全 文 ：书犇犗犐：１０．１１６８６／犮狔狓犫２０１５１８２ 犺狋狋狆：／／犮狔狓犫．犾狕狌．犲犱狌．犮狀
段慧荣，王锁民．盐地碱蓬高亲和性Ｋ＋转运蛋白基因犛狊犎犃犓２的克隆与表达模式分析．草业学报，２０１６，２５（２）：１１４１２３．
ＤＵＡＮＨｕｉＲｏｎｇ，ＷＡＮＧＳｕｏＭｉｎ．ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆａｈｉｇｈａｆｆｉｎｉｔｙＫ＋ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｇｅｎｅ犛狊犎犃犓２ｉｎ犛狌犪犲犱犪狊犪犾狊犪．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌ
ｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１６，２５（２）：１１４１２３．
盐地碱蓬高亲和性犓＋转运蛋白基因
犛狊犎犃犓２的克隆与表达模式分析
段慧荣，王锁民
（兰州大学草地农业科技学院，草地农业生态系统国家重点实验室，甘肃 兰州７３００２０）
摘要：盐地碱蓬在高盐生境中可以有效吸收Ｋ＋，并维持细胞内Ｋ＋浓度的相对稳定。高亲和性Ｋ＋转运蛋白ＫＴ／
ＨＡＫ／ＫＵＰ家族成员在植物Ｋ＋吸收过程中发挥重要作用。本研究从盐地碱蓬中克隆到一个ＫＴ／ＨＡＫ／ＫＵＰ家
族成员犎犃犓２的同源基因犛狊犎犃犓２，并对其进行生物信息学分析和表达模式分析。ＳｓＨＡＫ２编码７８８个氨基酸，
与不同植物的 ＨＡＫ２类蛋白具有较高的同源性（８０％～９２％）。系统进化分析表明，ＳｓＨＡＫ２属于 ＫＴ／ＨＡＫ／
ＫＵＰ家族亚族Ⅱ成员，与拟南芥ＡｔＫＵＰ２位于同一进化分枝。实时定量ｑＰＣＲ分析显示，犛狊犎犃犓２在盐地碱蓬的
根和叶中均有高丰度表达，且叶中的表达丰度显著高于根中。犛狊犎犃犓２的表达受外界不同浓度 Ｋ＋（２．５和０．０１
ｍｍｏｌ／Ｌ）的诱导。２．５ｍｍｏｌ／ＬＫ＋ 处理下，根和叶中犛狊犎犃犓２的表达受２５ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ的显著诱导；０．０１
ｍｍｏｌ／ＬＫ＋处理下，２５和１５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ的添加抑制根中犛狊犎犃犓２的表达，却显著促进其在叶中的表达。以
上研究结果表明，ＳｓＨＡＫ２可能参与盐地碱蓬Ｋ＋吸收及转运过程，在根和叶中发挥不同的功能。
关键词：盐地碱蓬；犛狊犎犃犓２；克隆；表达分析
犆犾狅狀犻狀犵犪狀犱犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犪犺犻犵犺犪犳犳犻狀犻狋狔犓＋狋狉犪狀狊狆狅狉狋犲狉犵犲狀犲犛狊犎犃犓２犻狀
犛狌犪犲犱犪狊犪犾狊犪
ＤＵＡＮＨｕｉＲｏｎｇ，ＷＡＮＧＳｕｏＭｉｎ
犛狋犪狋犲犓犲狔犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔狅犳犌狉犪狊狊犾犪狀犱犃犵狉狅犲犮狅狊狔狊狋犲犿狊，犆狅犾犾犲犵犲狅犳犘犪狊狋狅狉犪犾犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犲犛犮犻犲狀犮犲犪狀犱犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔，犔犪狀狕犺狅狌犝狀犻狏犲狉狊犻
狋狔，犔犪狀狕犺狅狌７３００２０，犆犺犻狀犪
犃犫狊狋狉犪犮狋：犛狌犪犲犱犪狊犪犾狊犪，ａｔｙｐｉｃａｌｓａｌｔａｃｃｕｍｕｌａｔｉｎｇｈａｌｏｐｈｙｔｅ，ｉｓｃａｐａｂｌｅｏｆａｂｓｏｒｂｉｎｇＫ＋ ｗｉｔｈｈｉｇｈｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ，
ａｎｄｔｈｕｓｍａｉｎｔａｉｎｓａｒｅｌａｔｉｖｅｌｙｓｔａｂｌｅＫ＋ｌｅｖｅｌｉｎｃｅｌｓ，ａｎｄｇｒｏｗｓｗｅｌ，ｅｖｅｎｉｎｈｉｇｈｌｙｓａｌｉｎｅｓｏｉｌ．Ｍｅｍｂｅｒｓｏｆ
ｔｈｅＫＴ／ＨＡＫ／ＫＵＰｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｈａｖｅａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎＫ＋ ｕｐｔａｋｅｉｎｐｌａｎｔｓ．Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ｗｅｃｌｏｎｅｄ
犛狊犎犃犓２ｉｎ犛．狊犪犾狊犪ａｎｄａｎａｌｙｚｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｓｏｆ犛狊犎犃犓２ｗｈｅｎｔｈｅｐｌａｎｔｓｗｅｒｅｅｘｐｏｓｅｄｔｏｄｉｆｆｅｒ
ｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＫＣｌａｎｄＮａＣｌ．Ｒｅｓｕｌｔｓｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔ犛狊犎犃犓２ｃｏｄｅｄｆｏｒ７８８ａｍｉｎｏａｃｉｄｒｅｓｉｄｕｅｓａｎｄ
ｓｈａｒｅｄａｈｉｇｈｈｏｍｏｌｏｇｙ（８０％－９２％）ｗｉｔｈｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｍｅｍｂｅｒｓｏｆＫＴ／ＨＡＫ／ＫＵＰｆａｍｉｌｙｆｒｏｍｏｔｈｅｒ
ｐｌａｎｔｓ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ犛狊犎犃犓２ｂｅｌｏｎｇｅｄｔｏａｓｕｂｇｒｏｕｐｏｆｔｈｅｆａｍｉｌｙｋｎｏｗｎａｓｇｒｏｕｐＩＩ，
