全 文 ：书冰草属植物种质资源遗传多样性的犐犛犛犚分析
曾亮１，２，袁庆华１，王方１，３，王瑜１
（１．中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京１００１９３；２．甘肃农业大学草业学院，甘肃 兰州７３００７０；
３．兰州大学草地农业科技学院，甘肃 兰州７３００２０）
摘要：用ＩＳＳＲ标记对来自国内外的３３份冰草材料的遗传多样性进行了检测。从９３条ＩＳＳＲ引物中共筛出１１条
能扩增出清晰条带并具有多态性的引物，３３个样品ＤＮＡ共获得８４个扩增位点，其中多态性位点５９个，平均每个
引物扩增位点为７．６４个。品种间遗传相似系数在０．０８３～０．７０６，表现出丰富的遗传多样性。利用 ＵＰＧＭＡ聚类
分析，以遗传相似系数０．５２为界限，３３份材料划分为４类，聚类基本符合地理来源相近的材料聚为一类，呈现出一
定的地域性分布规律。
关键词：冰草；ＩＳＳＲ标记；种质资源；遗传多样性
中图分类号：Ｓ５４３＋．９０３；Ｑ９４３　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１３）０１０２６００８
　　冰草属（犃犵狉狅狆狔狉狅狀）为禾本科（Ｐｏａｃｅａｅ）小麦族（Ｔｒｉｔｉｃｅａｅ）多年生牧草，主要分布于欧亚大陆温寒带及沙地
地区，是温带干旱地区最重要的牧草之一［１］。冰草属植物具有很高的饲用价值和经济利用价值，各种营养成分相
对较高，是一种重要的植物资源，其抗旱、抗寒性强，并具有适度的抗盐碱性。作为牲畜四季可口的优质牧草而受
到禾草学家的高度重视。冰草作为重要的小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿）野生近缘种，其众多优异基因还可用于小麦的遗传改
良［２］。同时，由于冰草根为须状，密生，具砂套和入土较深等特性，它又是一种良好的水土保持和防风固沙植物，
具有较高的生态价值［３］。
ＩＳＳＲ（ｉｎｔｅｒｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔｓ）简单序列重复区间扩增多态性是由Ｚｉｅｔｋｉｅｗｉｃｚ等［４］于１９９４年提出的
一种以ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，聚合酶链式反应）扩增为基础的分析标记技术，主要是利用基于ＳＳＲ
（ｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ，简单重复序列）而设计的引物来检测２个ＳＳＲ之间的ＤＮＡ序列差异。与ＳＳＲ相比，
ＩＳＳＲ技术具有简便、不需预先知道序列信息、重复性强等特点，已被广泛应用于居群遗传学、品种鉴定、物种分类
以及物种的遗传多样性研究中［５７］。
目前，对冰草属植物遗传多样性的研究多集中在形态学［８１１］、细胞学［１２］和同工酶［１３］方面，如李景欣［８］从形态
学角度对１４个冰草种群的穗部性状进行了测定分析；兰保祥和李立会［９］应用居群生物学原理对３５个蒙古冰草
居群的形态学性状进行了分析；张丽娟［１３］对６个不同种群冰草的过氧化物酶进行了检测分析。而在ＤＮＡ水平
上多采用ＳＳＲ、ＲＡＰＤ（ｒａｎｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ，随机扩增多态性ＤＮＡ标记）等标记，如车永和等［１４］
用２６个ＳＳＲ引物对１８个沙生冰草居群进行了遗传多样性分析；李景欣和云锦凤［１５］对１６个冰草种群的３５２个
单株进行了ＲＡＰＤ多态性检测。但应用ＩＳＳＲ标记对冰草属植物进行遗传多样性研究尚罕见报道。本研究旨在
探索ＩＳＳＲ分子标记法在冰草属品种鉴定、种质资源和遗传多样性研究中的可行性，同时也为有效利用ＤＮＡ分
子标记开发冰草属植物资源和培育新品种提供理论依据。
１　材料与方法
１．１　供试材料
材料全部来自于中国农业科学院北京畜牧兽医研究所２００９年所采集的新种子，共３３份（表１）。于２０１０年
３月种植于中国农业科学院北京畜牧兽医研究所牧草试验基地，试验地位于北京市昌平区，属典型的暖温带半湿
２６０－２６７
２０１３年２月
　　　草　业　学　报　　　
　　　ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ　　　
