F@W0FW@00
35:#_a67:23_I # #
水杨酸诱导
53/1NCD@
2336` aR# #% #
增强子
;1B=1D@W
264_23_I%$5 # &
增强子
;1B=1D@W
;` aR` HH383 - - 3` 3
诱导
3` 3/1NCD@
;;22423Q# % !
调控厌氧基因
4@
A
C>=F/E1E?=1=@WEZ/D
A
@1@
P363` aR ( &
环境诱导
;1J/WE1<@1F=>/1NCDF/E1
P6#2aH5;H5T5 ! !- 534
*
53
诱导
534
!
53/1NCD@
P6#P_523_ & (
病菌*盐诱导
8=FBE
A
@1/D0=>FW@
A
C>=F/E1
_346` aR # #
系统获得性抗性
534
_M` #36
脱水和
3` 3
诱导
G@B
X
NW=F/E1=1N3` 3/1NCD@
_M` !2aH5;H5T536 # #
脱水*
3` 3
诱导*低温胁迫
G@B
X
NW=F/E1
!
3` 3/1NCD@
!
DE>N0FW@00
_M` 2a4; # #
脱水*
3` 3
诱导
G@B
X
NW=F/E1
!
3` 3/1NCD@
_M` 2a4;362M2`# # #
胁迫应答
5FW@00W@0
Y
E10@
_M236;4G# # #
水胁迫
K=F@W0FW@00
_M2364G!! # # 3` 3
诱导!水胁迫
3` 3/1NCD@
!
[=F@W0FW@00
_M` 56# # "
病原菌诱发响应元件
8=FBE
A
@1/1NCD@NW@0
Y
E10@@>@<@1F
_M22aH5;H5T536 - -
抗寒抗病
2E>N+W@0/0F=1D@
!
N/0@=0@+W@0/0F=1F
84;2aH524Q58)"3 # "
热休克蛋白
Q@=F+0BED]
Y
WEF@/1
8M47_7G7H;` aRQI;8`# " # P3
*
3` 3
诱导
P3
!
3` 3/1NCD@
6
%
P` aR3687H! # #
茉莉酸*损伤诱导
S3=1N[EC1N/1NCD@
K`` aR82K4LM# ! !
抗病相关
G/0@=0@+W@0/0F=1F
K a`R36H84# % %
抗病相关
G/0@=0@+W@0/0F=1F
K a`RH6;4:% ) -
乙烯相关
;FB
X
>@1@+W@0/0F=1F
K4LM)#a5 & &
与
_M`
*
P3
*
84
相关
_M`
!
P3
!
84W@>=F@N
#"$#
&
期 冯
!
虎!等$刺葡萄抗白腐病转录因子
!"#$%&$%
基因克隆及表达
图
$
!
!"#$%&$%
和
!#$%&$%
基因启动子分析
IJK4LM$%
与
INK4LM$%
相同的部分用短横线表示!不同的部分用小写字母标注!线框标注的为二者差异较大的部分
:/
A
,$
!
31=>
X
0/0
Y
WE6B@0=<@
Y
=WF0/1N/D=F@NZ
X
N=0B
!
N/??@W@1F
Y
EWF/E10N@1EF@NZ
X
>E[@WD=0@>@FF@W0
!
=
YY
=W@1FN/??@W@1D@0<=W]@NZ
X
?W=<@
图
-
!
接种白腐菌和喷施
53
后(刺葡萄
"(%
)"
3
#和(黑比诺)"
`
#
#$%&$%
表达
:/
A
,-
!
#$%&$%@^
Y
W@00/E1
Y
=FF@W10E?
(
!9"+("(((%
)"
3
#
=1N
(
8/1EFHE/W
)"
`
#
C1N@W[B/F@+WEFN/0@=0@
/1EDC>=F/E1=1N?E>/=W+0
Y
W=
X
/1
A
53
在
INK4LM$%
二级结构预测中为
#
螺旋和
%
折
叠说明
K4LM$%
中含有非常保守的序列!结构
决定功能!这些保守域说明不同植物中
K4LM$%
转录因子具有相似功能从图

系统发育树中可以
看出亲源关系的远近!葡萄聚类到一起!相比拟南
芥!麻风树与葡萄的亲源关系更近
<,<
!
启动子分析
将启动子序列分别提交到
8U32;
网站进行分
析!得到分析结果与抗逆相关的顺式作用元件统计
如表
#
从统计结果可以看出!与逆境及转录增强
!"$#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
%$
卷
相关的顺式作用元件共有
!-
个!如与
3` 3
*
P3
*
53
和
S3
等激素调控相关的作用元件!而已有的研
究表明这些激素都参与到植物的抗逆反应之中
!