ａｎｄｆｏｒｍｅｄａｃｌａｄｅｗｉｔｈＡｔＫＵＰ２ｏｆ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｃｌｏｓｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ．犛狊犎犃犓２ｗａｓｈｉｇｈｌｙ
ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｒｏｏｔｓａｎｄｌｅａｖｅｓ，ａｎｄｗａｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｗｉｄｅｌｙｄｉｆｆｅｒｉｎｇＫ＋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ（２．５ａｎｄ０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ）．
Ｕｎｄｅｒ２．５ｍｍｏｌ／ＬＫ＋ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ犛狊犎犃犓２ｉｎｒｏｏｔｓａｎｄｌｅａｖｅｓｗａｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙ２５ｍｍｏｌ／Ｌ
１１４－１２３
２０１６年２月
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
第２５卷 第２期
Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．２
收稿日期：２０１５０４０８；改回日期：２０１５０５２０
基金项目：教育部博士点基金优先发展领域项目（２０１３０２１１１３０００１）和国家自然科学基金项目（３１０７２０７３）资助。
作者简介：段慧荣（１９８７），女，山西长治人，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｄｕａｎｈｕｉｒｏｎｇ５１４＠１６３．ｃｏｍ
通信作者Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ．Ｅｍａｉｌ：ｓｍｗａｎｇ＠ｌｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
Ｎａ＋ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｉｎｔｈｅｍｅｄｉｕｍｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ０．０１ｍｍｏｌ／ＬＫ＋，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ犛狊犎犃犓２ｉｎｒｏｏｔｓ
ｗａｓｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄｂｙＮａ＋（２５ａｎｄ１５０ｍｍｏｌ／Ｌ）ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ｂｕｔｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄｉｎｌｅａｖｅｓ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｔｈｅｒｅｆｏｒｅ
ｉｎｄｉｃａｔｅｔｈａｔ犛狊犎犃犓２ｍｉｇｈｔｍｅｄｉａｔｅＫ＋ｕｐｔａｋｅａｎｄｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎ犛．狊犪犾狊犪，ａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｅｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｙｉｎｒｏｏｔｓ
ａｎｄｌｅａｖｅｓ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犛狌犪犲犱犪狊犪犾狊犪；犛狊犎犃犓２；ｃｌｏｎｅ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ
Ｋ＋是植物中含量最为丰富的阳离子，也是植物生长发育所必需的营养元素，占植物总干重的２％～１０％［１］。
作为重要的无机渗透调节剂和酶促剂，Ｋ＋在细胞渗透调节、膨压维持、细胞伸长、气孔运动、氮代谢、脂肪代谢、蛋
白质合成及细胞膜的极化等过程中均发挥着重要作用［２］。土壤盐碱化是引起植物体内Ｋ＋亏缺现象的主要非生
物因素之一，土壤中高浓度的Ｎａ＋会限制植物体内Ｋ＋的吸收和转运，使植物生长受抑，甚至死亡［３］。盐生植物
在长期进化过程中形成了多种有效机制来抵御盐胁迫［４６］，例如维持细胞内Ｋ＋浓度的稳定。
盐地碱蓬（犛狌犪犲犱犪狊犪犾狊犪）又名蓬子菜、盐蒿，是藜科碱蓬属一年生多汁草本盐生植物，生于盐渍化土壤、湖
滨、河岸和沿海地带［７］。盐地碱蓬的幼嫩茎叶营养丰富，是很好的绿色蔬菜，也可用作动物饲料，其种子中富含不
饱和脂肪酸和亚油酸等，可压榨食用油，具有很好的经济价值；盐地碱蓬在盐碱地的改良、污染地的植被修复和有
毒金属的吸附方面效果显著，具有很好的生态价值［８］。盐地碱蓬可在４００ｍｍｏｌ／Ｌ的盐浓度下完成其生活史，是
典型的盐碱地指示植物，它通过将根部吸收的大量Ｎａ＋运输至地上部并区域化进液泡以减轻Ｎａ＋毒害，也是极
具代表性的积盐型植物［９］。Ｍｏｒｉ等［１０］的研究发现，盐地碱蓬Ｋ＋、Ｎａ＋选择性吸收能力（ＳＡｋ）随外界ＮａＣｌ浓度
（５～５０ｍｍｏｌ／Ｌ）的增加显著提高，且植株体内Ｋ＋吸收速率和Ｋ＋浓度能维持相对稳定。可见，有效吸收Ｋ＋并
