全 文 ：书西北植物学报!
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!"#$+"+!% &修改稿收到日期$
!"#$+")+!# !! 基金项目$国家自然科学基金"
%#!"#$(( #!国家葡萄产业技术体系" 2345+%" #!中国农业科学院科技创新工程专项经费" 2335+35678+ !"#$+9:47
#
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作者简介$冯 ! 虎" #(("* #!男!在读硕士研究生!主要从事葡萄抗白腐病方向研究 ;+<=/>$
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通信作者$刘崇怀!博士!研究员!主要从事葡萄资源育种方向研究 ;+<=/>$
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D==0,1@F,D1
刺葡萄抗白腐病转录因子
1.2345$% 基因克隆及表达 冯 ! 虎!张 ! 颖!樊秀彩!姜建福!孙海生!刘崇怀" "中国农业科学院郑州果树研究所!郑州$"""(
#
摘
!
要$利用同源克隆的方法!分别获得(刺葡萄 "(% )的转录因子 !"#$%&$% 基因的编码区和启动子区域!分析 其序列特征!通过实时荧光定量检测其对白腐病菌侵染和水杨酸诱导的反应!并以感病品种欧亚种(黑比诺)为对 照!分析不同种质中转录因子 !"#$%&$% 基因序列及表达差异结果表明$(刺葡萄
"(%
)的
!"#$%&$%
基因!
在其编码区和启动子区域都有抗病基因的序列和位点特征!在
GH3
和氨基酸水平上与(黑比诺)
!#$%&$%
有
$处差异!这$
处氨基酸差异可能造成了其功能的差异&(刺葡萄
"(%
)和(黑比诺)中的
#$%&$%
基因启动子受葡萄
白腐病菌和水杨酸诱导后表达量增加!且
!"#$%&$%
基因表达量和趋势不同于(黑比诺)
IJK4LM$% 生物信息 学分析和实时荧光定量表明!在(刺葡萄 "(% )抗病途径中 INK4LM$%
转录因子具有重要的生物学作用
关键词$中国野生(刺葡萄 "(% )&转录因子& #$%&$% &白腐菌&启动子分析 中图分类号$
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文献标志码$3 &"(#( ) *(!+, - ./00#"("12.*(03.# - 4#"(5*34".1.2345$%#(1-#-6.$7-.- :;HPQC ! 9Q3HPM/1 A ! :3HR/CD=/ ! S73HPS/=1?C ! 5THQ=/0B@1 A ! U7T2BE1 A BC=/ " " 9B@1 A VBEC:WC/F4@0@=WDB710F/FCF@ ! 2B/1@0@3D=N@< X E?3 A W/DC>FCW=>5D/@1D@0 ! 9B@1 A VBEC$"""(
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X
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葡萄是中国栽培最广泛的果树之一!葡萄生产
上面临的病害主要有炭疽病*灰霉病*白粉病和白腐
病等!其中白腐病是由真菌
-./(.)0
1
2(34"(
5
6,
."(766+
引起的病害!是危害葡萄最严重的病害之
一中国是葡萄的重要起源地之一!是葡萄属植物
种类和遗传资源最为丰富的国家+#,!经过对中国野
生葡萄系统的研究!发现在这些野生种中蕴含大量
的抗性资源!刺葡萄"
!()(*"+("((:E@^
#中存在对
白腐病抗性极强的株系+!!%,
植物先天免疫系统由
!
个免疫反应组成!即病
原相关分子模式激发的免疫反应"
83_8+FW/
AA
@W@N
/<X
!
867
#和效应蛋白激发的免疫反应"
@??@D+
FEWFW/
AA
@W@N/<X
!
;67
#
867
途径中包含
_38L
"
A
@1+=DF/J=F@N
Y
WEF@/1]/1=0@0
#途径!
_38L
途径参与
K4LM
转录因子激活++-,!
