全 文 ：书犇犗犐：１０．１１６８６／犮狔狓犫２０１５５３２ 犺狋狋狆：／／犮狔狓犫．犾狕狌．犲犱狌．犮狀
陈彩虹，钏秀娟，王荟，贾艳星，陈志坚，刘国道，罗丽娟．农杆菌侵染条件对柱花草遗传转化效率的影响．草业学报，２０１６，２５（６）：１０２１０８．
ＣＨＥＮＣａｉＨｏｎｇ，ＣＨＵＡＮＸｉｕＪｕａｎ，ＷＡＮＧＨｕｉ，ＪＩＡＹａｎＸｉｎｇ，ＣＨＥＮＺｈｉＪｉａｎ，ＬＩＵＧｕｏＤａｏ，ＬＵＯＬｉＪｕａｎ．Ｆａｃｔｏｒｓａｆｆｅｃｔｉｎｇｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒ
ｍａｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｆｏｒｓｔｙｌｏ（犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊）ｗｉｔｈ犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１６，２５（６）：１０２１０８．
农杆菌侵染条件对柱花草遗传转化效率的影响
陈彩虹１，钏秀娟１，王荟１，贾艳星１，陈志坚２，刘国道２，罗丽娟１
（１．海南大学园艺园林学院，海南 海口５７０２２８；２．中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，海南 儋州５７１７３７）
摘要：在前期建立的柱花草高效组织再生体系基础上，进一步以柱花草热研５号的下胚轴为受体材料，以犌犝犛基
因为报告基因，研究了农杆菌介导的柱花草遗传转化的几个影响因素，包括根癌农杆菌菌液浓度、浸染时间和共培
养时间等对农杆菌介导的柱花草遗传转化效率的影响。结果表明，以柱花草下胚轴为外植体，在农杆菌菌液浓度
（ＯＤ６００）为０．４～０．６，农杆菌浸染时间为１５ｍｉｎ和共培养３ｄ的条件下，愈伤的转化效率为７２％。愈伤组织进一
步经过分化、生根和炼苗等过程后，对转化植株进行ＧＵＳ染色和ＰＣＲ检测，结果表明外源基因已成功整合到柱花
草基因组中。本研究结果对柱花草遗传转化和关键基因功能研究具有重要的参考价值。
关键词：根癌农杆菌；遗传转化；ＧＵＳ染色；柱花草　　
犉犪犮狋狅狉狊犪犳犳犲犮狋犻狀犵犵犲狀犲狋犻犮狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狋犻狅狀犲犳犳犻犮犻犲狀犮狔犳狅狉狊狋狔犾狅（犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊）
狑犻狋犺犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊
ＣＨＥＮＣａｉＨｏｎｇ１，ＣＨＵＡＮ ＸｉｕＪｕａｎ１，ＷＡＮＧ Ｈｕｉ１，ＪＩＡ ＹａｎＸｉｎｇ１，ＣＨＥＮＺｈｉＪｉａｎ２，ＬＩＵ ＧｕｏＤａｏ２，
ＬＵＯＬｉＪｕａｎ１
１．犎狅狉狋犻犮狌犾狋狌狉犲犪狀犱犔犪狀犱狊犮犪狆犲狅犳犎犪犻狀犪狀犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犎犪犻犽狅狌５７０２２８，犆犺犻狀犪；２．犜狉狅狆犻犮犪犾犆狉狅狆犌犲狀犲狋犻犮犚犲狊狅狌狉犮犲狊犐狀狊狋犻狋狌狋犲，犆犺犻
狀犲狊犲犃犮犪犱犲犿狔狅犳犜狉狅狆犻犮犪犾犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犛犮犻犲狀犮犲狊，犇犪狀狕犺狅狌５７１７３７，犆犺犻狀犪
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｔｈｅｏｂｊｅｃｔｉｖｅｏｆｔｈｉｓｓｔｕｄｙｗａｓｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆ犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｔｉｍｅ
ａｎｄｃｏｃｕｌｔｕｒｅｄｕｒａｔｉｏｎｏｎｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｆｏｒｓｔｙｌｏ（犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊）ｕｓｉｎｇａ
ｈｉｇｈｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｔｈａｔｈａｄｂｅｅｎｄｅｖｅｌｏｐｅｄｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ．Ｈｙｐｏｃｏｔｙｌｓｆｒｏｍｓｔｙｌｏｓｅｅｄｌｉｎｇｓｗｅｒｅ