维持体内Ｋ＋浓度的相对稳定可能是盐地碱蓬适应高盐生境的重要策略之一。
大量研究表明，ＫＴ／ＨＡＫ／ＫＵＰ转运蛋白、ＨＫＴ转运蛋白和ＳｈａｋｅｒＫ＋通道主要参与植物根系Ｋ＋吸收过
程［１１］。Ｓｈａｏ等［１２］研究发现，盐地碱蓬ＨＫＴ转运蛋白家族成员ＳｓＨＫＴ１；１参与根系Ｋ＋吸收过程，在盐胁迫下
维持植株体内Ｋ＋营养稳态，从而提高植物耐盐性。此外，Ｄｕａｎ等［１３］克隆并鉴定了盐地碱蓬ＳｈａｋｅｒＫ＋通道成
员ＳｓＡＫＴ１，推测其可能参与盐地碱蓬根中的Ｋ＋吸收过程，并在耐盐性中发挥重要作用。可见，盐地碱蓬体内
存在多基因网络调控的Ｋ＋吸收途径，然而，ＫＴ／ＨＡＫ／ＫＵＰ家族成员的相关研究尚未见报道。
植物ＫＴ／ＨＡＫ／ＫＵＰ家族蛋白具有高亲和转运Ｋ＋的特性，与细菌中的Ｋ＋吸收透性酶ＫＵＰ及真菌中的高
亲和性 Ｋ＋ 转运蛋白 ＨＡＫｓ的同源性极高，最早从大麦 （犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲）中克隆到了该家族成员
ＨｖＨＡＫ１［１４］。在植物中，ＫＴ／ＨＡＫ／ＫＵＰ家族成员能够恢复酵母或细菌Ｋ＋吸收缺陷突变体的Ｋ＋吸收，在植
物根和地上部Ｋ＋稳态平衡中发挥重要作用［１５］。此外，亦有研究表明，ＫＴ／ＨＡＫ／ＫＵＰ家族部分成员可以介导
Ｎａ＋从土壤进入植物根部［１６１７］。Ｗａｎｇ等［１６］的研究发现，拟南芥根中仅存在ＡｔＨＫＴ１；１和ＡｔＨＡＫ５两条主要
的低亲和性Ｎａ＋吸收途径，且当ＡｔＨＫＴ１；１功能丧失后，ＡｔＨＡＫ５成为唯一主要的低亲和性Ｎａ＋吸收途径，并
且在低Ｋ＋条件下，其作用更为重要。Ｚｈａｎｇ等［１７］对海滨碱蓬（犛狌犪犲犱犪犿犪狉犻狋犻犿犪）的研究发现，ＫＴ／ＨＡＫ／ＫＵＰ
家族可能参与９５～２００ｍｍｏｌ／ＬＮａ＋条件下的植株根系低亲和性Ｎａ＋吸收过程。可见，ＫＴ／ＨＡＫ／ＫＵＰ家族成
员在植物Ｋ＋、Ｎａ＋吸收及转运过程中可能发挥重要作用。
本研究以盐地碱蓬为材料，克隆ＫＴ／ＨＡＫ／ＫＵＰ家族成员基因犛狊犎犃犓２的ｃＤＮＡ全长并对其进行生物信
息学分析，采用实时定量ｑＰＣＲ的方法分析犛狊犎犃犓２在不同浓度Ｋ＋（０．０１和２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）和ＮａＣｌ（２５和１５０
ｍｍｏｌ／Ｌ）处理下的表达模式，以期为进一步研究ＳｓＨＡＫ２的功能提供分子基础。
１ 材料与方法
１．１ 材料培养
２０１３年３月，挑选籽粒饱满无缺损的盐地碱蓬种子，用蒸馏水冲洗２～３遍，在直径９ｃｍ的培养皿上铺滤纸
润湿后播种于其上，种子密度约为４粒／ｃｍ２，２８℃下催芽，待发芽后，挑选均匀一致的幼苗移至装有灭菌红沙的
塑料穴盘（５ｃｍ×５ｃｍ×５ｃｍ）中，４株／穴，在温室中浇灌调整后的Ｈｏａｇｌａｎｄ营养液进行植物材料培养。调整后
的 Ｈｏａｇｌａｎｄ营养液（ｐＨ＝５．７）包括２ｍｍｏｌ／ＬＫＮＯ３，０．５ｍｍｏｌ／ＬＫＨ２ＰＯ４，０．５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ，
５１１第２５卷第２期 草业学报２０１６年
０．２５ｍｍｏｌ／ＬＣａ（ＮＯ３）２·４Ｈ２Ｏ，１．２５ｍｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２·２Ｈ２Ｏ，０．０６ｍｍｏｌ／ＬＦｅｃｉｔｒａｔｅ，５０μｍｏｌ／ＬＨ３ＢＯ３，１０
μｍｏｌ／ＬＭｎＣｌ２·４Ｈ２Ｏ，１．６μｍｏｌ／ＬＺｎＳＯ４·７Ｈ２Ｏ，０．６μｍｏｌ／ＬＣｕＳＯ４·５Ｈ２Ｏ，０．０５μｍｏｌ／ＬＮａ２ＭｏＯ４·
２Ｈ２Ｏ。温室的昼夜温度为（２８±２）℃／（２３±２）℃，光照１６ｈ／ｄ，光强度约６００μｍｏｌ／（ｍ
２·ｓ），相对湿度６０％～
８０％。
１．２ 犛狊犎犃犓２的全长克隆
３周龄盐地碱蓬幼苗用０．０１ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ处理６
ｈ后取样，参照Ｔｒｉｚｏｌ试剂盒说明书（上海生工）从根
中提取总ＲＮＡ，按照ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ１ｓｔｓｔｒａｎｄｃＤＮＡ
ＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ反转录试剂盒说明书（大连宝生物）合成
ｃＤＮＡ第１链。通过对已知植物的 ＨＡＫ２类核苷酸
序列进行同源性比较，找出高度保守区域，根据同源性
高和简并性低的原则，利用ＤＮＡＭＡＮ和Ｐｒｉｍｅｒ６．０
软件设计１对简并引物Ｐ１ 和Ｐ２（表１），用于扩增盐地
碱蓬 犎犃犓２基因核心片段，推测目的片段的长度为
４７４ｂｐ。根据已测得的核心片段序列设计５′端特异引
物Ｐ３（外侧引物）、Ｐ４（巢式引物）（表１）及３′端特异引
物Ｐ５（外侧引物）、Ｐ６（巢式引物）（表１），分别与Ｇｅｎ
ｅＲａｃｅｒＴＭ试剂盒（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）提供的５′Ｐｒｉｍｅｒ
表１ 引物序列
犜犪犫犾犲１ 犜犺犲狊犲狇狌犲狀犮犲狊狅犳狆狉犻犿犲狉狊
引物名称Ｐｒｉｍｅｒｎａｍｅ 引物序列 （５′３′）Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ（５′３′）
Ｐ１ ＧＧＡＡＣＷＴＣＹＡＴＧＧＴＣＡＴＹＧＧＴＧＡＴＧＧ
Ｐ２ ＧＣＹＡＣＹＡＣＡＡＡＴＧＴＴＧＧＣＣＡＧＴＡ
Ｐ３ ＧＡＧＡＡＧＴＧＴＣＣＴＡＡＡＴＣＡＧＣＡＡＡＣ
Ｐ４ ＧＣＣＡＧＡＡＡＣＡＧＣＡＧＴＧＡＡＡＡＣＡＧＡＡＡＴ
Ｐ５ ＧＡＴＧＡＣＣＣＡＣＧＡＧＡＡＴＣＡＣＣＡＡＴＡＴＧＣＴ