;67
中
K4LM
蛋白可以和抗病蛋白"
4
蛋白#中的
H` 5+
U44
"
HCD>@EF/N@ /`1N/1
A
5/F@+U@CD/1@+4/DB 4@+
Y
@=F
#结合并参与到植物抗逆反应+),
867
和
;67
都属于系统获得性抗性"
0
X
0F@C/W@NW@0/0F+
=1D@
!
534
#!
534
是水杨酸"
53
#介导的植物对病
原菌的抗病反应!
K4LM
转录因子是
53
信号传递
过程中的重要转录因子
K4LM
转录因子广泛的
参与到植物防御反应中!其在非生物逆境中起重要
作用+&+#",!在生物逆境中
K4LM
蛋白广泛参与抵御
植物病原体的侵袭!例如细菌+##!#!,*真菌+#%+#$,和病 毒+#-!#),葡萄全基因组中属于 K4LM 家族有 &" 个成员+#&,葡萄中已有的关于 K4LM 基因研究表 明 K4LM 基因在抗逆途径中具有重要作用+#(+!#, K4LM$%
是
K4LM
类转录因子重要的成员
之一!广泛的参与到植物的抗逆和衰老调控过程!是
衰老和病原响应的节点
3FK4LM$% 参与 53 信 号途径能够正调控拟南芥的抗细菌斑点病反应+!!, 过表达 5>K4LM$%
能增强番茄抵抗盐胁迫的能
力+!%,过表达
a0K4LM$% 能引起病程相关蛋白 的表达并能增强水稻抗稻瘟病的能力+!, 3F+ K4LM$%
参与拟南芥的衰老过程并可以被双氧水
诱导!能够负反馈调节自己的表达+!$,拟南芥中 3F_;LL# 可以与 3FK4LM$%
直接作用也可以结
合到
3FK4LM$% 启动子区域调节叶片衰老+-,分 析并验证水稻 a0K4LM$%
启动子发现其中
K+ZE^
起重要作用!说明其上游受其它
K4LM
转录因子
调控+!-,
3FK4LM#&
能与
3FK4LM$% 互作并在 拟南芥衰老调控网络中起作用+!), 本实验以抗葡萄白腐病的中国野生种(刺葡萄 "(% )为主要试材!对照为感病欧亚种黑比诺!从序 列特 征*启 动 子 差 异*病 菌 和 水 杨 酸 诱 导 后 #$%&$% 基因表达差异和变化!探讨 #$%&$% 基 因在(刺葡萄 "(% )抗病过程的调控机制 # ! 材料和方法 ;,; ! 材 ! 料 本实验材料为中国农业科学院郑州果树研究所 国家葡萄种质资源圃保存的(刺葡萄 "(% )和(黑比 诺)针刺法接种白腐菌到(刺葡萄 "(% )和(黑比 诺)成龄叶片!保温保湿!创造适合白腐菌发病的条 件+$,
53
喷施叶片浓度为
#<
A
%
U
+
!&
,
在
"
*
-
*
(
*
#!
*
!
和
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分别取白腐菌和
53
处理过的叶片!
迅速放到液氮中速冻!存放在
*&"b
冰箱中准备提
取总
4H3

;,<
!
方
!
法
;=<=;
!
>?6
!
@?6
提取和
3>?6
第一条链合成
!
GH3
提取采用
263`
法!总
4H3
提取采用
/`E
6@]@
植物
4H3
提取试剂盒提取用
6B@W@1F/?/DH=1ENWE
Y
#"""
微量紫外可见光分光光度计
测量浓度并进行琼脂糖电泳确定
4H3
完整性采
用
:@W<@1F=0
公司的
:/W0F5FW=1NDGH35
X
1FB@0/0
L/F
反转录得到
DGH3
第一条链
;,<,<
!
基因及启动子克隆
!
