全 文 ：书犇犗犐：１０．１１６８６／犮狔狓犫２０１５０５１ 犺狋狋狆：／／犮狔狓犫．犾狕狌．犲犱狌．犮狀
拓宁，张君，邱慧珍，张文明，张春红，刘星，朱静．立枯丝核菌对马铃薯侵染过程的显微结构观察与胞壁降解酶活性的测定．草业学报，２０１５，
２４（１２）：７４８２．
ＴＵＯＮｉｎｇ，ＺＨＡＮＧＪｕｎ，ＱＩＵＨｕｉＺｈｅｎ，ＺＨＡＮＧＷｅｎＭｉｎｇ，ＺＨＡＮＧＣｈｕｎＨｏｎｇ，ＬＩＵＸｉｎｇ，ＺＨＵＪｉｎｇ．Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆ犚犺犻狕狅犮狋狅狀犻犪
狊狅犾犪狀犻ｐｏｔａｔｏｂｌｉｇｈｔⅠ Ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓａｎｄｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆｃｅｌｗａｌｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙ．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕ
ｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１５，２４（１２）：７４８２．
立枯丝核菌对马铃薯侵染过程的显微结构
观察与胞壁降解酶活性的测定
拓宁１，２，张君１，２，邱慧珍１，２，张文明１，２，张春红１，２，刘星１，２，朱静１，２
（１．甘肃农业大学资源与环境学院，甘肃 兰州７３００７０；２．甘肃省干旱生境作物学重点实验室，甘肃 兰州７３００７０）
摘要：由立枯丝核菌引起的马铃薯茎溃疡病（黑痣病）已成为限制甘肃省马铃薯产业健康发展的主要土传病害之
一。本研究在盆栽试验条件下将病原菌接种于马铃薯植株的茎基部，显微观察侵染过程，并测定了胞壁降解酶活
性的变化。结果表明，土壤中接种病原菌后，马铃薯侵染顺序依次为：芽－茎－根－匍匐茎－块茎；接菌１２ｈ后菌
丝开始附着寄主表面，３６ｈ后形成附着胞，４８ｈ后形成侵染垫；电镜下可见，细胞壁变形、断裂，细胞膜破损，质体结
构变形，细胞质溶解和质壁分离等；纤维素酶（Ｃｘ）、多聚半乳糖醛酸酶（ＰＧ）和果胶甲基半乳糖醛酸酶（ＰＭＧ）的活
性高达１．７，２．９和３．１μｇ／（ｈ·ｇ），显著高于对照，尤其是ＰＧ和ＰＭＧ的活性，为对照的两倍。这些酶活性的提高
可能与组织坏死有关。
关键词：立枯丝核菌；侵染过程；超微结构；透射电镜；胞壁降解酶　　
犘犪狋犺狅犵犲狀犻犮犿犲犮犺犪狀犻狊犿狅犳犚犺犻狕狅犮狋狅狀犻犪狊狅犾犪狀犻狆狅狋犪狋狅犫犾犻犵犺狋Ⅰ犕犻犮狉狅狊狋狉狌犮狋狌狉犲狅犫狊犲狉狏犪狋犻狅狀
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ＴＵＯＮｉｎｇ１，２，ＺＨＡＮＧＪｕｎ１，２，ＱＩＵＨｕｉＺｈｅｎ１，２，ＺＨＡＮＧＷｅｎＭｉｎｇ１，２，ＺＨＡＮＧＣｈｕｎＨｏｎｇ１，２，
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１．犆狅犾犾犲犵犲狅犳犚犲狊狅狌狉犮犲狊犪狀犱犈狀狏犻狉狅狀犿犲狀狋犪犾犛犮犻犲狀犮犲狊，犌犪狀狊狌犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犔犪狀狕犺狅狌７３００７０，犆犺犻狀犪；２．犌犪狀狊狌犘狉狅狏犻狀犮犻犪犾
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ｄｉｓｅａｓｅｓｗｈｉｃｈｌｉｍｉｔｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｔｈｅｐｏｔａｔｏｉｎｄｕｓｔｒｙｉｎＧａｎｓｕｐｒｏｖｉｎｃｅ．Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，犚．狊狅犾犪狀犻ｓｐｏｒｅｓ
ｗｅｒｅｉｎｏｃｕｌａｔｅｄｏｎｔｏｔｈｅｓｔｅｍｂａｓｅｏｆｐｏｔａｔｏｐｌａｎｔｓｇｒｏｗｎｉｎｐｏｔｓ．Ｔｈｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓａｎｄａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｐｏｔａｔｏ
ｃｅｌｗａｌｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｓｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄａｎｄｍｅａｓｕｒｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓ
ｂｕｄ，ｓｔｅｍ，ｒｏｏｔ，ｓｔｏｌｏｎａｎｄｌａｓｔｌｙｔｕｂｅｒ．Ｈｙｐｈａｅａｔｔａｃｈｅｄｔｏｔｈｅｓｕｒｆａｃｅｏｆｔｈｅｈｏｓｔｗｉｔｈｉｎ１２ｈ，ａｐｐｒｅｓｓｏｒｉａ
ｆｏｒｍｅｄｉｎ３６ｈ，ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｃｕｓｈｉｏｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎ４８ｈ．Ｄｅｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｆｒａｃｔｕｒｅｏｆｔｈｅｃｅｌｗａｌ，ｄａｍａｇｅｔｏｔｈｅｃｅｌ
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ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｃｅｌｕｌａｓｅ（Ｃｘ），ｐｏｌｙｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅ（ＰＧ）ａｎｄｐｏｌｙｍｅｔｈｙｌｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅ（ＰＭＧ）ｗｅｒｅ１．７，２．９ａｎｄ
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第２４卷　第１２期
Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．１２
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
２０１５年１２月
Ｄｅｃ，２０１５
收稿日期：２０１５０１２７；改回日期：２０１５０３１８
基金项目：国家自然科学基金（３１３６０５００），国家公益性行业（农业）科研专项（２０１１０３００４）和国家科技支撑计划项目（２０１２ＢＡＤ０６Ｂ０３）资助。
作者简介：拓宁（１９８９），女，甘肃兰州人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：ｔｕｏｎｉｎｇ１９８９＠１２６．ｃｏｍ
通信作者Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ．Ｅｍａｉｌ：ｈｚｑｉｕ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆＰＧａｎｄＰＭＧｗｅｒｅａｓｔｗｉｃｅｔｈｏｓｅｏｆｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｍａｙｂｅｒｅｌａｔ
ｅｄｔｏｔｉｓｓｕｅｎｅｃｒｏｓｉｓ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犚犺犻狕狅犮狋狅狀犻犪狊狅犾犪狀犻；ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓ；ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ；ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ｃｅｌｗａｌ
ｄｅｇｒａｄｉｎｇｅｎｚｙｍｅｓ
马铃薯（犛狅犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿）是位居小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿）、水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）和玉米（犣犲犪犿犪狔狊）之后
的第四大粮食作物［１］，近年种植面积和产量持续增长，已成为调整中国种植业结构和农民增收的主要粮食作物之
一［２］。甘肃省以其独特的土壤和气候特点成为我国重要的马铃薯种薯和商品薯基地以及淀粉加工基地，马铃薯
生产已成为带动全省农业和农村经济发展，促进农业增效，农民增收的战略性主导产业，在保障我省粮食安全和
主产区农民收入方面发挥着十分重要的作用［３６］。而近年来马铃薯真菌病害的普遍发生，已成为马铃薯产业健康