ｕｓｅｄａｓｐｌａｎｔｍａｔｅｒｉａｌａｎｄｔｈｅβｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ（ＧＵＳ）ｇｅｎｅｗａｓｕｓｅｄａｓｔｈｅｒｅｐｏｒｔｅｒｇｅｎｅ．Ｔｈｅｃａｌｕｓｔｒａｎｓｆｏｒ
ｍａｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｗａｓｅｖａｌｕａｔｅｄｂｙＧＵＳｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｔｈｅｃａｌｕｓｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｒｅａｃｈｅｄ７２％ｕｎｄｅｒｔｈｅ
ｆｏｌｏｗｉｎｇｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿ａｔａｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＯＤ６００＝０．４－０．６，ｗｉｔｈ１５ｍｉｎｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄ３ｄａｙｓ
ｏｆｃｏｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ．ＴｈｅｅｘｏｇｅｎｏｕｓｇｅｎｅｈａｄｂｅｅｎｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｉｎｔｏｔｈｅｓｔｙｌｏｇｅｎｏｍｅａｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｂｙＧＵＳ
ｓｔａｉｎｉｎｇａｎｄＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｆｔｅｒｃａｌｕｓｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ｓｈｏｏｔｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｄｒｏｏｔｉｎｇ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｔｈａｔｔｈｉｓ犃．狋狌
犿犲犳犪犮犻犲狀狊ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｉｓｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｇｅｎｅｔｉｃｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｅｎｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｓｔｙｌｏ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊；ｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ＧＵＳｓｔａｉｎｉｎｇ；犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊
柱花草（犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊ｓｐｐ．）是一种重要的豆科牧草，主要分布在热带、亚热带以及温带地区［１］。“热研５号”
柱花草是从哥伦比亚国际热带农业中心（ＣＩＡＴ）引进的ＣＩＡＴ１８４柱花草群体中，通过对早花、耐寒和抗病等性状
１０２－１０８
２０１６年６月
　　　草　业　学　报　　　
　　　ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ　　　
第２５卷　第６期
Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．６
收稿日期：２０１５１１２６；改回日期：２０１６０１２６
基金项目：国家自然科学基金（３１３６０５７５），国家牧草产业技术体系热带牧草育种（ＣＡＲＳ３５０３），海南大学优秀研究生学位论文培育计划
（Ｍ８Ｋ３１２４００１００１００３００２）资助。
作者简介：陈彩虹（１９９２），女，海南文昌人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：３３１２０２０６２＠ｑｑ．ｃｏｍ
通信作者Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ．Ｅｍａｉｌ：Ｌｕｏｌｊｄ＠１２６．ｃｏｍ