Ｐ６ ＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＧＴＧＴＴＣＴＧＣＴＧＴＧＣ
Ｐ７ ＡＣＣＡＧＴＡＧＴＴＴＴＧＡＴＣＴＧＧＣＴＣＣＴ
Ｐ８ ＣＡＣＣＴＣＣＣＡＡＡＧＡＣＡＴＣＣＡＴＣ
Ａ１ ＣＡＧＧＡＡＴＣＡＧＡＧＡＣＴＧＣＣＡＡＧＡ
Ａ２ ＡＡＧＡＡＣＣＴＣＴＧＧＡＣＡＡＣＧＧＡＡＣ
（５′Ｐ）、５′ＮｅｓｔｅｄＰｒｉｍｅｒ（５′ＮＰ）及３′Ｐｒｉｍｅｒ（３′Ｐ）、３′ＮｅｓｔｅｄＰｒｉｍｅｒ（３′ＮＰ）配对，用于外侧和巢式ＰＣＲ扩
增，推测５′ｃＤＮＡ和３′ｃＤＮＡ碱基序列的长度约为８０１ｂｐ和１２５０ｂｐ左右。引物由上海生工生物工程有限公司
合成。ＰＣＲ扩增反应体系：在２００μＬＰＣＲ管中依次加入１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ５μＬ、２５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２３．５μＬ、１０
ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ１μＬ、１０μｍｏｌ／ＬＰ１１μＬ、１０μｍｏｌ／ＬＰ２１μＬ、ＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μＬ）０．５μＬ、ｃＤＮＡ２
μＬ，加纯水至５０μＬ。核心片段ＰＣＲ反应条件：９４℃预变性２ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ、５６℃退火５０ｓ、７２℃延伸５０ｓ，
３０个循环；最后７２℃延伸１０ｍｉｎ；５′ＲＡＣＥ的ＰＣＲ反应条件：９４℃预变性２ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ、５８℃退火５０ｓ、
７２℃延伸８０ｓ，３０个循环；最后７２℃延伸１０ｍｉｎ；３′ＲＡＣＥ的ＰＣＲ反应条件：９４℃预变性２ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ、
５８℃退火５０ｓ、７２℃延伸１３０ｓ，３０个循环；最后７２℃延伸１０ｍｉｎ；ＰＣＲ扩增产物用１．２％的琼脂糖凝胶检测，目
的片段的回收和纯化按照ＵＮＩＱ１０柱式ＤＮＡ胶回收试剂盒（上海生工）操作说明进行。回收的ＰＣＲ产物连接
到ＴｒａｎｓＴＭ Ｔ５载体，转化ＴｒａｎｓＴＭ１Ｔ１感受态细胞，送至上海生工测序。将这些片段拼接得到了犛狊犎犃犓２的
全长ｃＤＮＡ。
１．３ 生物信息学分析
在ＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）网站上，将测序得到的犛狊犎犃犓２基因序列和氨基酸序列与
ＧｅｎＢａｎｋ数据库中序列进行Ｂｌａｓｔｎ和Ｂｌａｓｔｐ分析；序列的翻译、开放阅读框分析在ＤＮＡＭＡＮ６．０生物软件上
进行，氨基酸序列与其他序列的同源比较用Ｂｉｏｅｄｉｔ软件进行，氨基酸的跨膜区预测用在线生物学软件ＴＭＨＭＭ
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ／）进行。系统进化树用 ＭＥＧＡ６．０软件的最大似然法（Ｍａｘｉ
ｍｕｍｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄｍｅｔｈｏｄ）进行构建。
１．４ 犛狊犎犃犓２的表达模式分析
采用实时定量ｑＰＣＲ方法分析盐地碱蓬犛狊犎犃犓２的表达模式。材料处理方案如下：（１）正常Ｋ＋加盐处理：
待盐地碱蓬幼苗生长至３０ｄ，向Ｈｏａｇｌａｎｄ营养液中加２５或１５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ处理０，６，２４ｈ。（２）低Ｋ＋（０．０１
ｍｍｏｌ／Ｌ）加盐处理：待盐地碱蓬幼苗生长至２３ｄ时，转入低Ｋ＋（０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ）（２ｍｍｏｌ／ＬＫＮＯ３ 用２ｍｍｏｌ／Ｌ
ＨＮＯ３ 代替，０．５ｍｍｏｌ／ＬＫＨ２ＰＯ４ 用０．５ｍｍｏｌ／ＬＨ３ＰＯ４ 代替，加入０．０１ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ，用１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ调整
营养液ｐＨ值为５．７）营养液中处理７ｄ，随后向低Ｋ＋ Ｈｏａｇｌａｎｄ营养液中加入２５或１５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ处理０，
６１１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．２
６，２４ｈ。处理液每天更换。处理结束后，分别收集根和叶，经无菌水冲洗后，置于消毒滤纸上迅速吸干表面水分，
于液氮中快速冷冻用于ＲＮＡ的提取。不同处理下盐地碱蓬根和叶总ＲＮＡ的提取参照Ｔｒｉｚｏｌ试剂盒说明书（上
海生工）进行，按照ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ ＲＴＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＰｅｒｆｅｃｔＲｅａｌＴｉｍｅ）试剂盒操作说明（大连宝生物）合成ｃＤ
ＮＡ第１链。荧光定量ｑＰＣＲ反应在ＡＢＩ７５００荧光定量ＰＣＲ仪（ＡＢＩ，Ａｍｅｒｉｃａ）中进行，用于表达分析的特异
性引物由大连宝生物工程有限公司设计，分别为Ｐ７ 和Ｐ８（表１），待扩增目的片段长度为１５５ｂｐ，以犛狊犃犆犜犐犖
（ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＥＵ４２９４５７）为内参基因，引物为Ａ１ 和Ａ２（表１），待扩增目的片段长度为１１１ｂｐ。ＰＣＲ反应
条件如下：９５℃３０ｓ，４０个循环（９５℃５ｓ，６０℃３４ｓ）。采用２－△△ｃｔ法［１８］计算犛狊犎犃犓２的相对表达量，以无处理
的根样作为对照。每个处理设３个重复，每个样品重复３次。
１．５ 数据分析
采用ＳＰＳＳ１７．０对数据进行分析，运用Ｄｕｎｃａｎ多重比较进行差异显著性分析，最小差异显著性水平为犘＜
０．０５。用Ｅｘｃｅｌ２０１０、ＭＥＧＡ６．０等软件作图。
２ 结果与分析
图１ 盐地碱蓬犛狊犎犃犓２基因犚犜－犘犆犚产物电泳检测图
犉犻犵．１ 犃犵犪狉狅狊犲犵犲犾犲犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犚犜－犘犆犚
狆狉狅犱狌犮狋狊狅犳犛狊犎犃犓２犻狀犛．狊犪犾狊犪
ａ：核心片段ＲＴ－ＰＣＲ产物；ｂ：５′ＲＡＣＥＲＴ－ＰＣＲ产物；ｃ：３′ＲＡＣＥ
ＲＴ－ＰＣＲ产物；Ｍ１：ＤＬ２０００ＤＮＡ标记；Ｍ２：ＤＬ１００００ＤＮＡ标记。ａ：
ｔｈｅＲＴ－ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｏｆｔｈｅｐａｒｔｉａｌｆｒａｇｍｅｎｔ；ｂ：ｔｈｅＲＴ－ＰＣＲｐｒｏｄ
ｕｃｔｏｆｔｈｅ５′ＲＡＣＥ；ｃ：ｔｈｅＲＴ－ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｏｆｔｈｅ３′ＲＡＣＥ；Ｍ１：ＤＬ
２０００ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；Ｍ２：ＤＬ１００００ＤＮＡｍａｒｋｅｒ．
２．１ 盐地碱蓬犛狊犎犃犓２全长ｃＤＮＡ的克隆及生物
信息学分析
以总ＲＮＡ反转录所得到的第１链ｃＤＮＡ 为模
板，利用简并性引物Ｐ１ 和Ｐ２ 进行 ＲＴ－ＰＣＲ扩增。
扩增产物经凝胶电泳检测发现约在４７４ｂｐ处有１条
亮带，且上下无杂带（图１ａ），测序结果经ＢＬＡＳＴ检测
表明该ｃＤＮＡ片段与其他高等植物的 ＨＡＫ２序列具
有较高的同源性（７８％～８８％），其中与空心莲子草
（犃犾狋犲狉狀犪狀狋犺犲狉犪狆犺犻犾狅狓犲狉狅犻犱犲狊）犃狆犓犝犘２基因（Ｇｅｎ
Ｂａｎｋ登录号：ＪＮ６３５５１５）核苷酸序列的同源性高达
８８％，可见该片段是盐地碱蓬犎犃犓２类基因片段。根
据此核心片段进一步设计了特异引物进行５′端和３′
端的ＲＴ－ＰＣＲ扩增，分别得到８０１ｂｐ的５′ＲＡＣＥ产
物和１２５０ｂｐ的３′ＲＡＣＥ产物（图１ｂ和ｃ），将５′端、核
心片段和３′端的序列进行拼接，得到全长２８９０ｂｐ的ｃＤＮＡ（图２）。该ｃＤＮＡ包含一个２２８ｂｐ的５′非翻译区（５′
ＵＴＲ）、２３６７ｂｐ的开放阅读框（ＯＲＦ）以及２９６ｂｐ的３′非翻译区（３′ＵＴＲ），有１２个高度保守的跨膜区 （图３），编
码７８８个氨基酸，推测其分子量为１０７．３ｋＤａ。本研究将其命名为犛狊犎犃犓２。
多重比较分析结果表明，盐地碱蓬ＳｓＨＡＫ２与其他植物的 ＨＡＫ２类转运蛋白具有很高的同源性（图４），其
中与甜菜（犅犲狋犪狏狌犾犵犪狉犻狊）、空心莲子草、冰叶日中花（犕犲狊犲犿犫狉狔犪狀狋犺犲犿狌犿犮狉狔狊狋犪犾犾犻狀狌犿）和葡萄（犞犻狋犻狊狏犻狀犻犳犲狉犪）
ＨＡＫ２的同源性分别为９２％，８７％，８６％和８０％。系统进化分析进一步表明，ＳｓＨＡＫ２属于ＫＴ／ＨＡＫ／ＫＵＰ家
族的亚族Ⅱ成员，与拟南芥ＡｔＫＵＰ２、ＡｔＫＵＰ６和ＡｔＫＵＰ８的进化关系较近，而与其他亚族成员的进化关系较远
（图５）。
２．２ 盐地碱蓬犛狊犎犃犓２的表达分析
将合成的盐地碱蓬ｃＤＮＡ用特异性表达引物Ｐ７ 和Ｐ８、Ａ１ 和 Ａ２ 进行实时定量ｑＰＣＲ，得到犛狊犎犃犓２和
犛狊犃犆犜犐犖 的ｑＰＣＲ反应产物，经电泳检测，条带单一，无引物二聚体（图６），表明引物的特异性较高，反应条件较
好，可用于犛狊犎犃犓２的表达模式分析。
组织特异性分析结果表明，犛狊犎犃犓２在盐地碱蓬根和叶中均有高丰度表达，在不同浓度Ｋ＋条件下，叶中的
表达量显著高于根中（图７）。此外，不同浓度 Ｋ＋（０．０１和２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）处理均诱导犛狊犎犃犓２的表达，但２．５
ｍｍｏｌ／ＬＫ＋处理下犛狊犎犃犓２的表达显著高于低Ｋ处理（０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ）（图７）。
７１１第２５卷第２期 草业学报２０１６年
图２ 盐地碱蓬犓＋转运蛋白犛狊犎犃犓２的犮犇犖犃核酸序列及其推测的氨基酸序列
犉犻犵．２ 犖狌犮犾犲狅狋犻犱犲狊犲狇狌犲狀犮犲狊犪狀犱犱犲犱狌犮犲犱犪犿犻狀狅犪犮犻犱狉犲狊犻犱狌犲狊狅犳犛狊犎犃犓２犻狀犛．狊犪犾狊犪
左侧的数字分别代表核苷酸和氨基酸的位点，画线处为起始密码子（ＡＴＧ）和终止密码子（ＴＧＡ）。图中１、２、３阴影位置为与水稻 ＫＴ／ＨＡＫ／
ＫＵＰ家族成员对比的３个较为保守区域。Ｔｈｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓａｎｄａｍｉｎｏａｃｉｄｒｅｓｉｄｕｅｓａｒｅｉｎｄｉｃａｔｅｄｂｙｎｕｍｂｅｒｓｏｆｔｈｅｌｅｆｔ．Ｔｈｅｓｔａｒｔｃｏｄｏｎ
（ＡＴＧ）ａｎｄｔｈｅｓｔｏｐｃｏｄｏｎ（ＴＧＡ）ａｒｅｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ．Ｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｃｏｎｖｅｒｓｅｄｒｅｇｉｏｎｓｏｆ１，２ａｎｄ３ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｍｅｍｂｅｒｓｏｆｔｈｅＫＴ／ＨＡＫ／ＫＵＰｆａｍ