发展的主要限制因子［４５，７８］，尤其是由立枯丝核菌（犚犺犻狕狅犮狋狅狀犻犪狊狅犾犪狀犻）侵染引起的马铃薯茎溃疡病，发病日趋严
重，对马铃薯块茎产量、商品价值和马铃薯产业的可持续发展产生了极大影响［９１１］。因此，探明马铃薯立枯丝核
菌的致病机理对病害的有效防控具有十分重要的意义。
由立枯丝核菌引起的马铃薯茎溃疡病（又称茎基腐病、黑痣病、丝核菌溃疡病和黑色粗皮病）是一种真菌性病
害，以带病种薯和土壤为主要传播途径［１２１３］。主要危害幼芽、茎基部、匍匐茎和薯块［１４１７］。田间发病的马铃薯植
株最直观的症状表现为茎溃疡和茎基部隘缩，感病植株的块茎表现黑痣。由于立枯丝核菌可侵染马铃薯不同部
位引起多种症状，病理和生理机制可能非常复杂，所以已有的研究主要集中在立枯丝核菌融合群鉴定［７］、生物学
特性［１８］以及病害的防治技术等方面［１９２０］，而对病原菌致病机理的研究鲜有报道。
水稻立枯丝核菌的研究指出，胞壁降解酶的产生是水稻立枯丝核病菌重要的致病因子之一，人工培养产生的
胞壁降解酶能引起水稻叶鞘细胞膜透性改变和组织浸解，可损伤组织结构，使细胞壁断裂，细胞器变形等，在病斑
形成和扩展中起重要作用［２１２２］。另有研究指出，果胶酶是水稻立枯丝核菌的致病因子，病菌产生果胶酶和纤维素
酶的量与致病性密切相关［２３］。
为此，我们通过接种病原菌，利用透射电镜技术，结合植株形态组织学研究的方法，观察立枯丝核菌侵染马铃
薯芽和茎等器官的发病进程和侵染结构的形成过程以及立枯丝核菌对马铃薯茎基部组织和细胞的破坏作用，同
时测定茎基部组织胞壁降解酶的活性，旨在探明马铃薯立枯丝核菌可能的致病机理，以及病原菌胞壁降解酶的产
生与寄主植物的组织和细胞遭受破坏作用之间的关系，为马铃薯茎溃疡病的防控提供基础。
１　材料与方法
１．１　试验设计
盆栽试验于２０１４年４－９月在甘肃农业大学网室进行，设２个处理：对照，空白不接菌的ＰＤＢ培养基；处理，
接入病原菌的ＰＤＢ培养基，将病原菌按０．５ｇ／ｋｇ的量均匀拌入灭菌土壤中。采用２０ｃｍ×２５ｃｍ陶土盆，每盆
装土９ｋｇ，每盆种植４株，每处理种２０盆，共８０次重复。
供试品种：马铃薯“大西洋”，由甘肃省景泰县条山农场提供；供试菌株：马铃薯立枯丝核菌（犚．狊狅犾犪狀犻）ＪＴ１８，
由本课题组提供。供试土壤：采自景泰条山农场。
１．２　病原菌和供试土壤的准备
将立枯丝核菌菌饼（直径９ｍｍ）接种于ＰＤＢ培养基中，于２５℃ 黑暗培养３ｄ，用无菌纱布过滤菌丝，自然晒
干称重后豆浆机打碎备用。
土壤进行高压灭菌，１２１℃灭菌３０ｍｉｎ，取出后晾２ｈ，进行第２次灭菌，方法同上，之后自然晾干备用。
１．３　样品采集与处理
分别在苗期取样５次（播种后２３，２６，２９，３２，３５ｄ），现蕾期取样１次（５０ｄ），盛花期１次（６５ｄ），每处理随机取
样６株，带回实验室后取处理茎基部发病组织１ｇ用于测定胞壁降解酶，设３次重复。
于播种３０ｄ后取对照健康幼苗茎基部，用无菌水冲洗３遍后，剪成３ｃｍ的小段，放在盛有０．８％的５００ｍＬ
５７第１２期 拓宁　等：立枯丝核菌对马铃薯侵染过程的显微结构观察与胞壁降解酶活性的测定
水琼脂的盘中，将在ＰＤＡ培养基上培养３ｄ的病原菌菌饼（０．９ｍｍ）接种于茎段上，每茎段接种一个菌饼，设６
次重复。２５℃黑暗离体培养，用于观察立枯丝核菌侵染结构。
于播种后３５，５０和６５ｄ取对照茎基部健康组织与处理茎基部发病组织，无菌水洗涤３遍后切成１ｍｍ３ 大小
的组织块，３％的戊二醛４℃下固定备用，用于观察立枯丝核菌对马铃薯组织和细胞破坏作用的超微结构变化。
试验设３次重复。
每次取样后观察马铃薯形态特征，记录病情指数与发病进程。
１．４　立枯丝核菌对马铃薯侵染过程的观察
将播种３０ｄ后离体接种培养的马铃薯地下茎分别于接种后４，８，１２，２４，３６，４８ｈ取样，从菌片边缘横切制
片。以不接菌的健康马铃薯苗为对照。将切片用９５％酒精和冰醋酸等量混合固定５ｍｉｎ，然后用０．０５％的棉兰
染液染色２０ｍｉｎ，在光学显微镜下观察并拍照［２４］。
１．５　立枯丝核菌对马铃薯组织和细胞的破坏作用
分别取已处理好对照茎基部健康组织与处理发病组织，经３％的戊二醛４℃下固定后，系列丙酮脱水，
Ｅｐｏｉｎ８１２树胶包埋，切片染色后用ＪＥＭ１２３０型透射电镜观察［２５２６］。
１．６　立枯丝核菌对马铃薯茎基部胞壁降解酶活性的影响
１．６．１　胞壁降解酶的提取　　参照陈夕军等［２１］的方法，在样品中加入５ｍＬ０．２５ｍｏｌ／Ｌ氯化钠提取液，适量石
英砂冰浴研磨。过滤后４℃下１５０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，取上清液（粗酶液）备用。