第２２卷　第１期
Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．１
收稿日期：２０１２０１１３；改回日期：２０１２０３１９
基金项目：国家科技支撑项目（２０１１ＢＡＤ１７Ｂ０１）资助。
作者简介：曾亮（１９８３），男，甘肃兰州人，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｓｔｅｖｅ１３１４＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｙｕａｎｑｉｎｇｈｕａ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ
润大陆性季风气候，年平均气温８～１２℃，年降水量６００ｍｍ以上，土质为砂壤，土壤ｐＨ为７．６。于５月份采摘
新鲜幼嫩叶，放入冰盒，带回实验室置于－８０℃超低温冰箱保存以备ＤＮＡ提取。
１．２　ＤＮＡ提取及定量
每份材料取１０～１５个植株上的新鲜叶片，采用改进的ＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍｓａｌｔ，十二烷基硫酸钠）法，提取结束后，
用０．８％琼脂糖凝胶对ＤＮＡ质量进行电泳检测，并以一定浓度λＤＮＡ作为定量参照标准，根据电泳结果，将
ＤＮＡ浓度定为１０ｎｇ／μＬ，－２０℃保存备用。
表１　试验材料及来源
犜犪犫犾犲１　犈狓狆犲狉犻犿犲狀狋犿犪狋犲狉犻犪犾狊犪狀犱狋犺犲犻狉狅狉犻犵犻狀
序号Ｎｏ． 材料编号 Ｍａｔｅｒｉａｌｎｕｍｂｅｒ 种名Ｓｐｅｃｉｅｓｎａｍｅ 来源地 Ｏｒｉｇｉｎ
１ ８４４７１ 扁穗冰草犃．犮狉犻狊狋犪狋狌犿 伊朗Ｉｒａｎ
２ ８４７７ 扁穗冰草犃．犮狉犻狊狋犪狋狌犿 伊朗Ｉｒａｎ
３ ８４８０ 扁穗冰草犃．犮狉犻狊狋犪狋狌犿 伊朗Ｉｒａｎ
４ ８４１５６ 扁穗冰草犃．犮狉犻狊狋犪狋狌犿 土耳其Ｔｕｒｋｅｙ
５ ８４１５７ 扁穗冰草犃．犮狉犻狊狋犪狋狌犿 土耳其Ｔｕｒｋｅｙ
６ ８４１５２ 扁穗冰草犃．犮狉犻狊狋犪狋狌犿 土耳其Ｔｕｒｋｅｙ
７ ８４４０ 扁穗冰草犃．犮狉犻狊狋犪狋狌犿 苏联Ｓｏｖｉｅｔｕｎｉｏｎ
８ ８４２８ 扁穗冰草犃．犮狉犻狊狋犪狋狌犿 苏联Ｓｏｖｉｅｔｕｎｉｏｎ
９ ８４２９ 扁穗冰草犃．犮狉犻狊狋犪狋狌犿 苏联Ｓｏｖｉｅｔｕｎｉｏｎ
１０ ８４１５４ 扁穗冰草犃．犮狉犻狊狋犪狋狌犿 苏联Ｓｏｖｉｅｔｕｎｉｏｎ
１１ ８４１３ 扁穗冰草犃．犮狉犻狊狋犪狋狌犿 葡萄牙Ｐｏｒｔｕｇａｌ
１２ ８４１１９ 扁穗冰草犃．犮狉犻狊狋犪狋狌犿 加拿大Ｃａｎａｄａ
１３ ８４１５ 扁穗冰草犃．犮狉犻狊狋犪狋狌犿 南斯拉夫Ｙｕｇａｓｌａｖｉａ
１４ ８４１２ 扁穗冰草犃．犮狉犻狊狋犪狋狌犿 西班牙Ｓｐａｉｎ
１５ ２００４１７ 扁穗冰草犃．犮狉犻狊狋犪狋狌犿 山西五台山 ＷｕｔａｉＭｏｕｎｔａｉｎ，Ｓｈａｎｘｉ
１６ ２００４１０ 扁穗冰草犃．犮狉犻狊狋犪狋狌犿 新疆塔城Ｔａｃｈｅｎｇ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ
１７ ２００４１３３ 扁穗冰草犃．犮狉犻狊狋犪狋狌犿 立石村Ｌｉｓｈｉｖｉｌａｇｅ
１８ ２００４１１２ 扁穗冰草犃．犮狉犻狊狋犪狋狌犿 郭家山Ｇｕｏｊｉａｓｈａｎ
１９ 中畜４２２Ｚｈｏｎｇｘｕ４２２ 扁穗冰草犃．犮狉犻狊狋犪狋狌犿 黑龙江 Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ
２０ 中畜１６５Ｚｈｏｎｇｘｕ１６５ 扁穗冰草犃．犮狉犻狊狋犪狋狌犿 古浪县黄羊川 Ｈｕａｎｇｙａｎｇｃｈｕａｎ，Ｇｕｌａｎｇ
２１ 中畜８２９Ｚｈｏｎｇｘｕ８２９ 扁穗冰草犃．犮狉犻狊狋犪狋狌犿 经棚（克旗）Ｊｉｎｇｐｅｎ
２２ ８４１６８ 沙生冰草犃．犱犲狊犲狉狋狅狉狌犿 罗马尼亚Ｒｏｍａｎｉａ
２３ ８４１６７ 沙生冰草犃．犱犲狊犲狉狋狅狉狌犿 英国Ｂｒｉｔｉｓｈ
２４ ８４１８１ 沙生冰草犃．犱犲狊犲狉狋狅狉狌犿 苏联Ｓｏｖｉｅｔｕｎｉｏｎ
２５ ８４１７６ 沙生冰草犃．犱犲狊犲狉狋狅狉狌犿 苏联Ｓｏｖｉｅｔｕｎｉｏｎ
２６ ８４１７５ 沙生冰草犃．犱犲狊犲狉狋狅狉狌犿 苏联Ｓｏｖｉｅｔｕｎｉｏｎ
２７ ８４１６５ 沙生冰草犃．犱犲狊犲狉狋狅狉狌犿 加拿大Ｃａｎａｄａ