种葡萄中
#$%&$%
启动子区域顺式作用元件基本
一致!但是在(刺葡萄
"(%
)中特有
_M` 56#
和
84;2aH524Q58)"3
等
!
个顺式作用元件!而
(黑比诺)中特有
8M47_7G7H;` aRQI;8`#
顺式
作用元件
_M` 56#
为病原菌诱发响应元件(刺
葡萄
"(%
)中的
2336` aR#
增强子则比(黑比诺)
中少
#
个!但是
264_23_I%$5
增强子则比(黑
比诺)中多
-
个如图
$
中二者的启动子序列比对
有
!
处明显差异!一处是
IJK4LM$%
缺失!缺失部
分对应的
INK4LM$%
部分多了
!
个
264_+
23_I%$5
&另一处是二者序列差异较大!
IN+
K4LM$%
中不含顺式作用元件!而
IJK4LM$%
中
含有
8M47_7G7H;` aRQI;8`#
*
P6#P_523_
和两个
P6#2aH5;H5T5
这些预测的顺式作用
元件位点表明葡萄中的
K4LM$%
转录因子极有可
能参与到植物抗逆抗病反应两者之间的顺式作用
元件存在差异!从二者的统计情况 可 以 看 出
K4LM$%
启动子中的顺式作用元件表现出与抗逆
相关!这表明
K4LM$%
转录因子可能参与到葡萄
的抗逆途径中
<,%
!
实时荧光定量分析
从图
-
中可以看出(刺葡萄
"(%
)在接种白腐
菌
-B
后!
"#$%&$%
表达量达到最高值!其在喷
施
53
之后
-B
表达下调随后表达量上升!
B
达
到最高值(黑比诺)在接种白腐菌后
#$%&$%
表
达量先下降后上升!喷施
53
之后
-B
表达量达到
最高值随后下降(黑比诺)和(刺葡萄
"(%
)在接
种白腐菌和
53
之后
#$%&$%
表达趋势不一致
#$%&$%
在这
!
种葡萄中接种白腐菌之后表达量
都增加!说明
#$%&$%
对白腐菌侵染有响应!但是
!
种葡萄中响应时间及趋势不同
%
!
讨
!
论
INK4LM$%
和
IJK4LM$%
二者有
$
个氨基
酸的差异!这种差异对
K4LM$%
在这
!
种葡萄中
的功能到底有什么影响- (刺葡萄
"(%
)中
-&
和
#(&
位的
Q
为极性带正电荷氨基酸!
%""
位
P
为极
性不带电荷氨基酸&(黑比诺)中
-&
位的
P
和
#(&
位的
O
为极性不带电荷氨基酸!
%""
位的
4
为极性
带正电荷氨基酸
INK4LM$%
和
IJK4LM$%
保
守域和
GH3
结合域完全一致!氨基酸序列的差异
位点不在
K4LM
蛋白的保守域!但是氨基酸极性
的改变和所带电荷的改变可能会改变蛋白结构从
二维结构分析中可以看出
INK4LM$%
含有
%
个
#
螺旋!
$
个
%
转角
INK4LM$%
经过比对分析!含
有典型的
K4LM
域! 个半胱氨酸和两个组氨酸!
INK4LM$%
属于典型的
K4LM
基因第
77
家族成
员
INK4LM$%
预测的核定位信号
4L4L
得分
为
",&(
!定位到细胞核中通过对比不同植物中的
K4LM$%
并结合
INK4LM$%
的二级结构预测可
以看 出
K4LM$%
具 有 相 同 的 保 守 区 域!
IN+
K4LM$%
的功能和其它植物中的
K4LM$%
相似
通过分析
INK4LM$%
和
IJK4LM$%
启动子
区域的与抗逆相关的作用元件!存在差异顺式作
用元件!表明
#$%&$%
基因可能参与到植物的抗
逆反应转录增强子
264_23_I%$5
数量存在
差异!(刺葡萄
"(%
)中比(黑比诺)中的多
-
个!此
外(刺葡萄
"(%
)启动子序列中特异含有与抗逆相
关的
_M` 56#
和
84;2aH524Q58)"3
两个作用
元件!其中
_M` 56#
是病原菌诱发响应元件!
84;+
2aH524Q58)"3
与热休克蛋白相关(黑比诺)
中特异含有
8M47_7G7H;` aRQI;8`#
!其与
P3
和
3` 3
诱导相关这两种葡萄中都含有与
S3
相
关的
6
%
P` aR3687H!
顺式作用元件!拟南芥中已
有报道表明
3FK4LM$%
受
S3
的负调控+%%!%,拟
南芥中
3FK4LM$%
能负反馈调节自身表达+!$,!
!