采用同源克隆法!根据
H2`7
中的
!#$%&$%
序列!使用
I@DFEWH67
中
的
Y
W/<@W?/1N
设计引物克隆
<4H3
序列!上游引
物 为
$c+36PP3P33236PPP33P66PPP+%c ! 下游引物为$c+663333P3362223PP6PP6+
2P3+%c
根据
!#$%&$%
序列!采用
>`=0F
搜索
其上游
#$""Z Y 左右序列!使用 I@DFEWH67 中 Y W/<@W?/1N 设计引物!上游引物为$
)
+236666P+
P26622663P236P6P+%
)!下游引物为
$) +P6+ 62223326622236P662622+% ) 824 扩 增 使用 H;` 的 8BC0/E1 6_超保真酶扩增!反应体系为 Q: 缓冲液 #" " U ! ,$<
%
UNH680!,$
"
U
!模
板
!
"
U
!上下游引物"
#"<
%
U
#各
!,$" U ! 8BC+ 0/E1 超保真酶 ",$
"
U
!双蒸水补至
$" " U 824 反 应程序为 (&b 预变性 %1<br& (&b 变性 #"0 !$&b
退火
#"0
!
)!b
延伸
%"0
!共
%#
个循环&最后
)!b
延伸
#"!
b
保存
824
产物经
!d
琼脂糖胶
电泳!使用
a<@
A
=P@>@^FW=DF
回收试剂盒回收扩增
产物!纯化后产物使用
6=L=4=
的
;R6=
6_聚合酶
加
3

824
产物平末端加
3
反应体系为
#"eZC??+
@W!
"
U
!
!,$<
%
U _
A
!f
!
"
U
!
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%
U
NH680!
"
U
!模板
#
"
U
&反应程序$)!b#"1<br 参照 Y P;_6+@=0 X 6_ 载体构建说明书构建 IN+ K4LM(+6 载体!转化 89:.6(GQ$
#
大肠杆菌进
行蓝白斑筛选!挑单克隆送生工生物工程"上海#股
份有限公司测序!测序引物为
6)
和
6)6@W
通用引物
;,<,%
!
基因序列和蛋白序列分析
!
测序结果使用
I@DFEWH67
拼接比对!得到
2G5
序列!并使用
&(#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
%$卷 GH3<=1 软件分析 INK4LM$%
一级结构分析利
用瑞士生物信息学研究所"
5[/00710F/FCF@E? /`E/1+
?EW<=F/D0
!
57`
#提供的
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软件+!(,"
BFF
Y
$%% [@Z,@^ Y =0 X ,EW A % Y WEF Y =W=< %#在线分析氨基酸残基 数目和组成*蛋白质相对分子质量*分子式*理论等 电点及亲水性等理化性质二级结构分析预测采用 Y B X W@! + %" , " BFF Y$%%
[[[,0Z
A
,Z/E,/D,=D,C]
%
Y
B
X
W@
!
%
BF<>
%
Y
=
A
@D
A
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-
/Ng/1N@^
#核定位信号分析预
测采用
HCD8W@N
"
BFF
Y
$%% [[[,0ZD,0C,0@ %$
<=D+
D=>W
%
1CD
Y
W@N
%
D
A
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%
0/1
A
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A
/
#
;,<,A
!
启动子分析
!
使用
8U32;
的
8>=1F-(*+
=DF/1
A
4@
A
C>=FEW
X
GH3 ;>@<@1F0
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%!
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"
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$%% [[[,N1=,=??WD, A E, .Y % 8U32; % 0/ A 1=>0D=1,BF<> # 预测作用元件!选取起始密码子前(刺葡萄 "(% )的 #%Z Y !黑比诺的 #!%Z Y 用来分析 ;=<=$
!