的单株选育而成，已被种植于我国南方地区，其具有高产、抗炭疽病和耐寒等特点［２］。随着研究技术手段的发展，
柱花草在生理生化特性［３］、遗传多样性［４］和植株再生以及遗传转化［５］等方面吸引了广泛的关注和研究。然而，由
于存在着可利用资源少、遗传能力弱和易感染炭疽病等限制因素［６］，严重制约了柱花草深入研究的开展。为了解
决在柱花草中存在的上述问题，最有效和最常用的研究手段就是通过生物技术方法对柱花草进行遗传改良。
根癌农杆菌介导的植物遗传转化是一种最常用的转基因方法，在水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）、玉米（犣犲犪犿犪狔狊）、高
粱（犛狅狉犵犺狌犿犫犻犮狅犾狅狉）和大豆（犌犾狔犮犻狀犲犿犪狓）中都有成功的研究报道［７１０］。不同品种柱花草的组织再生以及遗传
转化已有文献报道，如犛．犺犪犿犪狋犪［１１］，犛．犺狌犿犻犾犻狊［１２１３］和犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊等［５，１４］。Ｍａｎｎｅｒｓ和 Ｗａｙ［１３］采用叶盘转
化法将载体狆犌犞３８５０：１０３狀犲狅转化犛．犺狌犿犻犾犻狊，并获得转基因植株。Ｗａｎｇ等［１５］采用叶盘转化法将口蹄疫病毒
外壳蛋白犞犘１基因转化到柱花草栽培品种“热研二号”中，获得了转基因植株。但是，迄今为止，国内外并未有从
农杆菌浸染条件方面对柱花草遗传转化条件进行摸索和优化。并且，由于转化效率低，在转基因柱花草植株中进
行基因功能分析只有少量文献被报道［１５１６］，表明了柱花草是一种难以被根癌农杆菌介导转化的豆科牧草。因此，
对农杆菌介导的遗传转化条件进行摸索和优化，在稳定的组织再生体系基础上，建立和优化柱花草遗传转化体
系，对柱花草遗传改良和基因功能研究有着重要的意义。
农杆菌介导的遗传转化效率受许多因素的影响，包括植物种类、外植体选择、愈伤组织诱导和分化、农杆菌浸
染条件等方面［７１０］。本研究在前期建立的柱花草“热研５号”组织再生体系基础上［１７］，从农杆菌浸染条件方面对
柱花草遗传转化条件进行摸索和优化，利用ＧＵＳ染色方法分析转化效率，并通过ＰＣＲ检测来鉴定转基因柱花草
植株，为柱花草遗传改良和重要基因功能研究提供重要的技术支持。
１　材料与方法
１．１　材料
１．１．１　植物与载体菌株　　柱花草为“热研５号”品种（犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ｃｖ．ＲｅｙａｎＮｏ．５），由中国热带
农业科学院品种资源研究所牧草中心提供，２０１４年１０月１３日种无菌苗；根癌农杆菌为ＥＨＡ１０５（犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻
狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊），载体质粒为ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１（含ＧＵＳ报告基因及潮霉素Ｈｙｇ筛选标记）。
１．１．２　试剂材料　　ＤＮＡ聚合酶（ＰｒｅｍｉｘＴａｑＶｅｒｓｉｏｎ２．０）和ＤＮＡ分子量标准（ＤＮＡＬａｄｄｅｒＭａｒｋｅｒ）均购
自大连ＴａＫａＲａ公司；新型广谱植物基因组ＤＮＡ快速提取试剂盒购自北京盖宁金诺生物技术有限责任公司；卡
那霉素、利福平、潮霉素、乙酰丁香酮均购自北京索莱宝有限公司；ＰＣＲ引物合成由北京六合华大基因科技股份
有限公司合成完成；常规化学药品及组织培养所用试剂均为国产ＡＲ级分析纯。
表１　植株再生和农杆菌培养基本培养基
犜犪犫犾犲１　犕犲犱犻狌犿犳狅狉狆犾犪狀狋狉犲犵犲狀犲狉犪狋犻狅狀犪狀犱犮狌犾狋狌狉犲狅犳犃．狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊
培养基 Ｍｅｄｉｕｍ 组分Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ
愈伤诱导培养基Ｃａｌｕｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎｍｅｄｉａ
（ＣＩＭ）
ＭＳ＋２．０ｍｇ／Ｌ６苄氨基嘌呤＋０．５ｍｇ／Ｌ１萘乙酸＋３０ｇ／Ｌ蔗糖＋８ｇ／Ｌ琼脂粉。ＭＳ＋２．０
ｍｇ／Ｌ６ｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｏｐｕｒｉｎｅ＋０．５ｍｇ／Ｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅａｃｅｔｉｃａｃｉｄ＋３０ｇ／Ｌｓｕｃｒｏｓｅ＋８ｇ／Ｌａｇａｒ．