１．６．２　胞壁降解酶的纯化　　取上述提取的粗酶液，加入硫酸铵至６０％饱和度，４℃下静置５ｈ后，１５００ｒ／ｍｉｎ
离心２０ｍｉｎ，弃上清液。用５０ｍｍｏｌ／Ｌ醋酸－醋酸钠缓冲液（ｐＨ５．０）溶解沉淀，并在该缓冲液中于４℃ 下透析
２ｄ，每１２ｈ换１次透析液，纯化的酶保存在－１８℃下备用。
１．６．３　胞壁降解酶的测定　　采用紫外—可见光分光光度法测定胞壁降解酶的活性。取上述粗酶液，分别加入
纤维素酶Ｃｘ（Ｂ１，４内切葡聚糖酶），果胶酶ＰＧ（多聚半乳糖醛酸酶）和ＰＭＧ（果胶甲基半乳糖醛酸酶）的反应底
物，利用ＤＮＳ法在５４０ｎｍ处测定ＯＤ值，分别计算活性。酶活单位用每ｈ每ｇ样品在５０℃催化底物生成半乳
糖醛酸的质量表示（即μｇ／ｈ·ｇ）
［２７］。
１．７　数据处理
用ＳＰＳＳ２１．０软件对试验数据进行统计分析，同一时间不同处理的数据采用Ｄｕｎｃａｎ法完成；图表绘制在
ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ２００７软件上进行。
２　结果与分析
２．１　马铃薯立枯丝核菌的侵染过程
２．１．１　马铃薯茎溃疡病发病进程　　于播种１０ｄ后开始取样，观察到马铃薯茎溃疡病的整个发病进程：马铃薯
播种后１０ｄ开始发育芽，２０ｄ后芽上出现褐色病斑，该部位生长点坏死，不再继续生长。感病重者幼芽腐烂死
亡，形成芽腐，（图１１，１２）。播种３０ｄ后马铃薯全部出苗，茎开始发育，３５ｄ后在茎基部观察到褐色病斑（茎溃
疡），感病重者可造成立枯（图１３，１４）。４０ｄ后根系黑褐色菌核或褐色溃疡，重者腐烂死亡（图１５），此时匍匐茎
开始发育。５０ｄ后在匍匐茎上可观察到黑褐色病斑，病斑处不再发育，顶端不能膨大，不再形成薯块（图１６）。
６０ｄ后开始形成薯块，处理较对照薯块体积小，数量少。７５ｄ后在薯块上可观察到少量黑痣，为黑褐色菌核（图
１７）。９０ｄ后收获时，在处理盆栽中发现，成熟块茎的感病程度不同，轻者表面形成的黑痣量较少，重者形成大量
菌核，其大小形状不规则，呈土壤颗粒状，且不易被冲洗掉，而菌核下边的组织完好（图１８，１９）。观察中统计接
种病原菌后植株发病率为７２．５％，有黑痣的块茎占总块茎数的６９．２％。结果表明，立枯丝核菌对马铃薯的侵染
随着各器官的发育而发展，侵染顺序依次为：芽－茎－根－匍匐茎－块茎。
２．１．２　马铃薯立枯丝核菌侵染结构的形成　　取播种３０ｄ后的对照健康马铃薯茎基部离体培养，观察其显微
结构，发现接菌４ｈ后，在培养基表面即可看到菌丝开始沿着茎段表面生长，但显微结构显示尚未看到菌丝（图２
１）。１２ｈ后，在寄主表面可看到菌丝开始附着生长（图２２），２４ｈ后附着菌丝少量结合在一起，开始轻度缠绕，３６
６７ 草　业　学　报 第２４卷
ｈ后菌丝顶端开始膨大变粗，分枝增多，分枝再分裂出许多粗短的侧枝，开始形成附着胞的雏形。至４８ｈ后，形
成侵染结构，菌丝继续分枝，顶端膨大，分枝再不断分出许多短粗的侧枝，侧枝顶端膨大形成附着胞。菌丝分枝间
相互交错，缠绕，逐渐形成网状结构（图２３），随后，网状结构生出的侧枝紧密结合在一起，聚集成团，形成侵染垫
（图２４）。侵染垫紧贴在寄主表面，呈椭圆形。
图１　马铃薯茎溃疡病发病进程
犉犻犵．１　犜犺犲狆狉狅犵狉犲狊狊犻狅狀狅犳狆狅狋犪狋狅犚．狊狅犾犪狀犻犱犻狊犲犪狊犲
　１：播种２０ｄ后对照马铃薯芽；２：播种２０ｄ后处理马铃薯芽，出现病
斑；３：播种３５ｄ后对照马铃薯茎；４：播种３５ｄ后处理马铃薯茎，出现病
斑；５：播种４０ｄ后处理马铃薯根出现褐色溃疡斑；６：播种５０ｄ后处理
马铃薯匍匐茎出现病斑；７：播种７５ｄ后处理马铃薯形成少量黑痣；８：播
种９０ｄ后形成的少量黑痣；９：播种９０ｄ后形成的大量黑痣。１：Ｃｏｎ
ｔｒｏｌｐｏｔａｔｏｂｕｄｓａｆｔｅｒｓｅｅｄｉｎｇ２０ｄ；２：Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｐｏｔａｔｏｂｕｄｓｓｈｏｗ
ｓｃａｂａｆｔｅｒｓｅｅｄｉｎｇ２０ｄ；３：Ｃｏｎｔｒｏｌｐｏｔａｔｏｓｔｅｍｓａｆｔｅｒｓｅｅｄｉｎｇ３５ｄ；４：
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｐｏｔａｔｏｓｔｅｍｓｓｈｏｗｓｃａｂａｆｔｅｒｓｅｅｄｉｎｇ３５ｄ；５：Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
ｐｏｔａｔｏｒｏｏｔｓｓｈｏｗｂｒｏｗｎｕｌｃｅｒａｔｉｏｎａｆｔｅｒｓｅｅｄｉｎｇ４０ｄ；６：Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