２８ ８３３２５ 沙生冰草犃．犱犲狊犲狉狋狅狉狌犿 土耳其 Ｔｕｒｋｅｙ
２９ ８４６１０ 西伯利亚冰草犃．狊犻犫犻狉犻犮狌犿 苏联Ｓｏｖｉｅｔｕｎｉｏｎ
３０ ８４６１１ 西伯利亚冰草犃．狊犻犫犻狉犻犮狌犿 苏联Ｓｏｖｉｅｔｕｎｉｏｎ
３１ ８４６０９ 西伯利亚冰草犃．狊犻犫犻狉犻犮狌犿 苏联Ｓｏｖｉｅｔｕｎｉｏｎ
３２ ２６９５ 蒙古冰草犃．犿狅犵狅犾犻犮狌犿 苏联Ｓｏｖｉｅｔｕｎｉｏｎ
３３ ９１１７ 兰茎冰草犃．狊犿犻狋犺犻犻 苏联Ｓｏｖｉｅｔｕｎｉｏｎ
１６２第２２卷第１期 草业学报２０１３年
１．３　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的建立与优化
在确定最佳反应条件时，参考了地毯草（犃狓狅狀狅狆狌狊犮狅犿狆狉犲狊狊狌狊）［１６］、鸭茅（犇犪犮狋狔犾犻狊犵犾狅犿犲狉犪狋犲）［１７］及紫花苜
蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）［１８］的ＩＳＳＲ扩增程序和反应体系，并进行适当优化。最终确定的反应体系（２０μＬ）如下：４０
ｎｇ模板ＤＮＡ，０．２ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ，０．５μｍｏｌ／ＬＩＳＳＲ引物，１ＵＴａｑＤＮＡ聚合酶，２μＬ１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ，２．５
ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２。ＰＣＲ反应程序为：９４℃预变性４ｍｉｎ，９４℃变性３０ｓ，６０℃（６０～５８℃）退火４５ｓ，７２℃延伸１
ｍｉｎ４５ｓ，共１１个循环，每个循环退火温度降１℃；９４℃变性３０ｓ，５０℃（５０～４８℃）退火４５ｓ，共２４个循环；７２℃
延伸５ｍｉｎ，２５℃保温。
１．４　ＩＳＳＲ引物的筛选
本试验根据加拿大哥伦比亚大学核酸蛋白服务工作室提供的ＩＳＳＲ引物序列，由上海生物工程公司合成，根
据确定的反应体系的基础上，从９３条ＩＳＳＲ引物进行扩增，筛选出能获得清晰条带，反应稳定的引物进行下一步
分析（表１）。
１．５　ＰＣＲ扩增及电泳
ＰＣＲ扩增在ＰＴＣ１００ＴＭ扩增仪上进行。ＰＣＲ反应结束后取７．５μＬＰＣＲ扩增产物与１．５μＬ６×Ｌｏａｄｉｎｇ
Ｂｕｆｆｅｒ（ＴａＫａＲａ）混匀，点入含０．５μｇ／ｍＬＥＢ（ｅｔｈｉｄｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ，溴化乙锭）的２％琼脂糖凝胶中，在５Ｖ电场强
度下电泳１～２ｈ，取出凝胶，用凝胶成像仪检测并照相、分析。
１．６　数据统计
多态性带是指在供试品种中，对某一扩增带而言，某些品种有，其他品种没有的条带。多态性比例（％）＝（总
谱带数－共有带数）／总谱带数×１００。以扩增条带在相对迁移位置的有无，记为“１”或“０”。按Ｎｅｉ和Ｌｉ［１９］的方
法计算材料间的遗传相似系数（ＧＳ），计算公式为：犌犛＝２犖犻犼／（犖犻＋犖犼），式中，犖犻犼为材料犻和犼共有的扩增条
带数，犖犻为材料犻的扩增条带数，犖犼为材料犼的扩增条带数，根据ＧＳ值按非加权配对算术平均法（ＵＰＧＭＡ）对
冰草种质材料进行遗传相似性聚类。数据使用ＮＴＳＹＳＰＣ２．１进行统计分析。
２　结果与分析
２．１　筛选引物
从９３条引物中共筛选出１１条多态性好、条带清
晰的引物，用于供试３３个材料的ＰＣＲ扩增。并根据
各引物的特性和具体的扩增反应对照，确定了各引物
的最佳退火温度（表２）。
２．２　扩增产物的多态性
１１条引物对３３份冰草种质资源进行ＰＣＲ扩增
（图１），大部分扩增片段大小均在３００～１５００ｂｐ。从
ＩＳＳＲ扩增谱带统计结果（表３）来看，所有材料共获得
８４个扩增位点，其中多态性位点５９个，每个引物扩增
位点为３～１１个，平均７．６４个，其中多态性位点１～９
个，平均５．３６个，多态性比率为７０．２％。这说明供试
冰草属种质资源间存在较大的遗传变异，且ＩＳＳＲ标
记能有效的揭示材料间的多态性。
２．３　遗传相似系数
３３份冰草属材料之间的相似系数在０．０８３～
０．７０６（表４）。其中，亲缘关系最近的是来源于土耳其
表２　犐犛犛犚分析的引物序列
犜犪犫犾犲２　犘狉犻犿犲狉狊犲狇狌犲狀犮犲狊狌狊犲犱犻狀犐犛犛犚犪狀犪犾狔狊犻狊