芽诱导培养基Ｓｈｏｏｔｉｎｄｕｃｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍ
（ＳＩＭ）
ＭＳ＋２．０ｍｇ／Ｌ６苄氨基嘌呤＋３０ｇ／Ｌ蔗糖＋８ｇ／Ｌ琼脂粉。ＭＳ＋２．０ｍｇ／Ｌ６ｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｏｐｕ
ｒｉｎｅ＋３０ｇ／Ｌｓｕｃｒｏｓｅ＋８ｇ／Ｌａｇａｒ．
状芽培养基Ｓｈｏｏｔｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍ
（ＳＥＭ）
ＭＳ＋０．４ｍｇ／Ｌ６苄氨基嘌呤＋０．１ｍｇ／Ｌ１萘乙酸＋３０ｇ／Ｌ蔗糖＋８ｇ／Ｌ琼脂粉。ＭＳ＋０．４
ｍｇ／Ｌ６ｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｏｐｕｒｉｎｅ＋０．１ｍｇ／Ｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅａｃｅｔｉｃａｃｉｄ＋３０ｇ／Ｌｓｕｃｒｏｓｅ＋８ｇ／Ｌａｇａｒ．
生根培养基Ｒｏｏｔｉｎｇｍｅｄｉｕｍ（ＲＭ） ＭＳ＋０．５ｍｇ／Ｌ３吲哚乙酸＋０．５ｍｇ／Ｌ３吲哚丁酸＋３０ｇ／Ｌ蔗糖＋８ｇ／Ｌ琼脂粉＋０．８ｇ／Ｌ活性
炭。ＭＳ＋０．５ｍｇ／Ｌｉｎｄｏｌｅ３ｂｕｔｙｌａｃｉｄ＋０．５ｍｇ／Ｌｉｎｄｏｌｅ３ａｃｅｔｉｃａｃｉｄ＋３０ｇ／Ｌｓｕｃｒｏｓｅ＋８ｇ／Ｌ
ａｇａｒ＋０．８ｇ／Ｌａｃｔｉｖａｔｅｄｃａｒｂｏｎ．
ＹＥＢ农杆菌培养基Ｇｒｏｗｔｈｍｅｄｉｕｍｆｏｒ
犃．狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊（ＹＥＢ）
１ｇ／Ｌ酵母提取物＋５ｇ／Ｌ胰蛋白胨＋５ｇ／Ｌ牛肉浸膏＋５ｇ／Ｌ蔗糖＋０．４９ｇ／ＬＭｇＳＯ４。１ｇ／Ｌ
ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ＋５ｇ／Ｌｐｅｐｔｏｎｅ＋５ｇ／Ｌｂｅｅｆｅｘｔｒａｃｔ＋５ｇ／Ｌｓｕｃｒｏｓｅ＋０．４９ｇ／ＬＭｇＳＯ４．
３０１第２５卷第６期 草业学报２０１６年
１．２　方法
１．２．１　无菌苗的培养　　无菌苗培养参照钏秀娟等［１７］方法进行，待子叶完全展开后备用。
１．２．２　农杆菌菌液的制备　　将含质粒ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１的农杆菌ＥＨＡ１０５菌液，划线培养于含有５０ｍｇ／Ｌ卡
那霉素和５０ｍｇ／Ｌ利福平的ＹＥＢ固体培养基上（表１），于２８℃培养２ｄ。挑取单克隆接种于含有５０ｍｇ／Ｌ卡那
霉素和５０ｍｇ／Ｌ利福平的ＹＥＢ液体培养基中２８℃培养过夜。将２０μＬ菌液加入到添加相应抗生素的５０ｍＬ
ＹＥＢ液体培养基中培养至ＯＤ６００为０．６。菌液于２５℃，４０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，去上清，菌体沉淀用５０ｍＬ新鲜
ＹＥＢ液体培养基重悬使其最终ＯＤ６００为０．６［１８］。
１．２．３　农杆菌介导的遗传转化、抗性愈伤的筛选和植株再生　　将下胚轴置于农杆菌（菌液ＯＤ６００为０．６）悬浮
液中浸染１５ｍｉｎ，并于２５℃共培养３ｄ后，将外植体材料转移至含２００ｍｇ／Ｌ羧苄青霉素（Ｃａｒｂ）的ＣＩＭ培养基
上恢复培养１周，随后转移至含１５ｍｇ／ＬＨｙｇ和２００ｍｇ／ＬＣａｒｂ的ＣＩＭ培养基中进行筛选和再生。２８ｄ后将
抗性愈伤转移至含１５ｍｇ／ＬＨｙｇ和２００ｍｇ／ＬＣａｒｂ的芽诱导胚芽培养基（表１，ＳＩＭ）中，１０～３０ｄ后有体胚形
成，并将成熟的体胚转入含２００ｍｇ／ＬＣａｒｂ的状芽（表１，ＳＥＭ）培养基中，待丛生芽长到２ｃｍ时，从基部切断丛
生芽并转移至含２００ｍｇ／ＬＣａｒｂ的生根培养基（表１，ＲＭ）中培养，１５ｄ后可获得抗性再生植株。将生根良好的
再生植株经闭瓶炼苗、开瓶炼苗和移栽后，即可定植。
１．２．４　转化条件的优化　　农杆菌菌液浓度摸索：取下胚轴分别置于含不同农杆菌菌液浓度（ＯＤ６００为０．２，
０．４，０．６和０．８）的悬浮液中浸泡１５ｍｉｎ，无菌滤纸沥干残留的菌液，然后转移至愈伤诱导培养基（表１，ＣＩＭ）中，
于２５℃暗培养３ｄ后，进行恢复及筛选培养，通过ＧＵＳ染色结果统计筛选后的阳性转化愈伤数量。每个处理设
置３个生物学重复。
农杆菌浸染时间摸索：取下胚轴分别置于 ＯＤ６００为０．６的农杆菌悬浮液中浸泡不同时间（５，１０，１５和２０
ｍｉｎ），无菌滤纸沥干残留的菌液，然后转移至愈伤诱导培养基（表１，ＣＩＭ）中，于２５℃暗培养３ｄ后，进行恢复及
筛选培养，通过ＧＵＳ染色结果统计筛选后的阳性转化愈伤数量。每个处理设置３个生物学重复。