ｐｏｔａｔｏｓｔｏｌｏｎｓｓｈｏｗｓｃａｂａｆｔｅｒｓｅｅｄｉｎｇ５０ｄ；７：Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｐｏｔａｔｏｔｕ
ｂｅｒｓｓｈｏｗｌｉｔｔｌｅｂｌａｃｋｓｃｕｒｆａｆｔｅｒｓｅｅｄｉｎｇ７５ｄ；８：Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｐｏｔａｔｏｔｕ
ｂｅｒｓｓｈｏｗｌｉｔｔｌｅｂｌａｃｋｓｃｕｒｆａｆｔｅｒｓｅｅｄｉｎｇ９０ｄ；９：Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｐｏｔａｔｏｔｕ
ｂｅｒｓｓｈｏｗｍｏｒｅｂｌａｃｋｓｃｕｒｆａｆｔｅｒｓｅｅｄｉｎｇ９０ｄ．
图２　马铃薯立枯丝核菌侵染结构的形成
犉犻犵．２　犘狅狋犪狋狅犚．狊狅犾犪狀犻犱犻狊犲犪狊犲犳狅狉犿犻狀犳犲犮狋犻狅狀狊狋狉狌犮狋狌狉犲
　１：接菌４ｈ后组织结构清晰可见（×１００）；２：接菌１２ｈ后可见少量菌
丝附着（×１００）；３：接菌４８ｈ后形成附着胞，菌丝形成网状结构（×
１００）；４：网状结构形成侵染垫（×１００）。１：Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｉｓ
ｃｌｅａｒｌｙｖｉｓｉｂｌｅａｆｔｅｒｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ４ｈ（×１００）；２：Ｆｅｗｈｙｐｈａｅｗｅｒｅａｔｔａ
ｃｈｅｄａｆｔｅｒｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ１２ｈ （×１００）；３：Ａｐｐｒｅｓｓｏｒｉａｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄ
ｈｙｐｈａｅａｍｅｓｈｓｔｒｕｃｔｕｒｅ４８ｈａｆｔｅｒｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ（×１００）；４：Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ
ｃｕｓｈｉｏｎｓｆｏｒｍｅｄ（×１００）．
２．２　立枯丝核菌对马铃薯组织和细胞的破坏作用
透射电镜的结果显示在菌丝侵入前，细胞结构清晰可见，细胞壁，质膜完整光滑，核质丰富。质体（主要为造
粉体）与线粒体等细胞器紧靠细胞壁排列，形态规则正常。菌丝侵入后马铃薯茎基部细胞发生了明显的变化。播
种后３５ｄ电镜结果显示细胞壁缝隙增大，细胞壁变形，粗细不均（图３１，３２），菌丝可穿透淀粉粒，淀粉粒体积变
大，数量增多（图３３，３４），并挤压细胞核，使核缢缩（图３５）；播种后５０ｄ结果显示对细胞器造成了影响，质体结
构变形，片层结构消失（图３６，３７），同时细胞壁断裂，细胞膜破损（图３８）；播种后６５ｄ结果显示，细胞质溶解，
质壁分离，细胞器离壁，结构松散（图３９）。
７７第１２期 拓宁　等：立枯丝核菌对马铃薯侵染过程的显微结构观察与胞壁降解酶活性的测定
图３　立枯丝核菌对马铃薯组织和细胞的破坏作用
犉犻犵．３　犇犲狊狋狉狌犮狋犻狏犲犲犳犳犲犮狋狊狅犳犚．狊狅犾犪狀犻狅狀狋犻狊狊狌犲犪狀犱犮犲犾
　１：对照马铃薯细胞壁膜完整（×２００００）；２：处理马铃薯细胞壁变形
（×２００００）；３：对照马铃薯淀粉粒（×５０００）；４：处理马铃薯淀粉粒，数量
增多，体积变大（×５０００）；５：菌丝穿透淀粉粒，并挤压细胞核（×
１００００）；６：对照马铃薯质体片层结构清晰（×１００００）；７：处理马铃薯质
体变形，片层结构消失（×１５０００）；８：对照马铃薯细胞膜破损（×
１００００）；９：处理马铃薯细胞质溶解，质壁分离（×５０００）。１：Ｔｈｅｎｏｒｍａｌ
ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｃｅｌ ｍｅｍｂｒａｎｅｉｎｃｏｎｔｒｏｌｐｏｔａｔｏ（×２００００）；２：Ｄｅｆｏｒｍａ
ｔｉｏｎｏｆｐｏｔａｔｏｃｅｌｗａｌｉｎｔｒｅａｔｍｅｎｔｐｏｔａｔｏ（×２００００）；３：Ｓｔａｒｃｈｇｒａｉｎｓ
ｉｎｃｏｎｔｒｏｌｐｏｔａｔｏ（×５０００）；４：Ｍｏｒｅａｎｄｂｉｇｇｅｒｓｔａｒｃｈｇｒａｉｎｓｉｎｔｒｅａｔ
ｍｅｎｔｐｏｔａｔｏ（×５０００）；５：Ｈｙｐｈａｅｐｅｎｅｔｒａｔｅｓｔａｒｃｈｇｒａｉｎｓａｎｄｓｑｕａｓｈ
ｎｕｃｌｅａｒ（×１００００）；６：Ｐｌａｓｔｉｄｌａｍｅｌａｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅｉｓｄｉｓｔｉｎｃｔｉｎｃｏｎｔｒｏｌ