ｉｌｙｉｎ犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪ａｒｅｓｈａｄｏｗｅｄ．
８１１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．２
图３ 犛狊犎犃犓２的跨膜区预测
犉犻犵．３ 犜狉犪狀狊犿犲犿犫狉犪狀犲犱狅犿犪犻狀狊狆狉犲犱犻犮狋犻狅狀狅犳犛狊犎犃犓２犻狀犛．狊犪犾狊犪
图４ 盐地碱蓬犛狊犎犃犓２与其他植物犎犃犓２类氨基酸的多重比较
犉犻犵．４ 犛犲狇狌犲狀犮犲犪犾犻犵狀犿犲狀狋狅犳犛狊犎犃犓２犻狀犛．狊犪犾狊犪狑犻狋犺犎犃犓２犾犻犽犲狆狉狅狋犲犻狀狊犳狉狅犿犺犻犵犺犲狉狆犾犪狀狋狊
Ｋ＋转运蛋白 ＨＡＫ２类氨基酸序列的来源和ＧｅｎＢａｎｋ登录号分别为：冰叶日中花 ＭｃＨＡＫ２ｐ（ＡＡＫ５３７５９）和甜菜ＢｖＫＵＰ２（ＡＦＭ９４０１５）。图中
划线区为ＧＶＶＹＧＤＬＳＩＳＰＬＹ序列，在各种植物中均高度保守。ＳｏｕｒｃｅｓｏｆＨＡＫ２ｌｉｋｅＫ＋ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒａｎｄｔｈｅｉｒＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒｓａｒｅａｓ
ｆｏｌｏｗｓ：ＭｃＨＡＫ２ｐ（犕犲狊犲犿犫狉狔犪狀狋犺犲犿狌犿犮狉狔狊狋犪犾犾犻狀狌犿，ＡＦ２６７７５３）ａｎｄＢｖＫＵＰ２（犅犲狋犪狏狌犾犵犪狉犻狊，ＡＦＭ９４０１５）．ＴｈｅｍｏｔｉｆｏｆＧＶＶＹＧＤＬＳＩＳＰＬＹ
ｉｓｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄｗｈｉｃｈｉｓｈｉｇｈｌｙｃｏｎｖｅｒｓｅｄｉｎｍａｎｙｋｉｎｄｓｏｆｐｌａｎｔｓ．
９１１第２５卷第２期 草业学报２０１６年
图５ 盐地碱蓬犛狊犎犃犓２与拟南芥和水稻犓犜／犎犃犓／犓犝犘
家族成员的系统进化分析
犉犻犵．５ 犘犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犛狊犎犃犓２犻狀犛．狊犪犾狊犪犪狀犱犿犲犿犫犲狉狊狅犳
犓犜／犎犃犓／犓犝犘犳犪犿犻犾狔犳狉狅犿犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪犪狀犱犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪
图中Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ和ＩＶ代表不同的亚族分类，●表示ＳｓＨＡＫ２所在位置。Ｋ＋
转运蛋白氨基酸序列在 ＧｅｎＢａｎｋ中的登录号分别为：拟南芥 ＡｔＨＡＫ５
（ＡＴ４Ｇ１３４２０）、ＡｔＫＵＰ１（ＡＴ２Ｇ３００７０）、ＡｔＫＵＰ２（ＡＴ２Ｇ４０５４０）、ＡｔＫＵＰ３
（ＡＴ３Ｇ０２０５０）、ＡｔＫＵＰ４（ＡＴ４Ｇ２３６４０）、ＡｔＫＵＰ５（ＡＴ４Ｇ３３５３０）、ＡｔＫＵＰ６
（ＡＴ１Ｇ７０３００）、ＡｔＫＵＰ７（ＡＴ５Ｇ０９４００）、ＡｔＫＵＰ８（ＡＴ５Ｇ１４８８０）、ＡｔＫＵＰ９
（ＡＴ４Ｇ１９９６０）、ＡｔＫＵＰ１０（ＡＴ１Ｇ３１１２０）、ＡｔＫＵＰ１１（ＡＴ２Ｇ３５０６０）、ＡｔＫＵＰ１２
（ＡＴ１Ｇ６０１６０）；水稻 ＯｓＨＡＫ１（ＮＣ＿００８３９７）、ＯｓＨＡＫ２（ＢＡＦ０７２３４）、Ｏｓ
ＨＡＫ３（ＡＪ４２７９７４）、ＯｓＨＡＫ４（ＡＫ０７１６９８）、ＯｓＨＡＫ５（ＡＰ００３２７２）、ＯｓＨＡＫ６
（ＮＰ＿００１０４５２９８）、ＯｓＨＡＫ７（ＡＪ４２７９７６）、ＯｓＨＡＫ８（Ｑ８ＶＸＢ５）、ＯｓＨＡＫ９
（ＡＪ４２７９７８）、ＯｓＨＡＫ１０（ＡＪ４２７９７９）、ＯｓＨＡＫ１１（ＡＪ４２７９８０）、ＯｓＨＡＫ１２
（ＡＪ４２７９８１）、ＯｓＨＡＫ１３（ＢＡＦ２０２４４）、ＯｓＨＡＫ１４（ＡＪ４２７９８３）、ＯｓＨＡＫ１５
（ＡＪ４２７９８４）、ＯｓＨＡＫ１６（ＢＡＦ１２４４４）、ＯｓＨＡＫ１７（ＡＪ４２７９７５）、ＯｓＨＡＫ１８（ＮＰ＿
００１０６３９３８）、ＯｓＨＡＫ１９（ＢＡＦ０８８８０）、ＯｓＨＡＫ２０（ＢＡＦ０８８８２）、ＯｓＨＡＫ２１
（ＢＡＨ９２２３５）、ＯｓＨＡＫ２２（ＥＥＣ８１３７０）、ＯｓＨＡＫ２３（ＢＡＦ２４９６０）、ＯｓＨＡＫ２４
（ＢＡＦ１９２７１）、ＯｓＨＡＫ２５（ＥＥＣ７３９３８）、ＯｓＨＡＫ２６（ＢＡＦ２４１１９）、ＯｓＨＡＫ２７
（ＢＡＦ１２４４３）。Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩａｎｄＩＶｉｎｔｈｅｆｉｇｕｒｅｉｎｄｉｃａｔｅｄｉｆｅｒｅｎｔｓｕｂｆａｍｉｌｉｅｓ，
ＳｓＨＡＫ２ｉｓｓｈｏｗｎａｓ●．ＳｏｕｒｃｅｓｏｆＫ＋ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓａｎｄｔｈｅｉｒＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓ
ｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒｓａｒｅａｓｆｏｌｏｗｓ：犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪：ＡｔＨＡＫ５（ＡＴ４Ｇ１３４２０），
ＡｔＫＵＰ１（ＡＴ２Ｇ３００７０），ＡｔＫＵＰ２（ＡＴ２Ｇ４０５４０），ＡｔＫＵＰ３（ＡＴ３Ｇ０２０５０），
ＡｔＫＵＰ４（ＡＴ４Ｇ２３６４０），ＡｔＫＵＰ５（ＡＴ４Ｇ３３５３０），ＡｔＫＵＰ６（ＡＴ１Ｇ７０３００），
ＡｔＫＵＰ７（ＡＴ５Ｇ０９４００），ＡｔＫＵＰ８（ＡＴ５Ｇ１４８８０），ＡｔＫＵＰ９（ＡＴ４Ｇ１９９６０），