共培养时间筛选：下胚轴于ＯＤ６００为０．６的农杆菌悬浮液浸染１５ｍｉｎ，无菌滤纸沥干残留的菌液，然后转移
至愈伤诱导培养基（表１，ＣＩＭ）中，于２５℃共培养１到４ｄ后，进行恢复及筛选培养，通过ＧＵＳ染色结果统计筛
选后的阳性转化愈伤数量。每个处理设置３个生物学重复。
１．２．５　ＧＵＳ染色分析　　ＧＵＳ染色参照Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ［１９］方法进行。将转化材料浸在ＧＵＳ染液中，于３７℃中反应
８～１０ｈ，取出放入７５％乙醇中脱色１２ｈ，然后在实体显微镜观察外植体染色情况。
１．２．６　ＰＣＲ鉴定转化植株　　提取再生柱花草植株叶片的基因组ＤＮＡ后，通过ＰＣＲ扩增犌犝犛基因，引物序
列分别为Ｆ：５′ＴＣＧＣＧＣＡＡＧＡＣＴＧＴＡＡＣＣＡＣ３′和 Ｒ：５′ＣＴＴＴＡＧＧＣＡＴＴＧＧＴＴＴＣＧＡＡＧＣ３′。ＰＣＲ扩增
条件为：９４℃预变性５ｍｉｎ，９４℃变性３０ｓ，５７℃退火３０ｓ，７２℃延伸３０ｓ，３０个循环，最后７２℃延伸１０ｍｉｎ，随后
将ＰＣＲ扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
转化效率（％）＝ＧＵＳ染色阳性数／筛选后的愈伤总数×１００
１．３　数据统计分析
所有数据均用 Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔｏｆｆｉｃｅｅｘｃｅｌ２００３进行处理，采用ＳＰＳＳ软件（ｖ１３．０）进行数据统计分析。
２　结果与分析
２．１　柱花草的遗传转化
以柱花草热研５号下胚轴为外植体，农杆菌介导遗传转化的共培养时期、恢复培养时期、愈伤筛选、诱芽、壮
芽、生根以及移栽等过程如图１所示。
２．２　不同农杆菌浸染条件对愈伤组织转化效率的影响
在农杆菌介导的遗传转化中，农杆菌菌液浓度、浸染时间和共培养时间均对转化效率有显著的影响。从图
２Ａ可以看出，随着农杆菌菌液浓度升高，愈伤组织的转化效率有增加的趋势，当ＯＤ６００为０．４到０．６时，转化效
率最高，约达６０％；但是，随着菌液浓度增加，转化效率有降低的趋势，当ＯＤ６００为０．８时，转化效率为５２％，且愈
４０１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．６
伤组织分化率降低，并逐渐褐化。所以，ＯＤ６００为０．４～０．６是最适合的农杆菌菌液浸染浓度。
从图２Ｂ可以看出，随着农杆菌浸染时间延长，愈伤组织的转化效率有明显增加的趋势，当浸染时间为１５
ｍｉｎ时，转化效率最高，转化效率为浸染５ｍｉｎ时的２．３倍；但是，随着浸染时间的继续增加，转化效率显著降低，
且对愈伤组织造成伤害，浸染时间２０ｍｉｎ时的转化效率仅为１５ｍｉｎ时的１６％，差异显著。所以，最佳的农杆菌
浸染时间为１５ｍｉｎ。
图１　农杆菌介导的柱花草遗传转化及植株再生
犉犻犵．１　犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿犿犲犱犻犪狋犲犱狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狋犻狅狀狅犳狊狋狔犾狅犪狀犱狉犲犵犲狀犲狉犪狋犻狅狀狅犳狋犺犲狋狉犪狀狊犳狅狉犿犲犱狆犾犪狀狋犾犲狋
　Ａ：共培养时期；Ｂ：恢复培养时期；Ｃ：抗性愈伤组织的诱导；Ｄ：抗性愈伤的分化；Ｅ：壮芽；Ｆ：抗性芽生长；Ｇ：抗性苗生根；Ｈ：抗性苗移栽；标尺为１
ｃｍ。Ａ：Ｃｏｃｕｌｔｕｒｅｄｕｒａｔｉｏｎ；Ｂ：Ｒｅｃｏｖｅｒｙｔｒａｉｎｉｎｇｐｅｒｉｏｄ；Ｃ：Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｒｅｓｉｓｔａｎｔｃａｌｕｓ；Ｄ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｒｅｓｉｓｔａｎｔｃａｌｕｓ；Ｅ：Ｇｒｏｗｔｈｏｆｒｅ
ｓｉｓｔａｎｔｓｈｏｏｔｓＦ：Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｏｆｒｅｓｉｓｔａｎｔｓｈｏｏｔｓ；Ｇ：Ｒｏｏｔｉｎｇｏｆｒｅｓｉｓｔａｎｔｐｌａｎｔｌｅｔｓ；Ｈ：Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄｐｌａｎｔｌｅｔｓ；Ｂａｒ＝１ｃｍ．
　
图２　不同农杆菌浸染条件对转化效率的影响
犉犻犵．２　犉犪犮狋狅狉狊犪犳犳犲犮狋犻狀犵狋犺犲狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狋犻狅狀犲犳犳犻犮犻犲狀犮犻犲狊狅犳狊狋狔犾狅