ｐｏｔａｔｏ（×１００００）；７：Ｐｌａｓｔｉｄｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｄｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｌａｍｅｌａｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
ｄｉｓａｐｐｅａｒａｎｃｅｉｎｔｒｅａｔｍｅｎｔｐｏｔａｔｏ（×１５０００）；８：Ｃｅｌｍｅｍｂｒａｎｅｓｄａｍ
ａｇｅｉｎｔｒｅａｔｍｅｎｔｐｏｔａｔｏ（×１００００）；９：Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎａｎｄｐｌａｓ
ｍｏｌｙｓｉｓ（×５０００）．
２．３　立枯丝核菌对马铃薯茎基部胞壁降解酶活性的
图４　不同时期纤维素酶（犆狓）活性变化
犉犻犵．４　犆犪狉犫狅狓狔犿犲狋犺狔犾犮犲犾狌犾狅狊犲（犆狓）犪犮狋犻狏犻狋狔
犮犺犪狀犵犲狊犪狋犱犻犳犳犲狉犲狀狋狊狋犪犵犲狊
　　　不同字母表示０．０５水平的差异显著性，下同。Ｄｉｆｅｒｅｎｔｌｅｔｔｅｒｓｉｎｄｉｃａｔｅ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓａｔ５％ｌｅｖｅｌ，ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ．
影响
试验结果表明，处理马铃薯茎基部组织的两种果
胶酶，多聚半乳糖醛酸酶（ＰＧ）、果胶甲基半乳糖醛酸
酶（ＰＭＧ）和纤维素酶（Ｃｘ）的活性均高于对照。
２．３．１　立枯丝核菌对纤维素酶活性的影响　　如图
４所示，处理马铃薯在播种后２３ｄ酶活性达到最高峰，
达到１．７μｇ／（ｈ·ｇ），显著高于对照，至播种后５０ｄ，
酶活性略有下降，但始终与对照差异显著。
２．３．２　立枯丝核菌对果胶酶活性的影响　　ＰＧ活
性测定结果如图５所示，测定时期内处理活性始终显
著高于对照。播种２３ｄ后酶活性最高，达到２．９μｇ／
（ｈ·ｇ），高于对照１４１．６７％。略下降后又呈上升趋
势，在３２ｄ时上升到第２个活性高峰，达到２．６μｇ／
（ｈ·ｇ），之后呈下降趋势。
图５　不同时期多聚半乳糖醛酸酶（犘犌）活性变化
犉犻犵．５　犘狅犾狔犵犪犾犪犮狋狌狉狅狀犪狊犲（犘犌）犪犮狋犻狏犻狋狔
犮犺犪狀犵犲狊犪狋犱犻犳犳犲狉犲狀狋狊狋犪犵犲狊
　
图６　不同时期果胶甲基半乳糖醛酸酶（犘犕犌）活性变化
犉犻犵．６　犘狅犾狔犿犲狋犺犾犵犪犾犪犮狋狌狉狅狀犪狊犲（犘犕犌）
犪犮狋犻狏犻狋狔犮犺犪狀犵犲狊犪狋犱犻犳犳犲狉犲狀狋狊狋犪犵犲狊
　
８７ 草　业　学　报 第２４卷
　　如图６所示，病原菌对马铃薯茎基部ＰＭＧ活性造成了显著影响，在播种后２３ｄ处理马铃薯茎基部酶活性显
著高于对照，达到３．１μｇ／（ｈ·ｇ），为对照的２倍。在２６ｄ时开始呈下降趋势，５０ｄ后处理与对照酶活性基本相
同，无显著差异。
根据已有的研究表明，立枯丝核菌侵染马铃薯主要是在出苗之前，对芽的侵染带来出苗率低等问题［１５］，因此
本实验在苗期连续取样，结果显示，在播种２３ｄ后，处理马铃薯茎基部胞壁降解酶活性含量均为最高，分别达到
１．７，２．９和３．１μｇ／（ｈ·ｇ），其中ＰＧ与ＰＭＧ活性为对照的两倍。说明它们在病斑形成或扩展过程中可能交替
或协同发挥作用。
３　讨论
本研究通过盆栽试验，首次观察到立枯丝核菌对马铃薯芽、茎、根等器官的侵染过程，研究表明，病原菌对马
铃薯各器官的侵染都随着器官发育而发展，侵染顺序依次为：芽－茎－根－匍匐茎－块茎。病原菌侵染寄主植物
后依次形成：芽上的褐色病斑、芽腐，茎基部形成褐色病斑，植株立枯，根系黑褐色菌核或褐色溃疡，根系腐烂死
亡，匍匐茎黑褐色病斑，顶端不再膨大，薯块上形成黑痣。并发现一般在器官形成１０ｄ左右可观察到病斑出现。
对马铃薯茎溃疡病已有的研究表明，随着生育期的延长，感病程度增加，器官表面形成菌核后，变为黑褐色病斑，
继而茎基部溃疡斑造成立枯，最后出现腐烂现象，使芽、茎、根等都不能继续生长，器官死亡［１３，２８］。
本研究发现，在立枯丝核菌的侵染过程中，会形成附着胞与侵染垫的侵染结构，但与在小麦，水稻及玉米上已
有的研究结果相比有差异。本研究中尚未发现刘雪梅和肖建国［２９］研究发现的菌丝圈结构，与陶家凤［３０］的研究
结果类似。在形成侵染结构的时间上不同作物也存在差异，本研究表明，在接种２４ｈ后出现侵染结构雏形，３６ｈ
后形成附着胞，４８ｈ后形成侵染垫，继而再通过表皮或直接进入组织。可能在接种３６～４８ｈ侵入寄主。陈捷