1.2345$% 实时荧光定量 B&@ 分析 ! 实 时荧光定量的仪器为罗氏 &" !试剂盒选择 /`EF=]@ 的 5M` 44@=>+F/<@8248W@^FCW@<br!正向引物$c+
PP33P66PPP3323333P+%c
!反 向 引 物
$c+ 26666PP32233PP3662+%c &内 参 基 因 为 ;:# !内参基因正向引物$c+P3326PPP6P266+
P363PP2+%c
!反向引物
$c+332233336362+ 2PP3P63333P3+%c 反应体系为 5M` 44@=>+ F/<@8248W@^FCW@<br" !e # " " U !上游和下游引物 各 ! " U ! DGH3 模板 ! " U !无菌水 " U 每个样品 设置 % 次重复反应条件为 ($b
预变性
$1<br& ($
b
变性
!"0
!
-"b
退火
!"0
!
)!b
延伸
!"0
!共
$个循环数据分析方法采用相对定量的方法!采用 ! * ## 26方法分析相对基因表达差异 ! ! 结果与分析 <,; ! 基因序列和蛋白序列分析 !"#$%&$% 与 !#$%&$% 核酸序列比对分 析显示"图 # #!可以看出有 ( 处差异"细线框圈的为 图 # ! (刺葡萄 "(% )和(黑比诺)编码序列及氨基酸序列比对 :/ A ,# ! 2EN/1 A 0@ C@1D@=1N=1E0@<brC@1D@=>/ A 1<@1FE? ( !9"+("(("(% ) =1N ( 8/1EFHE/W ) ((# & 期 冯 ! 虎!等$刺葡萄抗白腐病转录因子
!"#$%&$%
基因克隆及表达
差异点#
INK4LM$% 与 IJK4LM$%
蛋白序列
比对分析结果"图
#
#可以看出!氨基酸序列存在
$处差异在氨基酸序列中(刺葡萄 "(% )中 -& 位为 组氨酸" Q #!(黑比诺)为谷氨酰胺" O #&(刺葡萄 "(% ) % 位为丝氨酸" 5 #!(黑比诺)为甘氨酸" P #& (刺葡萄 "(% ) & 位为缬氨酸" I #!(黑比诺)为异亮 氨酸" 7 #&(刺葡萄 "(% ) #(& 位为 Q !(黑比诺)为 O & (刺葡萄 "(% ) %"" 位为 P !(黑比诺)为精氨酸" 4 # )% 位的 5 和 P 都是极性不带电氨基酸! )& 位都是 非极性氨基酸!这 ! 个位点不同对氨基酸的功能影 响不大(刺葡萄 "(% )中 -& 和 #(& 位的 Q 为极性 带正电荷氨基酸! %"" 位 P 为极性不带电荷氨基酸& (黑比诺) -& 位的 P 和 #(& 位的 O 为极性不带电荷 氨基酸! %"" 位的 4 为极性带正电荷氨基酸 IN+ K4LM$%
和
IJK4LM$% 保守域和 GH3 结合域完 全 一致!氨基酸序列的差异位点不在 K4LM 蛋白 图 ! ! (刺葡萄 "(% ) INK4LM$%
蛋白氨基酸组成分析
:/
A
,!
!
INK4LM$%=1E=D/NDE<<brY E0/F/E1=>/ A 1<@1FE? ( !9"+("(("(% ) 图 % ! 葡萄与其他植物 K4LM$%
蛋白序列比对
图中从上至下依次代表的是琴叶拟南芥*拟南芥*天蓝遏蓝菜*芜菁*麻风树*黑比诺和刺葡萄
"(%
:/
A
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!
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西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
%$卷 的保守域!但是氨基酸极性的改变和所带电荷的改 变可能会改变蛋白结构 )% 位的 5 和 P 都是极性 不带电氨基酸! )& 位都是非极性氨基酸!这 ! 个位 点不同对氨基酸的功能影响不大(刺葡萄 "(% ) 中 -& 和 #(& 位的 Q 为极性带正电荷氨基酸! %"" 位 P 为极性不带电荷氨基酸&(黑比诺) -& 位的 P 和 #(& 位的 O 为极性不带电荷氨基酸! %"" 位的 4 为极 性带正电荷氨基酸 INK4LM$%
和
IJK4LM$% 保 守域和 GH3 结合域完全一致!氨基酸序列的差异 位点不在 K4LM 蛋白的保守域!但是氨基酸极性 的改变和所带电荷的改变可能会改变蛋白结构 INK4LM$%
蛋白氨基酸组成成分如图
!