引物编号
Ｎｕｍｂｅｒｏｆ
ｐｒｉｍｅｒ
引物序列
Ｐｒｉｍｅｒ
ｌｉｓｔ
退火温度
Ａｎｎｅａｌｅｄｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
（℃）
１０ ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＴＡ ４８
１４ ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＧＴ ４８
１７ ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＣ ４８
１８ ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＧ ４８
１９ ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＣＡ ４８
８３４ ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＹＴ ４８
８３６ ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＹＡ ４８
８６８ ＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ ４８
８１５ ＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＧ ５０
２６ ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＣ ５２
２８ ＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＲＧ ５２
的扁穗冰草５号材料和６号材料，相似系数为０．７０６；遗传相似系数最低的是来源于伊朗的扁穗冰草３号材料与
来源于加拿大的沙生冰草２７号材料，遗传相似系数为０．０８３，亲缘关系最远；在３３份冰草属种质材料中大多数
来自于相同或相近地理位置的材料间ＧＳ值较大，亲缘关系较近。只有小部分材料因采集地地理位置或生境相
２６２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．１
差较大，从而使得供试材料间整体存在较大的遗传差
异。
２．４　聚类分析
利用ＵＰＧＭＡ法对３３份冰草属材料进行 ＵＰＧ
ＭＡ聚类分析，绘出树状聚类图（图２）。以遗传相似
系数０．５２为界限，将３３份冰草属植物的材料划分为
４组：第１类全部为沙生冰草，按地理来源划分为２个
亚类，第１亚类共３份材料，全部来自于苏联；第２亚
类共４份材料，２３号来自罗马尼亚，２２号来自英国，２７
号来自加拿大，２８号来自土耳其；第２类共８分材料，
全部是扁穗冰草，除１号材料来自伊朗、１１号材料来
自于葡萄牙以外，其余６分材料均来自国内；第３类共
１３份材料，均为扁穗冰草，除２１号材料来源于国内以
外，其余均来源于国外；第４类共５份材料，其中２９，
３０，３１号为西伯利亚冰草，３２与３３号分别为蒙古冰草
与兰茎冰草单独为一亚类。聚类结果表明，材料地理
来源对系统聚类结果影响较大，各来源地材料在聚类
图中既有区别又有交叉，说明材料间形态性状变异有
一定的连续性。
表３　３３份冰草属植物犐犛犛犚标记扩增结果
犜犪犫犾犲３　犜犺犲狉犲狊狌犾狋狅犳犐犛犛犚犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳３３犃犵狉狅狆狔狉狅狀
引物编号
Ｎｕｍｂｅｒｏｆ
ｐｒｉｍｅｒ
多态性位点数
Ｎｕｍｂｅｒｏｆ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ
ｂａｎｄｓ
总位点数
Ｎｕｍｂｅｒｏｆ
ｔｏｔａｌｂａｎｄｓ
多态性百分率
Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ
ｂａｎｄｓ（％）
１０ ４ ６ ６６．７
１４ ５ ７ ７１．４
１７ １ ３ ３３．３
１８ ９ １１ ８１．８
１９ ５ ９ ５５．６
８３４ ２ ６ ３３．３
８３６ ８ ９ ８８．９
８６８ ４ ７ ５７．１
８１５ ６ ７ ８５．７