ＡｔＫＵＰ１０（ＡＴ１Ｇ３１１２０），ＡｔＫＵＰ１１（ＡＴ２Ｇ３５０６０），ＡｔＫＵＰ１２（ＡＴ１Ｇ６０
１６０）；犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪：ＯｓＨＡＫ１（ＮＣ＿００８３９７），ＯｓＨＡＫ２（ＢＡＦ０７２３４），Ｏｓ
ＨＡＫ３（ＡＪ４２７９７４），ＯｓＨＡＫ４（ＡＫ０７１６９８），ＯｓＨＡＫ５（ＡＰ００３２７２），ＯｓＨＡＫ６
（ＮＰ＿００１０４５２９８），ＯｓＨＡＫ７（ＡＪ４２７９７６），ＯｓＨＡＫ８（Ｑ８ＶＸＢ５），ＯｓＨＡＫ９
（ＡＪ４２７９７８），ＯｓＨＡＫ１０（ＡＪ４２７９７９），ＯｓＨＡＫ１１（ＡＪ４２７９８０），ＯｓＨＡＫ１２
（ＡＪ４２７９８１），ＯｓＨＡＫ１３（ＢＡＦ２０２４４），ＯｓＨＡＫ１４（ＡＪ４２７９８３），ＯｓＨＡＫ１５
（ＡＪ４２７９８４），ＯｓＨＡＫ１６（ＢＡＦ１２４４４），ＯｓＨＡＫ１７（ＡＪ４２７９７５），ＯｓＨＡＫ１８
（ＮＰ＿００１０６３９３８），ＯｓＨＡＫ１９（ＢＡＦ０８８８０），ＯｓＨＡＫ２０（ＢＡＦ０８８８２），Ｏｓ
ＨＡＫ２１（ＢＡＨ９２２３５），ＯｓＨＡＫ２２（ＥＥＣ８１３７０），ＯｓＨＡＫ２３（ＢＡＦ２４９６０），Ｏｓ
ＨＡＫ２４（ＢＡＦ１９２７１），ＯｓＨＡＫ２５（ＥＥＣ７３９３８），ＯｓＨＡＫ２６（ＢＡＦ２４１１９），Ｏｓ
ＨＡＫ２７（ＢＡＦ１２４４３）．
图６ 实时定量狇犘犆犚产物电泳检测图
犉犻犵．６ 犃犵犪狉狅狊犲犵犲犾犲犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊犪狀犪犾狔狊犻狊
狅犳狉犲犪犾狋犻犿犲狇犘犆犚狆狉狅犱狌犮狋狊
１、２和３：犛狊犎犃犓２实时定量ｑＰＣＲ产物；４、５和６：犛狊犃犆犜犐犖 实
时定量ｑＰＣＲ产物；Ｍ：ＤＬ４０００ＤＮＡ标记。１，２ａｎｄ３：ｔｈｅｒｅａｌ
ｔｉｍｅｑＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｏｆ犛狊犎犃犓２；４，５ａｎｄ６：ｔｈｅｒｅａｌｔｉｍｅｑＰＣＲ
ｐｒｏｄｕｃｔｏｆ犛狊犃犆犜犐犖；Ｍ：ＤＬ４０００ＤＮＡｍａｒｋｅｒ．
图７ 犛狊犎犃犓２的组织特异性分析
犉犻犵．７ 犜犻狊狊狌犲狊狆犲犮犻犳犻犮犻狋狔狅犳犛狊犎犃犓２犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀犻狀犛．狊犪犾狊犪
数值为平均值±ＳＥ（狀＝３）。柱上不同字母代表在犘＜０．０５水
平上差异显著（Ｄｕｎｃａｎ检验）。犛狊犃犆犜犐犖 为内参基因。实验重复
３次。下同。Ｔｈｅｄａｔａａｒｅｍｅａｎｓ±ＳＥ（狀＝３）．Ｃｏｌｕｍｎｓｗｉｔｈｄｉｆ
ｆｅｒｅｎｔｌｅｔｔｅｒｓｉｎｄｉｃａｔｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓａｔ犘＜０．０５（Ｄｕｎｃａｎ’ｓ
ｔｅｓｔ）．犛狊犃犆犜犐犖ｉｓｕｓｅｄａｓａｎｉｎｔｅｒｎａｌｃｏｎｔｒｏｌ．Ｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ
ａｒｅｒｅｐｅａｔｅｄｆｏｒｔｈｒｅｅｔｉｍｅｓ．Ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ．
进一步分析不同浓度 Ｋ＋ 下添加 ＮａＣｌ对
犛狊犎犃犓２表达的影响，结果见图８。在含有２．５
ｍｍｏｌ／ＬＫ＋的介质中，根和叶中犛狊犎犃犓２的表达
受２５ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ处理的显著诱导，且随处理时
间延长，分别在２４和６ｈ处表达量达到最高，较各
自对照（０ｈ）增加了２５％和１６９％；高 Ｎａ＋ （１５０
ｍｍｏｌ／Ｌ）处理对根中犛狊犎犃犓２的表达无影响，但
抑制了叶中的表达（图８Ａ 和Ｂ）。０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｋ＋条件下，２５和１５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ的加入均抑制
根中犛狊犎犃犓２的表达，且随处理时间延长，在２４ｈ
处表达量较对照（０ｈ）分别降低３８％和５８％；然
而，２５ 和 １５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ 的 加 入 使 叶 中
犛狊犎犃犓２的表达显著增加，且在处理６ｈ后，较对
０２１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．２
图８ 不同浓度犓＋和犖犪＋处理０、６和２４犺后犛狊犎犃犓２的相对表达量
犉犻犵．８ 犈狓狆狉犲狊狊犻狅狀犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犛狊犎犃犓２犻狀犛．狊犪犾狊犪狌狀犱犲狉犱犻犳犳犲狉犲狀狋犓＋ 狆犾狌狊犱犻犳犳犲狉犲狀狋犖犪＋犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狊犳狅狉０，６犪狀犱２４犺
Ａ和Ｂ：２．５ｍｍｏｌ／ＬＫ＋处理；Ｃ和Ｄ：０．０１ｍｍｏｌ／ＬＫ＋处理。ＡａｎｄＢ：ｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆ２．５ｍｍｏｌ／ＬＫ＋；ＣａｎｄＤ：ｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆ０．０１
ｍｍｏｌ／ＬＫ＋．
照（０ｈ）分别增加了８０％和５１％ （图８Ｃ和Ｄ）。以上结果表明，犛狊犎犃犓２的表达受介质中 Ｋ＋和 Ｎａ＋的共同