所
示通过
8WEF8=W=<
工具分析该蛋白分子量为
%(()&,!G=
!分子式为
2
#)%
Q
!-)&
H
(-
a
$-! 5 #- !原子 总数为$&-
个!理论等电点为
$,$#
!消光系数
!)#&"
"
!&"1<
#!不稳定系数
$-,-# !即该蛋白不稳定!总 平均亲水性为 *",-(% !为亲水性蛋白氨基酸组分 中! 5@W 和 P> X 含量最高! 6W Y 和 2 X 0 含量最低&酸 性氨基酸残基总数" 30 Y fP>C #为 " 个!碱性氨基 酸" 3W A fU X 0 #为 %# 个 图 % 为葡萄与其他植物 K4LM$%
蛋白序列比
对结果!从图中可以看出这些
K4LM$% 的保守域 具有较高的同源性不同植物 K4LM$%
共有序列
图

!
K4LM$% 蛋白序列系统发育树 图中标尺代表遗传距离&从上至下依次代表的是琴叶拟南芥* 拟南芥*天蓝遏蓝菜*芜菁*麻风树*(黑比诺)和(刺葡萄 "(% )& 分支上数值表示遗传距离 :/ A , ! 8B X >E A @1@F/DFW@@E?K4LM$%
Y
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C@1D@0
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增强子
;1B=1D@W
;` aR` HH383 - - 3` 3
诱导
3` 3/1NCD@
;;22423Q# % !
调控厌氧基因
4@
A
C>=F/E1E?=1=@WEZ/D
A
@1@
P363` aR ( &
环境诱导
;1J/WE1<@1F=>/1NCDF/E1
P6#2aH5;H5T5 ! !- 534
*
53
诱导
534
!
53/1NCD@
P6#P_523_ & (
病菌*盐诱导
8=FBE
A
@1/D0=>FW@
A
C>=F/E1
_346` aR # #
系统获得性抗性
534
_M` #36
脱水和
3` 3
诱导
G@B
X
NW=F/E1=1N3` 3/1NCD@
_M` !2aH5;H5T536 # #
脱水*
3` 3
诱导*低温胁迫
G@B
X
NW=F/E1
!
3` 3/1NCD@
!
DE>N0FW@00
_M` 2a4; # #
脱水*
3` 3
诱导
G@B
X
NW=F/E1
!
3` 3/1NCD@
_M` 2a4;362M2`# # #
胁迫应答
5FW@00W@0
Y
E10@
_M236;4G# # #
水胁迫
K=F@W0FW@00
_M2364G!! # # 3` 3
诱导!水胁迫
3` 3/1NCD@
!
[=F@W0FW@00
_M` 56# # "
病原菌诱发响应元件
8=FBE
A
@1/1NCD@NW@0
Y
E10@@>@<@1F
_M22aH5;H5T536 - -
抗寒抗病
2E>N+W@0/0F=1D@
!
N/0@=0@+W@0/0F=1F
84;2aH524Q58)"3 # "
热休克蛋白
Q@=F+0BED]
Y
WEF@/1
8M47_7G7H;` aRQI;8`# " # P3
*
3` 3
诱导
P3
!
3` 3/1NCD@
6
%
P` aR3687H! # #
茉莉酸*损伤诱导
S3=1N[EC1N/1NCD@
K`` aR82K4LM# ! !
抗病相关
G/0@=0@+W@0/0F=1F
K a`R36H84# % %
抗病相关
G/0@=0@+W@0/0F=1F
K a`RH6;4:% ) -
乙烯相关
;FB
X
>@1@+W@0/0F=1F
K4LM)#a5 & &
与
_M`
*
P3
*
84
相关
_M`
!