２６ ４ ８ ５０．０
２８ ７ １１ ６３．６
总计 Ｔｏｔａｌ ５９ ８４ ７０．２
平均 Ｍｅａｎ ５．３６ ７．６４
图１　引物１０的冰草扩增图谱
犉犻犵．１　犚犲狊狌犾狋狅犳犘犆犚犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狌狊犻狀犵狆狉犻犿犲狉１０狅犳犃犵狉狅狆狔狉狅狀
Ｍ为１００ｂｐＤＮＡｌａｄｄｅｒ，材料编号同表１。Ｍ＝１００ｂｐＤＮＡｌａｄｄｅｒ，ｍａｔｅｒｉａｌｎｕｍｂｅｒｗａｓｓｈｏｗｅｄｉｎＴａｂｌｅ１．
３６２第２２卷第１期 草业学报２０１３年
表４　犐犛犛犚标记的３３份供试材料之间的相似系数
犜犪犫犾犲４　犌犲狀犲狋犻犮狊犻犿犻犾犪狉犻狋狔狅犳３３犿犪狋犲狉犻犪犾狊犫犪狊犲犱狅狀犐犛犛犚
编号Ｎｏ． １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０ １１ １２ １３ １４ １５ １６
２ ０．６００
３ ０．６２１ ０．６６７
４ ０．３４５ ０．４４４ ０．５３８
５ ０．４２４ ０．３８７ ０．４６７ ０．４６７
６ ０．３６４ ０．３８７ ０．２６７ ０．３３３ ０．７０６
７ ０．５１４ ０．３６４ ０．３７５ ０．３７５ ０．５５６ ０．６１１
８ ０．３３３ ０．４２９ ０．２２２ ０．２９６ ０．４５２ ０．４５２ ０．４８５
９ ０．４５７ ０．３６４ ０．５６３ ０．５６３ ０．６１１ ０．３８９ ０．５７９ ０．４２４
１０ ０．２３１ ０．２５０ ０．３４８ ０．１７４ ０．４４４ ０．４４４ ０．３４５ ０．５００ ０．３４５
１１ ０．４７１ ０．５６３ ０．６４５ ０．５１６ ０．６２９ ０．５１４ ０．４８６ ０．１８８ ０．６４９ ０．２８６
１２ ０．３７５ ０．４００ ０．３４５ ０．２７６ ０．４２４ ０．５４５ ０．５１４ ０．５３３ ０．２２９ ０．３８５ ０．４１２
１３ ０．４５２ ０．６２１ ０．６４３ ０．６４３ ０．５６３ ０．３１３ ０．３５３ ０．３４５ ０．５８８ ０．２４０ ０．６０６ ０．３８７
１４ ０．３８７ ０．４１４ ０．２８６ ０．３５７ ０．４３８ ０．６２５ ０．５２９ ０．６９０ ０．２９４ ０．４００ ０．２４２ ０．６４５ ０．３３３
１５ ０．５３３ ０．５００ ０．４４４ ０．２２２ ０．３２３ ０．２５８ ０．４２４ ０．５００ ０．４８５ ０．３３３ ０．３７５ ０．２００ ０．４８３ ０．３４５
１６ ０．４６７ ０．４２９ ０．２２２ ０．２９６ ０．３８７ ０．３８７ ０．５４５ ０．４２９ ０．４２４ ０．２５０ ０．４３８ ０．３３３ ０．３４５ ０．２７６ ０．６４３
１７ ０．３２３ ０．２７６ ０．４２９ ０．２８６ ０．５００ ０．３７５ ０．５８８ ０．３４５ ０．６４７ ０．３２０ ０．６０６ ０．３８７ ０．４６７ ０．１３３ ０．４８３ ０．４８３
１８ ０．２５８ ０．４１４ ０．３５７ ０．５００ ０．６２５ ０．５６３ ０．４１２ ０．４１４ ０．５２９ ０．３２０ ０．６６７ ０．５１６ ０．４６７ ０．４６７ ０．２０７ ０．４１４
１９ ０．２９６ ０．４００ ０．３３３ ０．２５０ ０．４２９ ０．５００ ０．２００ ０．３２０ ０．４００ ０．３８１ ０．４１４ ０．４４４ ０．３８５ ０．３０８ ０．２４０ ０．１６０
２０ ０．４５２ ０．３４５ ０．２１４ ０．３５７ ０．３７５ ０．５００ ０．２９４ ０．２７６ ０．４１２ ０．４００ ０．４２４ ０．３８７ ０．２６７ ０．２６７ ０．３４５ ０．３４５
２１ ０．４７１ ０．５６３ ０．５１６ ０．４５２ ０．４００ ０．５１４ ０．４８６ ０．４３８ ０．３７８ ０．３５７ ０．６１１ ０．７０６ ０．４８５ ０．４８５ ０．３７５ ０．４３８
２２ ０．５００ ０．４６７ ０．４８３ ０．４１４ ０．４８５ ０．４２４ ０．４５７ ０．６００ ０．４５７ ０．３０８ ０．４７１ ０．４３８ ０．３８７ ０．５１６ ０．５３３ ０．６００
２３ ０．４５７ ０．６０６ ０．５６３ ０．５００ ０．５５６ ０．５００ ０．４７４ ０．４２４ ０．４２１ ０．４１４ ０．６４９ ０．６２９ ０．５８８ ０．５８８ ０．３６４ ０．４８５