等［３１］在玉米上的研究结果显示，侵染时间在１２～２４ｈ之间，也晚于陶家凤［３０］对水稻的研究，该研究表明在接种
１０～１２ｈ后侵入寄主，１６ｈ即可在寄主细胞中发现立枯丝核菌菌丝。
立枯丝核菌在不同作物上形成侵染结构的种类和入侵时间之间存在差异，可能原因一是立枯丝核菌对不同
寄主侵染过程不同，二是立枯丝核菌种类较多，根据陶家凤［３０］的研究表示不同融合群之间入侵时间不同，因此菌
株的差异也可能带来入侵时间与侵染结构的不同。具体原因有待进一步研究。
病原菌接种后马铃薯茎基部出现黑褐色溃疡病斑，电镜结果显示，立枯丝核菌侵染马铃薯茎基部后，可使茎
基部组织结构发生变化，细胞遭受破坏。
胞壁降解酶测定结果表示，在对照健康茎基部组织中均可测到Ｃｘ、ＰＧ和ＰＭＧ，但活性较低，可能是正常的
马铃薯茎基部细胞会产生少量的胞壁降解酶，当接种病原菌后，病原菌产生酶或刺激寄主本身酶活性提高［３２］，导
致处理后马铃薯茎基部胞壁降解酶活性上升，显著高于对照。３５ｄ后开始呈下降趋势，至６５ｄ基本与健康组织
活性相同，说明此时酶活性相应恢复到正常水平，不再发挥作用，这与玉米茎腐病［３２］，黄瓜棒孢叶斑病［３３］，水稻
纹枯病［２１］，马铃薯干腐病［２］的研究结果一致。表明病原菌接种后对马铃薯植株茎基部细胞胞壁降解酶活性的提
高，可能是马铃薯茎基部器官和细胞受到破坏的重要原因之一。
这一结论已在其他作物上得到研究证实。陈夕军等［２１］的研究结果表明，水稻纹枯病菌产生的胞壁降解酶能
引起水稻叶鞘的细胞膜损伤，并且病斑部胞壁降解酶活性显著高于健康组织。张红等［２２］的研究结果表明，果胶
酶和纤维素酶可使水稻叶鞘细胞超微结构受到严重破坏，如细胞壁部分裂解、叶绿体和线粒体损伤等。陈捷
等［３４］发现玉米胚根经胞壁降解酶处理后，细胞壁变薄、粗细不均，局部变形、断裂，相邻细胞壁消失，分离严重，细
胞器分辨不清，结构松散。这些结果提示病原菌侵染后，胞壁降解酶具有显著的致病作用。Ｐｉｅｒｓｏｎ和Ｗａｌｋｅｒ［３５］
的研究推测纤维素酶在分解细胞壁中可能起到重要作用。李宝聚等［３６］的研究结果表明在胞壁降解酶对黄瓜叶
片细胞的作用过程中，首先是果胶酶降解果胶层，然后是纤维素酶、果胶酶对栅栏组织的分解，最后是纤维素酶作
用于薄壁细胞壁，二者协同作用于细胞内部组织。
９７第１２期 拓宁　等：立枯丝核菌对马铃薯侵染过程的显微结构观察与胞壁降解酶活性的测定
４　结论
本实验认为立枯丝核菌侵染马铃薯的过程首先是菌丝在土壤中生长，扩展遇到寄主后开始附着在其表面。
附着生长４８ｈ后，菌丝形成侵染结构，胞壁降解酶活性上升，导致细胞壁受损，使细胞壁变形、断裂，从而使菌丝
直接进入细胞，侵入后，缠绕并穿透淀粉粒，推测可能利用其中的营养物质不断繁殖，之后破坏其他细胞器，直至
细胞质溶解，细胞器结构松散，细胞凋亡。从器官发育、菌丝附着、侵入细胞到植株感病，这一过程可能会历时１０
ｄ左右完成，因此芽、茎、根等器官发育１０ｄ后表现出病症。关于立枯丝核菌的致病机理，国内外都有研究，可尚
无定论，认为立枯丝核菌的致病机理是复杂的，在病菌侵染的过程中，胞壁降解酶是如何作用的，还需进一步研
究。
犚犲犳犲狉犲狀犮犲狊：
［１］　ＸｉｅＣＨ．Ｐｏｔａｔｏｉｎｄｕｓｔｒｙ：ｓｔａｔｕｓａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｕａｚｈｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＳｏｃｉａｌＳｃｉｅｎｃｅｓＥｄｉｔｉｏｎ），
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狆犺狌狉犲狌犿．ＳｃｉｅｎｔｉａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａＳｉｎｉｃａ，２０１２，４５（１）：１２７１３４．
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犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿）．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，２１（２）：２３０２３７．
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ｔｏｃｕｌｔｉｖａｒ．ＡｍｅｒｉｃａｎＥｕｒａｓｉａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ＆ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔＳｃｉｅｎｃｅ，２０１０，７（４）：４９２４９６．