P3
!
84W@>=F@N
#"$# & 期 冯 ! 虎!等$刺葡萄抗白腐病转录因子
!"#$%&$%
基因克隆及表达
图
$! !"#$%&$% 和 !#$%&$% 基因启动子分析 IJK4LM$%
与
INK4LM$% 相同的部分用短横线表示!不同的部分用小写字母标注!线框标注的为二者差异较大的部分 :/ A ,$
!
31=>
X
0/0
Y
WE6B@0=<@
Y
=WF0/1N/D=F@NZ
X
N=0B
!
N/??@W@1F
Y
EWF/E10N@1EF@NZ
X
>E[@WD=0@>@FF@W0
!
=
YY
=W@1FN/??@W@1D@0<=W]@NZ
X
?W=<@
图
-
!
接种白腐菌和喷施
53
后(刺葡萄
"(%
)"
3
#和(黑比诺)"
`
#
#$%&$%
表达
:/
A
,-
!
#$%&$%@^
Y
W@00/E1
Y
=FF@W10E?
(
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3
#
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(
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)"
`
#
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/1EDC>=F/E1=1N?E>/=W+0
Y
W=
X
/1
A
53
在
INK4LM$% 二级结构预测中为 # 螺旋和 % 折 叠说明 K4LM$%
中含有非常保守的序列!结构
决定功能!这些保守域说明不同植物中
K4LM$% 转录因子具有相似功能从图 系统发育树中可以 看出亲源关系的远近!葡萄聚类到一起!相比拟南 芥!麻风树与葡萄的亲源关系更近 <,< ! 启动子分析 将启动子序列分别提交到 8U32; 网站进行分 析!得到分析结果与抗逆相关的顺式作用元件统计 如表 # 从统计结果可以看出!与逆境及转录增强 !"$#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
%$卷 相关的顺式作用元件共有 !- 个!如与 3` 3 * P3 * 53 和 S3 等激素调控相关的作用元件!而已有的研 究表明这些激素都参与到植物的抗逆反应之中 ! 种葡萄中 #$%&$% 启动子区域顺式作用元件基本 一致!但是在(刺葡萄 "(% )中特有 _M` 56# 和 84;2aH524Q58)"3 等 ! 个顺式作用元件!而 (黑比诺)中特有 8M47_7G7H;` aRQI;8`# 顺式 作用元件 _M` 56# 为病原菌诱发响应元件(刺 葡萄 "(% )中的 2336` aR# 增强子则比(黑比诺) 中少 # 个!但是 264_23_I%$5
增强子则比(黑
比诺)中多
-
个如图
$中二者的启动子序列比对 有 ! 处明显差异!一处是 IJK4LM$%
缺失!缺失部
分对应的
INK4LM$% 部分多了 ! 个 264_+ 23_I%$5
&另一处是二者序列差异较大!