２４ ０．４８６ ０．４００ ０．４７１ ０．４１２ ０．５２６ ０．４２１ ０．４５０ ０．４５７ ０．５５０ ０．３８７ ０．４６２ ０．５４１ ０．６１１ ０．５５６ ０．４５７ ０．４００
２５ ０．３７０ ０．４８０ ０．４１７ ０．３３３ ０．２８６ ０．３５７ ０．３３３ ０．３２０ ０．５３３ ０．１９０ ０．５５２ ０．２９６ ０．３８５ ０．３０８ ０．４００ ０．２４０
２６ ０．２５０ ０．２００ ０．２７６ ０．４１４ ０．４８５ ０．４８５ ０．４５７ ０．４００ ０．６２９ ０．４６２ ０．４７１ ０．４３８ ０．４５２ ０．３８７ ０．３３３ ０．２６７
２７ ０．２９６ ０．２４０ ０．０８３ ０．３３３ ０．４２９ ０．４２９ ０．５３３ ０．３２０ ０．２６７ ０．２８６ ０．３４５ ０．４４４ ０．２３１ ０．３０８ ０．１６０ ０．４８０
２８ ０．４８５ ０．３２３ ０．３３３ ０．３３３ ０．６４７ ０．５８８ ０．６１１ ０．４５２ ０．４４４ ０．３７０ ０．５１４ ０．５４５ ０．４３８ ０．４３８ ０．３８７ ０．５１６
２９ ０．５８８ ０．５００ ０．５１６ ０．４５２ ０．５１４ ０．５７１ ０．５９５ ０．３７５ ０．７０３ ０．２８６ ０．５５６ ０．２３５ ０．４８５ ０．３６４ ０．５６３ ０．４３８
３０ ０．５６３ ０．６００ ０．５５２ ０．４８３ ０．３０３ ０．３６４ ０．５７１ ０．４６７ ０．４００ ０．３０８ ０．４１２ ０．５００ ０．４５２ ０．５８１ ０．６００ ０．６００
３１ ０．４５７ ０．４２４ ０．４３８ ０．３７５ ０．５５６ ０．４４４ ０．４７４ ０．３６４ ０．５２６ ０．４１４ ０．４８６ ０．４５７ ０．４７１ ０．５８８ ０．４２４ ０．４２４
３２ ０．４７１ ０．３７５ ０．４５２ ０．４５２ ０．５１４ ０．４５７ ０．４８６ ０．５６３ ０．４８６ ０．５００ ０．５００ ０．６４７ ０．４８５ ０．５４５ ０．３１３ ０．４３８
３３ ０．３４５ ０．１４８ ０．２３１ ０．４６２ ０．４６７ ０．３３３ ０．４３８ ０．４４４ ０．５００ ０．０８７ ０．５１６ ０．４８３ ０．５００ ０．３５７ ０．２９６ ０．４４４
编号Ｎｏ． １７ １８ １９ ２０ ２１ ２２ ２３ ２４ ２５ ２６ ２７ ２８ ２９ ３０ ３１ ３２
１８ ０．５３３
１９ ０．４６２ ０．５３８
２０ ０．４６７ ０．４６７ ０．６１５
２１ ０．３６４ ０．３０３ ０．２７６ ０．４２４
２２ ０．３８７ ０．４５２ ０．２２２ ０．３２３ ０．５８８
２３ ０．２９４ ０．５８８ ０．３３３ ０．２９４ ０．６４９ ０．６２９
２４ ０．４４４ ０．４４４ ０．３７５ ０．３８９ ０．４６２ ０．４８６ ０．６５０
２５ ０．４６２ ０．４６２ ０．４５５ ０．４６２ ０．２７６ ０．２２２ ０．２６７ ０．２５０
２６ ０．５１６ ０．４５２ ０．２９６ ０．５８１ ０．４１２ ０．３１３ ０．３４３ ０．４８６ ０．５９３ ．
２７ ０．４６２ ０．４６２ ０．３６４ ０．３８５ ０．３４５ ０．２２２ ０．３３３ ０．２５０ ０．１８２ ０．２２２
２８ ０．５６３ ０．５００ ０．４２９ ０．４３８ ０．５７１ ０．６０６ ０．５５６ ０．５２６ ０．１４３ ０．３６４ ０．５００
２９ ０．４８５ ０．４２４ ０．４１４ ０．４８５ ０．３８９ ０．４１２ ０．３２４ ０．３５９ ０．５５２ ０．４７１ ０．２７６ ０．４００
３０ ０．３２３ ０．３８７ ０．２２２ ０．３２３ ０．５８８ ０．６８８ ０．５７１ ０．４３２ ０．３７０ ０．３１３ ０．２２２ ０．３６４ ０．５２９
３１ ０．４１２ ０．４７１ ０．３３３ ０．４７１ ０．４８６ ０．５１４ ０．５７９ ０．７００ ０．３３３ ０．５１４ ０．４００ ０．３８９ ０．３７８ ０．５１４
３２ ０．４２４ ０．４８５ ０．２７６ ０．４２４ ０．６６７ ０．５２９ ０．６４９ ０．６１５ ０．２７６ ０．５２９ ０．４１４ ０．５１４ ０．１６７ ０．４１２ ０．６４９