　Ａ：农杆菌菌液浓度；Ｂ：浸染时间；Ｃ：共培养时间。Ａ：犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；Ｂ：Ｉｎｆｅｃｔｅｄｔｉｍｅ；Ｃ：Ｃｏｃｕｌｔｕｒｅｄｕｒａｔｉｏｎ．不同字母表示差
异显著（犘＜０．０５）。Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｔｔｅｒｓｉｎｄｉｃａｔｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（犘＜０．０５）．　
共培养时间显著影响愈伤组织的转化效率。图２Ｃ结果表明，随着共培养时间的延长，愈伤组织的转化效率
有显著增加的趋势，当共培养时间为３ｄ时，愈伤组织转化效率最高，为７２％，转化效率分别为共培养１和２ｄ时
的２．７和１．３倍；但是，随着共培养时间继续延长，愈伤组织转化效率降低，共培养４ｄ时的转化效率仅为３ｄ时
５０１第２５卷第６期 草业学报２０１６年
的６１％，且愈伤组织周围有大量农杆菌形成，影响后
图３　转化材料犌犝犛染色分析
犉犻犵．３　犌犝犛狊狋犪犻狀犻狀犵犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮犿犪狋犲狉犻犪犾
　　　Ａ：下胚轴外植体愈伤组织，标尺＝１００μｍ；Ｂ：抗性芽，标尺＝１００
μｍ；Ｃ：根染ＧＵＳ，标尺＝１ｃｍ；Ｄ：转化植株，标尺＝１ｃｍ。Ａ：Ｃａｌｕｓｉｎ
ｄｕｃｅｄｆｒｏｍｈｙｐｏｃｏｔｙｌ，Ｂａｒ＝１００μｍ；Ｂ：Ｒｅｓｉｓｔａｎｔｓｈｏｏｔｓｉｎｄｕｃｅｄｆｒｏｍ
ｃａｌｕｓ，Ｂａｒ＝１００μｍ；Ｃ：ＲｏｏｔｄｙｅｉｎｇＧＵＳ，Ｂａｒ＝１ｃｍ；Ｄ：Ｐｕｔａｔｉｖｅ
ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔ，Ｂａｒ＝１ｃｍ．
图４　转基因抗性植株犘犆犚检测
犉犻犵．４　犘犆犚犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狆狌狋犪狋犻狏犲狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狆犾犪狀狋
　　　Ｍ：Ｍａｒｋ；＋：阳性对照（质粒）；－：阴性对照（野生型植株）；１～３：转
基因抗性植株。Ｍ：Ｍａｒｋ；＋：Ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ（ｐｌａｓｍｉｄ）；－：Ｎｅｇａ
ｔｉｖｅ（ｗｉｌｄｔｙｐｅｐｌａｎｔ）；１－３：Ｔｈｒｅｅｐｕｔａｔｉｖｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔ．
期愈伤组织生长。所以，最佳的共培养时间为３ｄ。
２．３　转化材料ＧＵＳ检测
柱花草下胚轴根据上述优化后的农杆菌转化条件
进行处理，并经共培养和恢复培养、抗性愈伤组织诱导
培养、抗性芽生长、生根和抗性苗移栽后，获得可能的
转基因植株（图１）。对不同阶段的组织进行ＧＵＳ染
色分析，结果表明，处于筛选阶段的愈伤组织经ＧＵＳ
染色后呈现出蓝色，表明犌犝犛基因已成功在愈伤组织
中表达（图３Ａ）；具有抗性的愈伤组织经过芽诱导后，
ＧＵＳ染色呈现蓝色，表明犌犝犛基因在抗性芽中表达
（图３Ｂ）；抗性芽经生根和炼苗后，转化植株和根的
ＧＵＳ染色呈现蓝色，表明犌犝犛基因已稳定的在柱花
草植株中表达（图３Ｃ，Ｄ）。
２．４　转基因植株的ＰＣＲ检测
本研究进一步对转化后的再生植株在基因组水平
上进行ＰＣＲ检测。我们从１２株移栽的抗性植株随机
挑选３株并提取其叶片基因组ＤＮＡ，通过ＰＣＲ反应
扩增犌犝犛基因。结果表明，随机挑选的３株转化植株
都能成功的扩增出５６３ｂｐ的目的片段（图４，１－３泳
道），而野生型柱花草（－）则未能扩增出目的条带。结
果进一步证明了犌犝犛基因已成功的整合到柱花草基
因组中。
３　讨论
根癌农杆菌介导的遗传转化已成为作物遗传转化
的主要途径之一，并可对植物性状进行定向的遗传改
良［２０２１］。在柱花草遗传转化研究中，国外对其组织再
生和遗传转化方法进行了相关分析［５，１２１３，１５］，国内就王
冬梅等［２２］从农杆菌浸染条件之农杆菌菌液浓度方面
进行研究的相关报道。由于农杆菌介导的遗传转化效
率受植物种类和农杆菌浸染条件等因素影响，因此，本
研究主要从农杆菌浸染条件方面对柱花草遗传转化条件进行摸索和优化，结合ＧＵＳ染色和ＰＣＲ分析来鉴定转
基因柱花草植株。
农杆菌能否有效地附着并浸染外植体是遗传转化成功与否的关键。对农杆菌介导的紫花苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅
狊犪狋犻狏犪）遗传转化条件进行摸索，包括农杆菌菌液浓度，浸染时间和共培养时间等，结果表明最佳的转化条件为农
杆菌菌液浓度ＯＤ６００在０．３～０．５间，浸染时间为１０～１５ｍｉｎ，共培养时间为３ｄ，转化效率高达７２％［２０］。在百脉
根（犔狅狋狌狊犮狅狉狀犻犮狌犾犪狋狌狊），研究发现当农杆菌浓度ＯＤ６００在０．５左右，浸染２０ｍｉｎ和共培养３ｄ的条件下，百脉根
遗传转化效率为５０％［２１］。在本研究中，我们发现当农杆菌菌液ＯＤ６００为０．４～０．６时，浸染１５ｍｉｎ和共培养３ｄ
的条件下，可获得较高的柱花草愈伤组织转化效率（约７２％），即为最适的农杆菌转化条件，过低或过高的菌液浓
度、浸染时间和共培养时间都对转化效率和愈伤组织生长产生不利影响（图２）。这与上述紫花苜蓿和百脉根转
化条件中的最适农杆菌菌液浓度和共培养时间相符，但与百脉根的浸染时间不一致，其可能是由于不同外植体材
６０１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．６
料受农杆菌浸染的敏感性不同。
柱花草的遗传转化始于１９８７年，Ｍａｎｎｅｒｓ［１２］以犛．犺狌犿犻犾犻狊为材料，将农杆菌悬浮液浸泡外植体２～５ｍｉｎ，
共培养２ｄ，植株转化效率约为０．３％。王冬梅等［２２］以热研二号为材料，将预培养２ｄ的外植体，用经１０μｍｏｌ／Ｌ
乙酰丁香酮预处理ＯＤ值为１．５的农杆菌和稀释５倍番木瓜浸提液一起，采用农杆菌抽真空浸入法转化柱花草，
在加１．５ｍｇ／Ｌ脯氨酸的共培养基上共培养，芽的转化率可达２０％。本研究在前人研究的基础上通过对农杆菌
浸染条件进行摸索后，使得柱花草的愈伤转化效率高达７２％，建立和优化了柱花草遗传转化体系，获得转基因柱
花草。本研究结果对柱花草遗传转化和关键基因功能研究提供了可靠的依据，并为柱花草的遗传改良奠定了基
础。
犚犲犳犲狉犲狀犮犲狊：
［１］　ＬｉｕＧＤ，ＰｈａｉｋａｅｗＣ，ＳｔｕｒＷ Ｗ．犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｉｎＣｈｉｎａａｎｄｓｏｕｔｈｅａｓｔＡｓｉａ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｒｏｐｉｃａｌ
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犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊（Ａｕｂｌ．）Ｓｗ．ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＲｅｓｅａｒｃｈ，２００２，２５（１）：７３８０．
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ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１５，２４（５）：１７５１８１．
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ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＢｕｌｅｔｉｎ，２０１２，２８（３６）：７１７５．
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犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｃｉｅｎｔｉａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａＳｉｎｉｃａ，２０１１，４４（１０）：１９８９１９９６．
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ｈａｎｃｅｓｔｈｅ犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿ｍｅｄｉａｔｅｄｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎｉｎｄｉａｎｓｏｙｂｅａｎｃｕｌｔｉｖａｒｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄ
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［１２］　ＭａｎｎｅｒｓＪＭ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｏｆｔｈｅｔｒｏｐｉｃａｌｐａｓｔｕｒｅｌｅｇｕｍｅ犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊犺狌犿犻犾犻狊．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ，１９８８，５５：６１