IN+
K4LM$% 中不含顺式作用元件!而 IJK4LM$%
中
含有
8M47_7G7H;` aRQI;8`#
*
P6#P_523_
和两个
P6#2aH5;H5T5
这些预测的顺式作用
元件位点表明葡萄中的
K4LM$% 转录因子极有可 能参与到植物抗逆抗病反应两者之间的顺式作用 元件存在差异!从二者的统计情况 可 以 看 出 K4LM$%
启动子中的顺式作用元件表现出与抗逆
相关!这表明
K4LM$% 转录因子可能参与到葡萄 的抗逆途径中 <,% ! 实时荧光定量分析 从图 - 中可以看出(刺葡萄 "(% )在接种白腐 菌 -B 后! "#$%&$% 表达量达到最高值!其在喷 施 53 之后 -B 表达下调随后表达量上升! B 达 到最高值(黑比诺)在接种白腐菌后 #$%&$% 表 达量先下降后上升!喷施 53 之后 -B 表达量达到 最高值随后下降(黑比诺)和(刺葡萄 "(% )在接 种白腐菌和 53 之后 #$%&$% 表达趋势不一致 #$%&$% 在这 ! 种葡萄中接种白腐菌之后表达量 都增加!说明 #$%&$% 对白腐菌侵染有响应!但是 ! 种葡萄中响应时间及趋势不同 % ! 讨 ! 论 INK4LM$%
和
IJK4LM$% 二者有$
个氨基
酸的差异!这种差异对
K4LM$% 在这 ! 种葡萄中 的功能到底有什么影响- (刺葡萄 "(% )中 -& 和 #(& 位的 Q 为极性带正电荷氨基酸! %"" 位 P 为极 性不带电荷氨基酸&(黑比诺)中 -& 位的 P 和 #(& 位的 O 为极性不带电荷氨基酸! %"" 位的 4 为极性 带正电荷氨基酸 INK4LM$%
和
IJK4LM$% 保 守域和 GH3 结合域完全一致!氨基酸序列的差异 位点不在 K4LM 蛋白的保守域!但是氨基酸极性 的改变和所带电荷的改变可能会改变蛋白结构从 二维结构分析中可以看出 INK4LM$%
含有
%
个
#
螺旋!
$个 % 转角 INK4LM$%
经过比对分析!含
有典型的
K4LM
域! 个半胱氨酸和两个组氨酸!
INK4LM$% 属于典型的 K4LM 基因第 77 家族成 员 INK4LM$%
预测的核定位信号
4L4L
得分
为
",&(
!定位到细胞核中通过对比不同植物中的
K4LM$% 并结合 INK4LM$%
的二级结构预测可
以看 出
K4LM$% 具 有 相 同 的 保 守 区 域! IN+ K4LM$%
的功能和其它植物中的
K4LM$% 相似 通过分析 INK4LM$%
和
IJK4LM$% 启动子 区域的与抗逆相关的作用元件!存在差异顺式作 用元件!表明 #$%&$% 基因可能参与到植物的抗 逆反应转录增强子 264_23_I%$5
数量存在
差异!(刺葡萄
"(%
)中比(黑比诺)中的多
-
个!此
外(刺葡萄
"(%
)启动子序列中特异含有与抗逆相
关的
_M` 56#
和
84;2aH524Q58)"3
两个作用
元件!其中
_M` 56#
是病原菌诱发响应元件!
84;+
2aH524Q58)"3
与热休克蛋白相关(黑比诺)
中特异含有
8M47_7G7H;` aRQI;8`#
!其与
P3
和
3` 3
诱导相关这两种葡萄中都含有与
S3
相
关的
6
%
P` aR3687H!
顺式作用元件!拟南芥中已
有报道表明
3FK4LM$% 受 S3 的负调控+%%!%,拟 南芥中 3FK4LM$%
能负反馈调节自身表达+!$,! ! 种葡萄 K4LM$%
启动子序列中都含有
K+ZE^
顺式
作用元件
K`` aR82K4LM#
*
K a`R36H84#
和
K a`RH6;4:%
!葡萄中的
K4LM$% 可能受到自 身或其他 K4LM 转录因子的调控拟南芥中的研 究发现 3FK4LM$%
依赖
53
途径中的
H84#
调
控+%$!%-,! 35:#_a67:23_I 和 P6#2aH5;H5T5 顺式作用元件与 53 相关! 53 介导 534 反应!葡萄 中 K4LM$%
可能参与
534
途径
3` 4;U36;4G#
*
;` aR` HH383
*
_M`#36
*
_M`!2aH5;H5T536
*
_M` 2a4;
*
_M2364G!!
*
8M47_7G7H;` aRQ+
I;8`#
等顺式作用元件和
3` 3
调控相关!
867
和
;67
都属于
534
!
53
介导
534
途径参与
植物防御反应(刺葡萄
"(%
)和(黑比诺)叶片喷施
53
和接种白腐菌之后!
#$%&$%
在这
!