３３ ０．４２９ ０．４２９ ０．１６７ ０．２１４ ０．５１６ ０．４８３ ０．４３８ ０．４１２ ０．３３３ ０．４８３ ０．４１７ ０．６００ ０．３２３ ０．２０７ ０．３１３ ０．５８１
４６２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．１
图２　基于犐犛犛犚标记的３３份冰草资源聚类图
犉犻犵．２　犇犲狀犱狉狅犵狉犪犿狅犳犮犾狌狊狋犲狉犪狀犪犾狔狊犻狊犫犪狊犲犱狅狀犐犛犛犚狅犳３３犃犵狉狅狆狔狉狅狀
材料编号同表１。Ｍａｔｅｒｉａｌｎｕｍｂｅｒｗａｓｓｈｏｗｅｄｉｎｔａｂｌｅ１．
３　讨论
李景欣和云锦凤［１５］对１６个天然冰草种群３５２个单株的基因组ＤＮＡ进行ＲＡＰＤ多态性检测，聚类分析结
果表明，１６个种群大致可以分为４类，生境和表型相近的种群基本聚为一类。卢萍等［２０］对内蒙古地区６个种群
的小花棘豆（犗狓狔狋狉狅狆犻狊犵犾犪犫狉犪）进行了ＩＳＳＲ遗传多样性研究，聚类结果表明，生态地理条件相似的种群优先聚
集。本研究基于ＩＳＳＲ标记的聚类结果与以上研究结果相似，从３３份冰草材料的聚类图可以看出在ＧＳ约为
０．５２处将３３份材料聚为４类，聚类基本符合地理来源相近的居群聚为一类。但也有地理来源不同的品种被归入
一类，产生这种结果的原因可能有２个方面：１）地理来源相同的材料虽然来自于同一环境，但是由于选择方向的
不同和选用育种材料的错综复杂，也可能形成遗传差异较大的类型，因此出现地理来源相同的品种被归入不同类
群；２）受环境饰变作用的影响，物种在长期适应环境的过程中会出现某些性状趋同的现象，造成不同物种性状间
的交叉。
本研究首次采用ＩＳＳＲ标记对冰草属植物种质资源进行分析，获得了较为满意的结果。ＩＳＳＲ标记是一种快
速、可靠、可以提供有关基因组丰富信息的ＤＮＡ指纹技术，因而已被广泛的应用于植物遗传多样性的研究中。
冯亮亮等［２１］在对甘肃地区红砂（犚犲犪狌犿狌狉犻犪狊狅狅狀犵狅狉犻犮犪）遗传多样性的ＩＳＳＲ分析表明，１２条引物检测到６９个位
５６２第２２卷第１期 草业学报２０１３年
点，其中多态性位点６０个，多态位点比率达到８６．９６％，说明ＩＳＳＲ标记具有较高的多态性检测水平。祁建民
等［２２］在烟草（犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪犮狌犿）上的研究结果表明，ＩＳＳＲ标记比ＲＡＰＤ标记表现出较高的稳定性，在对３０份
烟草的ＩＳＳＲ分析中，分子聚类能较好地揭示种间或种内的遗传差异。刘万勃等［２３］利用ＲＡＰＤ和ＩＳＳＲ标记对
甜瓜（犆狌犮狌犿犻狊犿犲犾狅）种质遗传多样性研究发现，ＩＳＳＲ比ＲＡＰＤ的多态性检测水平略高，可检测到更高的类型间
遗传变异。侯永翠等［２４］利用ＲＡＭＰ（ｒａｎｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，随机扩增微卫星多态性）和
ＩＳＳＲ标记分别对６０份大麦（犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲）种质资源的遗传多样性进行了检测，结果发现这２种标记都能
揭示材料间较高的遗传多样性，而且ＩＳＳＲ标记的多态性又高于ＲＡＭＰ标记。张木清等［２５］选用２４个ＩＳＳＲ引物
分析我国８省区的３０多个斑茅（犛犪犮犮犺犪狉狌犿犪狉狌狀犱犻狀犪犮犲狌犿）种质资源，发现我国斑茅具有丰富的遗传多样性，同
一地区的斑茅基本聚在一起，呈现出一定的地域分布规律。钱韦等［２６］利用ＩＳＳＲ标记技术探讨了我国野生稻
（犗狉狔狕犪）的遗传背景，１２个引物扩增出１２２条ＤＮＡ片段，多态条带比率为７２．９５％。前人的研究结果均表明ＩＳ
ＳＲ分子标记技术是一种有效揭示品种遗传多样性的手段。本研究利用１１条ＩＳＳＲ引物扩增，获得多态性位点
５９个，多态性位点百分率为７０．２％，３３份材料相似系数为０．０８３～０．７０６，平均为０．３９５，这表明冰草属不同材料
间存在着丰富的多态性，这种多态性对了解冰草属植物的遗传背景、为冰草属资源的开发利用、新品种的选育和
生产提供了理论依据。
４　结论
通过ＩＳＳＲ分子标记技术对来自国内外的３３份冰草材料遗传多样性进行分析，结果表明，３３个样品ＤＮＡ共
获得８４个扩增位点，其中多态性位点５９个，平均每个引物扩增位点７．６４个。品种间遗传相似系数在０．０８３～
０．７０６，表现出丰富的遗传多样性。利用ＵＰＧＭＡ聚类分析，以遗传相似系数０．５２为界限，将３３份材料划分为４