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犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狉犺犻狕狅犵犲狀犲狊ａｎｄａＴｉｐｌａｓｍｉｄｂｉｎａｒｙｖｅｃｔｏｒｓｙｓｔｅｍ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｌａｎｔＣｅｌＲｅｐｏｒｔｓ，１９８９，８：３４１３４５．
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ｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ，１９９４，９６：１１９１２７．
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ｔｉｏｎｗｉｔｈｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊ｓｐｐ．ａｓａｆｅｅｄｓｔｕｆｆａｄｄｉｔｉｖｅ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＲｅｓｅａｒｃｈ，２００８，１７（６）：１１６３１１７０．
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ｃｈｉｌｉｎｇｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃｏａｎｄｓｔｙｌｏｐｌａｎｔｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｌａｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＪｏｕｒｎａｌ，２０１６，１（１４）：１９．
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［１８］　ＴｉｐｐａｎｉＲ，ＹａｒｒａＲ，ＢｕｌｅＭ，犲狋犪犾．Ｉｎｖｉｔｒｏｐｌａｎｔｌｅｔｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎａｎｄ犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊ｍｅｄｉａｔｅｄｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒ
ｍａｔｉｏｎｏｆＩｎｄｉａｎＫｉｎｏｔｒｅｅ（犘狋犲狉狅犮犪狉狆狌狊犿犪狉狊狌狆犻狌犿 Ｒｏｘｂ．）．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｃｔａＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉａｅＰｌａｎｔａｒｕｍ，２０１３，３５：３４３７
３４４６．
［１９］　ＪｅｆｆｅｒｓｏｎＲＡ．Ａｓｓａｙｉｎｇｃｈｉｍｅｒｉｃｇｅｎｅｓｉｎｐｌａｎｔｓ：ｔｈｅＧＵＳｇｅｎｅｆｕｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｐｏｒｔｅｒ，
１９８７，５：３８７４０５．
［２０］　ＬｉｕＪＬ，ＺｈａｎｇＺＬ，ＷｕＹＭ，犲狋犪犾．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆａｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔ犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿ｍｅｄｉａｔｅｄｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｏｆ
犔狅狋狌狊犮狅狉狀犻犮狌犾犪狋狌狊．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２００６，１５（３）：１２８１３１．
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８０１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．６