调节。
３ 讨论
迄今为止，已经从很多植物如大麦［１４］、玉米（犣犲犪犿犪狔狊）［１９］、胡椒（犘犻狆犲狉狀犻犵狉狌犿）［２０］、冰叶日中花［２１］、葡
萄［２２］、番茄（犛狅犾犪狀狌犿犾狔犮狅狆犲狉狊犻犮狌犿）［２３］等中克隆到ＫＴ／ＨＡＫ／ＫＵＰ家族部分成员基因，然而，该家族的结构仍
未研究清楚。虽然ＫＴ／ＨＡＫ／ＫＵＰ家族并不具备完全相同的功能保守域，但在氨基酸序列上都含有１个明显的
特征犌ＶＶＹ犌犇ＬＧＴ犛犘犔犢（加粗字母为在所有基因中都十分保守）［２４］。本研究得到的ＳｓＨＡＫ２氨基酸序列中同
样包含这一保守序列（图４）。此外，Ｇｕｐｔａ等［２５］的研究发现，水稻ＫＴ／ＨＡＫ／ＫＵＰ家族成员（除ＯｓＨＡＫ２２外）
中都含有３个很保守的区域，经过对比，在盐地碱蓬中，同样有这样的保守区域存在（图２），表明ＳｓＨＡＫ２与水稻
中这些蛋白的结构和功能可能存在相似之处。研究表明，高等植物中ＫＴ／ＨＡＫ／ＫＵＰ家族蛋白成员含有１０～
１４个跨膜区域［２６］。经过ＴＭＨＭＭ在线软件分析可见，ＳｓＨＡＫ２含有１２个跨膜区（图３），与大麦和水稻等中的
研究结果一致。ＫＴ／ＨＡＫ／ＫＵＰ家族根据系统发生分析可划分为４个亚族：亚族Ⅰ包括拟南芥ＡｔＨＡＫ５、水稻
ＯｓＨＡＫ１和大麦 ＨｖＨＡＫ１等，主要介导高亲和性Ｋ＋转运过程；大麦 ＨｖＨＡＫ２、拟南芥ＡｔＫＵＰ１和ＡｔＫＵＰ２
属于亚族Ⅱ成员，在单子叶植物中经常转运低亲和性Ｋ＋吸收，而在双子叶植物中表现出不同的转运活性［２４］；亚
族Ⅲ和Ⅳ成员的研究相对较少。本研究中，我们将拟南芥１３个和水稻２７个ＫＴ／ＨＡＫ／ＫＵＰ家族成员与盐地碱
蓬ＳｓＨＡＫ２进行了系统进化分析（图５），结果显示，ＳｓＨＡＫ２属于亚族Ⅱ成员，与拟南芥 ＡｔＫＵＰ２、水稻 Ｏｓ
ＨＡＫ８和ＯｓＨＡＫ９位于同一进化分枝，表明ＳｓＨＡＫ２可能具有与ＡｔＫＵＰ２等类似的Ｋ＋转运功能和特征。以
上结果均表明，本研究克隆到的犛狊犎犃犓２编码ＫＴ／ＨＡＫ／ＫＵＰ家族Ｋ＋转运蛋白。
Ａｈｎ等［２７］对拟南芥ＫＴ／ＨＡＫ／ＫＵＰ家族１３个成员进行组织表达特异性分析发现，亚族Ⅱ基因成员犃狋犓
犝犘１、犃狋犓犝犘２、犃狋犓犝犘４、犃狋犓犝犘６和犃狋犓犝犘８在根和叶中均有高丰度表达。Ｓｕ等［２１］发现，亚族Ⅱ基因成员
犕犮犎犃犓１和犕犮犎犃犓４在冰叶日中花根、茎叶中有高丰度表达。与这些结果相一致，本研究中，犛狊犎犃犓２在盐地
碱蓬的根和叶中均表达（图７），表明其可能在根和叶中发挥重要的作用。研究表明，ＫＴ／ＨＡＫ／ＫＵＰ家族的亚族
１２１第２５卷第２期 草业学报２０１６年
Ⅱ成员在不同的双子叶植物中表现出不同的转运活性。Ｒｉｇａｓ等［２８］发现，ＡｔＫＵＰ４介导拟南芥高亲和性Ｋ＋吸
收过程。然而，ＡｔＫＵＰ６和ＡｔＫＵＰ２则被证实介导拟南芥低亲和性Ｋ＋吸收过程［２７，２９］。更有趣的是，ＡｔＫＵＰ１
介导兼性Ｋ＋吸收过程，在酵母Ｋ＋吸收缺陷突变株中表达时，于不同Ｋ＋浓度条件下均增加菌株的Ｋ＋吸收能
力，当外部Ｋ＋浓度在１００～２００μｍｏｌ／Ｌ之间时发生从高亲和性到低亲和性Ｋ
＋吸收的相变［３０］。然而，Ｏｓａｋａｂｅ
等［３１］对拟南芥三突变体犪狋犽狌狆２／６／８的研究发现，ＫＴ／ＨＡＫ／ＫＵＰ家族的亚族Ⅱ成员ＡｔＫＵＰ２、ＡｔＫＵＰ６和Ａｔ
ＫＵＰ８可能参与拟南芥的Ｋ＋外流过程。本研究中，０．０１和２．５０ｍｍｏｌ／ＬＫ＋处理均诱导根和叶中犛狊犎犃犓２的
表达（图７），表明ＳｓＨＡＫ２在盐地碱蓬体内Ｋ＋吸收及转运过程中可能发挥重要作用。
Ｌｉ等［３２］在研究Ｋ＋营养对盐胁迫下盐地碱蓬幼苗生长影响的过程中，发现１００和４００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ处理
下，提高介质中Ｋ＋浓度可明显增加植株的水分、干鲜重、生长速率，表明Ｋ＋对盐地碱蓬的耐盐性至关重要。本
研究初步分析了不同浓度Ｋ＋和Ｎａ＋处理下盐地碱蓬犛狊犎犃犓２表达模式的变化（图８）。不同浓度Ｎａ＋处理对盐
地碱蓬犛狊犎犃犓２表达的影响受介质中Ｋ＋浓度的调节（图８），表明ＳｓＨＡＫ２可能参与盐处理下的盐地碱蓬体内
Ｋ＋吸收及转运过程。Ｒｕｂｉｏ等［３３］对拟南芥的研究发现，Ｋ＋缺失引起根中犃狋犎犃犓５的表达下调，却显著增加其
在叶中的表达，可见，ＡｔＨＡＫ５可能在不同的组织部位中发挥不同的作用，但是具体的原因尚不清楚。Ｓｕ等［２１］
研究发现，高盐处理（４００ｍｍｏｌ／ＬＮａ＋）显著诱导冰叶日中花犕犮犎犃犓１和犕犮犎犃犓４的表达，利用原位杂交在
成熟根和叶的脉管组织中观测到极强的 ＭｃＨＡＫ１和 ＭｃＨＡＫ４的杂交信号，推测它们可能会通过脉管组织中的
装载／卸载影响植物Ｋ＋的长距离运输，从而调节根中的Ｋ＋吸收过程。本研究中，低Ｋ＋（０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ）条件下，
不同浓度Ｎａ＋（２５和１５０ｍｍｏｌ／Ｌ）的添加抑制盐地碱蓬根中犛狊犎犃犓２的表达，却显著诱导叶中犛狊犎犃犓２的表
达；２．５ｍｍｏｌ／ＬＫ＋处理下，不同浓度Ｎａ＋（２５和１５０ｍｍｏｌ／Ｌ）的添加也引起根和叶中犛狊犎犃犓２表达的变化不
同。我们推测，盐处理下，犛狊犎犃犓２在盐地碱蓬根和叶中发挥不同的功能，且可能在叶中发挥的作用更大，具体
机制有待更深一步研究。
综上所述，犛狊犎犃犓２编码ＫＴ／ＨＡＫ／ＫＵＰ家族Ｋ＋转运蛋白，在根和叶中均有高丰度表达，转录丰度受外界
Ｋ＋和Ｎａ＋浓度的调节，可能参与盐地碱蓬体内Ｋ＋的吸收和转运过程，且根和叶中可能发挥不同的功能。该研
究为进一步分析ＳｓＨＡＫ２在盐地碱蓬中的功能提供了分子基础。
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３２１第２５卷第２期 草业学报２０１６年