种葡萄
K4LM$%
启动子序列中都含有
K+ZE^
顺式
作用元件
K`` aR82K4LM#
*
K a`R36H84#
和
K a`RH6;4:%
!葡萄中的
K4LM$%
可能受到自
身或其他
K4LM
转录因子的调控拟南芥中的研
究发现
3FK4LM$%
依赖
53
途径中的
H84#
调
控+%$!%-,!
35:#_a67:23_I
和
P6#2aH5;H5T5
顺式作用元件与
53
相关!
53
介导
534
反应!葡萄
中
K4LM$%
可能参与
534
途径
3` 4;U36;4G#
*
;` aR` HH383
*
_M`#36
*
_M`!2aH5;H5T536
*
_M` 2a4;
*
_M2364G!!
*
8M47_7G7H;` aRQ+
I;8`#
等顺式作用元件和
3` 3
调控相关!
867
和
;67
都属于
534
!
53
介导
534
途径参与
植物防御反应(刺葡萄
"(%
)和(黑比诺)叶片喷施
53
和接种白腐菌之后!
#$%&$%
在这
!
个葡萄中的
表达趋势不一致!二者的启动子序列比对有
!
处明
显差异!一处是
IJK4LM$%
缺失!缺失部分对应的
INK4LM$%
部 分 多 了
!
个
264_23_I%$5
!
INK4LM$%
接种白腐菌之后表达量比
IJK4LM$%
多可能与
264_23_I%$5
相关&另一处是二者序列
%"$#
&
期 冯
!
虎!等$刺葡萄抗白腐病转录因子
!"#$%&$%
基因克隆及表达
差异较大!
INK4LM$%
中不含顺式作用元件!而
IJK4LM$%
中含有
!
个
P6#2aH5;H5T5
!
P6#2+
aH5;H5T5
与
534
相关!
534
通过
53
介导!这可
能是
IJK4LM$%
喷 施
53
之 后 表 达 量 比
IN+
K4LM$%
高的原因
K4LM
基因家族庞大!多数对逆境响应!少数
K4LM
转录因子启动子区域可以被自身或其他
K4LM
转录因子调节水稻中
a0K4LM#%
可以
结合到
A*#$%&#%
启动子的顺式作用元件上+%),
K4LM$%
的调控特点!已有的关于
K4LM$%
的研
究表明!拟南芥
3FK4LM$%
在核中能与
_38
激酶
_8L
结合+%&,!
3F_;LL#
也可以与
3FK4LM$%
直接作用!也可以结合到
3FK4LM$%
启动子区域
调节叶片衰老+-,
3FK4LM$%
在拟南芥的衰老过
程能被双氧水诱导!可以够负反馈调节自己的表
达+!$,
3FK4LM-
*
3FK4LM$%
和
3FK4LM)"
相互作用参与拟南芥抗病途径+!!,
3FK4LM#&
能
与
3FK4LM$%
互作并在拟南芥衰老调控网络中起
作用+!),水稻中
a0K4LM$%
受其他
K4LM
转录
因子调控+!-,在小麦和玉米中
K4LM$%
上游调控
基因有
P56
!在氧胁迫逆境中
K4LM$%
调控下游
a4L#"
和
8a2#
的表达+%(,拟南芥中
;%
泛素连
接酶
T8U$
能抑制
K4LM$%
的表达进而调节衰老
过程+",在研究拟南芥抗丁香假单胞菌研究中发
现
3FK4LM$%
是
53
途径的下游基因!被
S3
和乙
烯负 调 控+%$,拟 南 芥 中
3G
蛋 白 能 正 调 节
K4LM$%
的表达!同时
3G
蛋白可以被过氧化氢诱
导被
S3
抑制+#,
INK4LM$%
启动子中存在与上述
功能相关的多种顺式作用元件!如与
534
*
S3
*
3` 3
*
水胁迫等相关的顺式作用元件这些顺式作用元件
可能在
INK4LM$%
的调控网络中起重要作用
通过同源克隆得到 (刺葡萄
"(%
)的
!",
#$%&$%2G5
序列和启动序列!经过生物信息学
分析基因的一级结构*二级结构以及启动子中的顺
式作用元件!并与(黑比诺)中的
!#$%&$%
作对
比得出其在抗逆途径具有重要功能!结合拟南芥和
其他物种中对
K4LM$%
的研究可以推导出葡萄中
K4LM$%
在抗逆调控中具有重要功能!实时荧光定
量验证得出!
"#$%&$%
参与葡萄中
53
介导的抗
白腐病途径终上所述得出$
!"#$%&$%
在葡萄
抗白腐病途径中具有重要的生物学作用
参考文献"
+
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"刘崇怀#!
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"孔庆山#
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"中外葡萄与葡萄酒#!
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