个葡萄中的
表达趋势不一致!二者的启动子序列比对有
!
处明
显差异!一处是
IJK4LM$% 缺失!缺失部分对应的 INK4LM$%
部 分 多 了
!
个
264_23_I%$5 ! INK4LM$%
接种白腐菌之后表达量比
IJK4LM$% 多可能与 264_23_I%$5
相关&另一处是二者序列
%"$# & 期 冯 ! 虎!等$刺葡萄抗白腐病转录因子
!"#$%&$%
基因克隆及表达
差异较大!
INK4LM$% 中不含顺式作用元件!而 IJK4LM$%
中含有
!
个
P6#2aH5;H5T5
!
P6#2+
aH5;H5T5
与
534
相关!
534
通过
53
介导!这可
能是
IJK4LM$% 喷 施 53 之 后 表 达 量 比 IN+ K4LM$%
高的原因
K4LM
基因家族庞大!多数对逆境响应!少数
K4LM
转录因子启动子区域可以被自身或其他
K4LM
转录因子调节水稻中
a0K4LM#%
可以
结合到
A*#$%&#% 启动子的顺式作用元件上+%), K4LM$%
的调控特点!已有的关于
K4LM$% 的研 究表明!拟南芥 3FK4LM$%
在核中能与
_38
激酶
_8L
结合+%&,!
3F_;LL#
也可以与
3FK4LM$% 直接作用!也可以结合到 3FK4LM$%
启动子区域
调节叶片衰老+-,
3FK4LM$% 在拟南芥的衰老过 程能被双氧水诱导!可以够负反馈调节自己的表 达+!$,
3FK4LM-
*
3FK4LM$% 和 3FK4LM)" 相互作用参与拟南芥抗病途径+!!, 3FK4LM#& 能 与 3FK4LM$%
互作并在拟南芥衰老调控网络中起
作用+!),水稻中
a0K4LM$% 受其他 K4LM 转录 因子调控+!-,在小麦和玉米中 K4LM$%
上游调控
基因有
P56
!在氧胁迫逆境中
K4LM$% 调控下游 a4L#" 和 8a2# 的表达+%(,拟南芥中 ;% 泛素连 接酶 T8U$
能抑制
K4LM$% 的表达进而调节衰老 过程+",在研究拟南芥抗丁香假单胞菌研究中发 现 3FK4LM$%
是
53
途径的下游基因!被
S3
和乙
烯负 调 控+%$,拟 南 芥 中 3G 蛋 白 能 正 调 节 K4LM$%
的表达!同时
3G
蛋白可以被过氧化氢诱
导被
S3
抑制+#,
INK4LM$% 启动子中存在与上述 功能相关的多种顺式作用元件!如与 534 * S3 * 3` 3 * 水胁迫等相关的顺式作用元件这些顺式作用元件 可能在 INK4LM$%
的调控网络中起重要作用
通过同源克隆得到 (刺葡萄
"(%
)的
!",
#$%&$%2G5
序列和启动序列!经过生物信息学
分析基因的一级结构*二级结构以及启动子中的顺
式作用元件!并与(黑比诺)中的
!#$%&$%
作对
比得出其在抗逆途径具有重要功能!结合拟南芥和
其他物种中对
K4LM$% 的研究可以推导出葡萄中 K4LM$%
在抗逆调控中具有重要功能!实时荧光定
量验证得出!
"#$%&$%
参与葡萄中
53
介导的抗
白腐病途径终上所述得出$!"#$%&$% 在葡萄 抗白腐病途径中具有重要的生物学作用 参考文献" + # , ! U7T2QQ "刘崇怀#! LaHPO5Q "孔庆山# ,8W@0@WJ=F/E1DE1N/F/E1E?2B/1=[/>N A W= Y @W@0ECWD@0=1N=NJ/D@ + S , ,B(/.,A72*7+*C2+ 5 7(/7 D#(/7 "中外葡萄与葡萄酒#! ""& !" # #$
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