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ｌａｔｉｎｇｗｉｔｈｔｏｘｉｎｏｆ犚犻狕狅犮狋狅狀犻犪狊狅犾犪狀犻ｉｎｐｏｔａｔｏ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１２，３３（２）：１６２０．
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［１６］　ＡｔｋｉｎｓｏｎＤ，ＴｈｏｒｎｔｏｎＭ Ｋ，ＭｉｌｅｒＪＳ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆ犚犺犻狕狅犮狋狅狀犻犪狊狅犾犪狀犻ｏｎｓｔｅｍｓ，ｓｔｏｌｏｎｓａｎｄｔｕｂｅｒｓｏｆｐｏｔａｔｏｅｓⅠ．
ｅｆｆｅｃｔｏｆｉｎｏｃｕｌｕｍｓｏｕｒｃｅ．ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｏｔａｔｏＲｅｓｅａｒｃｈ，２０１０，８７：３７４３８１．
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ｅａｓｅｉｎｐｏｔａｔｏ．ＡｃｔａＰｈｙｔｏｐｈｙｌａｃｉｃａＳｉｎｉｃａ，２０１１，３８（４）：３７９３８０．
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犉狌狊犪狉犻狌犿狊犪犿犫狌犮犻狀狌犿ａｎｄｔｈｅｉｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２００９，１８（２）：１３８１４５．
［２１］　ＣｈｅｎＸＪ，ＺｈａｎｇＨ，ＸｕＪＹ，犲狋犪犾．Ｃｅｌｗａｌｄｅｇｒａｄｉｎｇｅｎｚｙｍｅｓｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙ犚犺犻狕狅犮狋狅狀犻犪狊狅犾犪狀犻ａｎｄｔｈｅｉｒｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙｔｏ
ｒｉｃｅｐｌａｎｔｓ．ＪｉａｎｇｓｕＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ，２００６，２２（１）：２４２８．
［２２］　ＺｈａｎｇＨ，ＣｈｅｎＸＪ，ＴｏｎｇＹＨ，犲狋犪犾．Ｄａｍａｇｅｏｆｃｅｌｗａｌｄｅｇｒａｄｉｎｇｅｎｚｙｍｅｓｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙ犚犺犻狕狅犮狋狅狀犻犪狊狅犾犪狀犻ｔｏｒｉｃｅｔｉｓｓｕｅ
０８ 草　业　学　报 第２４卷
ａｎｄｃｅｌｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＹａｎｇｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｄＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ），２００５，２６（４）：８４８６．
［２３］　ＣｈｅｎＢ，ＷａｎｇＫＹ，ＤｏｎｇＧＱ，犲狋犪犾．Ｔｈｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙｔｏｔｈｅｅｎｚｙｍｅｓａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆ犜犺犪狀犪狋犲狆犺狅狉狌狊犮狌
犮狌犿犲狉犻狊ｃａｕｓｉｎｇｒｉｃｅｓｈｅａｔｈｂｌｉｇｈｔｄｉｓｅａｓｅ．ＡｃｔａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅＺｈｅｊｉａｎｇＧｅｎｓｉｓ，１９９２，２３（１）：１９２２．
［２４］　ＺｈａｎｇＸＹ．ＳｔｕｄｙｏｎＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＲｅｓｉｓｔａｎｃｅＭｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＳｔｅｍＣａｎｋｅｒａｎｄＢｌａｃｋＳｃｕｒｆｉｎＰｏｔａｔｏｂｙ犚犺犻
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