类，聚类基本符合地理来源相近的材料聚为一类，呈现出一定的地域性分布规律。
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犌犲狀犲狋犻犮犱犻狏犲狉狊犻狋狔犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犃犵狉狅狆狔狉狅狀犵犲狉犿狆犾犪狊犿狉犲狊狅狌狉犮犲狊犫狔犐犛犛犚
ＺＥＮＧＬｉａｎｇ１，２，ＹＵＡＮＱｉｎｇｈｕａ１，ＷＡＮＧＦａｎｇ１，３，ＷＡＮＧＹｕ１
（１．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅ，ＣＡＡＳ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００１９３，Ｃｈｉｎａ；２．ＣｏｌｅｇｅｏｆＧｒａｓｓｌａｎｄＳｃｉｅｎｃｅ，
ＧａｎｓｕＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ；３．ＣｏｌｅｇｅｏｆＰａｓｔｏｒａｌＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ
ＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＬａｎｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｌａｎｚｈｏｕ７３００２０，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ３３犃犵狉狅狆狔狉狅狀ｍａｔｅｒｉａｌｓｆｒｏｍｂｏｔｈａｔｈｏｍｅａｎｄａｂｒｏａｄｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙＩＳＳＲ
（ｉｎｔｅｒｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔｓ）ｍａｒｋｅｒｓ．Ｅｌｅｖｅｎｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍ９３ｐｒｉｍｅｒｓｗｈｉｃｈｈａｄｃｌｅａｒｐｏｌｙ
ｍｏｒｐｈｉｃｂａｎｄｓ．Ａｔｏｔａｌｏｆ８４ｂａｎｄｓｏｆｗｈｉｃｈ５９ｗｅｒｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍｔｈｅ３３ｍａｔｅｒｉａｌｓ．Ｏｎａｖ
ｅｒａｇｅ，ｅａｃｈｐｒｉｍｅｒａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｉｔｅｗａｓ７．６４．Ｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｏｆｖａｒｉｅｔｉｅｓｗａｓｂｅｔｗｅｅｎ
０．０８３ａｎｄ０．７０６，ａｎｄｓｈｏｗｅｄｒｉｃｈｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．ＵＰＧＭＡｃｌｕｓｔｅｒａｎａｌｙｓｉｓｇａｖｅａｇｅｎｅｔｉｃｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｃｏｅｆｆｉ
ｃｉｅｎｔｏｆ０．５２ｆｏｒｂｏｕｎｄａｒｉｅｓａｎｄｔｈｅ３３ｍａｔｅｒｉａｌｓｗｅｒｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｆｏｕｒｔｙｐｅｓ，ｗｉｔｈｂａｓｉｃｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇｉｎａｃｃｏｒｄ
ｗｉｔｈｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌｏｒｉｇｉｎａｎｄｒｅｇｉｏｎａｌｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犃犵狉狅狆狔狉狅狀；ＩＳＳＲｍａｒｋ；ｇｅｒｍｐｌａｓｍｒｅｓｏｕｒｃｅｓ；ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
７６２第２２卷第１期 草业学报２０１３年