全 文 ：书三角紫叶酢浆草犐犛犛犚反应体系的建立与优化
胡盨１，３，王永清２，陶炼２
（１．四川农业大学林学院，四川 雅安６２５０１４；２．四川农业大学园艺学院，四川 雅安６２５０１４；
３．四川省农业科学院生物技术核技术研究所，四川 成都６１００６６）
摘要：采用正交设计直观分析法，对影响三角紫叶酢浆草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应较大的５个因素（Ｍｇ２＋、Ｔａｑ酶、引物、模
板ＤＮＡ、ｄＮＴＰ）在５个水平上进行优化实验；从１００个随机引物中筛选出适宜的引物，并筛选出其最佳退火温度；
最后对反应程序进行优化。由此首次建立了适合三角紫叶酢浆草的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系：２５μＬ反应液中含１０
×ｂｕｆｆｅｒ２．５μＬ，Ｍｇ
２＋１．２５ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｔａｑ酶０．９Ｕ，引物０．３μｍｏｌ／Ｌ，模板ＤＮＡ６０～１００ｎｇ，ｄＮＴＰ０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ。
反应程序为：９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性５０ｓ，退火时间６０ｓ（根据不同引物选择对应最佳退火温度），７２℃延伸１．５
ｍｉｎ，循环４０次；７２℃延伸７ｍｉｎ，４℃保存。这一优化系统的建立为今后利用ＩＳＳＲ标记技术研究酢浆草属植物提
供理论依据和技术参考。
关键词：三角紫叶酢浆草；ＩＳＳＲ；反应体系
中图分类号：Ｑ９４６３３；Ｑ９４９．７５２．１　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１１）０５０１４２０９
　 三角紫叶酢浆草（犗狓犪犾犻狊狋狉犻犪狀犵狌犾犪狉犻狊）是酢浆草科（Ｏｘａｌｉｄａｃｅａｅ）酢浆草属（犗狓犪犾犻狊）多年生草本植物。其叶
片常年为紫红色，叶型奇特，形似飞舞的紫蝴蝶，花期长达数月，花朵白色点缀于紫叶之上别致醒目，是一种极具
观赏价值的彩叶植物。酢浆草属是一个世界性大属，主要分布于非洲和南美洲。国外对酢浆草属植物的研究报
道主要集中于其生物学特性研究、植物分类和系统进化［１］、次生代谢产物提取及结构功能分析［２，３］等领域。分子
标记技术应用于酢浆草属植物的报道主要针对安第斯山脉的块茎作物酢浆薯（犗狓犪犾犻狊狋狌犫犲狉狅狊犪）及其相近种开
展，涉及亲缘关系分析和系统分类［４，５］、遗传多样性分析［６９］、遗传退化［１０］和种质资源保护分析［７，９，１１］等方面。我
国也有较丰富的酢浆草属植物资源（包括本土种和外来种），在中国大陆由南到北及海南、香港和台湾地区都有广
泛的分布［１２］。相关研究主要局限于个别种类的快繁体系建立［１３，１４］和园林应用、植物分类和系统进化研究［１５１７］、
抗性生理研究［１８，１９］、生物入侵和土壤生态学研究［２０，２１］。国内利用分子标记对酢浆草属植物进行分类、种质资源
鉴定和遗传多样性的研究相对较少。
ＩＳＳＲ（ｉｎｔｅｒｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔｓ，简单重复序列区间）是由Ｚｉｅｋｉｅｗｉｃｚ等［２２］在ＳＳＲ（ｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｒｅｐｅａｔｓ）标记的基础上创建的分子标记技术。ＩＳＳＲ标记不依赖基因组序列信息，适用的物种广泛，多态性较
ＲＡＰＤ（ｒａｎｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ，随机扩增多态性ＤＮＡ）高，重复性更好而实验结果更可靠。该技
术现已广泛应用于植物（包括草本地被植物）的遗传作图、分子标记辅助育种、种质资源鉴定、遗传多样性分
析［２３，２４］、植物分类和系统进化分析、进化生物学及分子生态学等领域［２５］，但在酢浆草属植物上的应用研究报道较
少。Ｍａｌｉｃｅ等［７］和Ｐｉｓｓａｒｄ等［６，８，９］已将ＩＳＳＲ标记应用于南美洲的酢浆薯的遗传多样性研究，系列报道中ＩＳＳＲ
－ＰＣＲ（ＰＣＲ，ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，聚合酶链式反应）的技术参数均建立在Ｐｉｓｓａｒｄ等［６］的报道基础之上。
其中，ＩＳＳＲ－ＰＣＲ的引物选择参考了适用于稻属（犗狉狔狕犪）植物、硬粒小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿）和马铃薯（犛狅犾犪
狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿）等已开发的ＩＳＳＲ引物，供选引物基数仅２２个；ＰＣＲ反应体系的优化仅涉及引物浓度、ｄＮＴＰ浓
度和模板含量的２～３个水平，且各水平间梯度尺度较大，筛选较为粗放。
据现有资料看，在酢浆草属植物的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系优化方面，目前没有比上述更系统深入的报道，而
ＩＳＳＲ标记专门应用于三角紫叶酢浆草亦未见报道。基于此，本研究拟构建有关三角紫叶酢浆草的ＩＳＳＲ反应体
系，为利用ＩＳＳＲ分子标记技术研究该物种和酢浆草属植物提供理论依据和技术参考。
１４２－１５０
２０１１年１０月
　　　草　业　学　报　　　
　　　ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ　　　
第２０卷　第５期
Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．５
 收稿日期：２０１００６２９；改回日期：２０１００７２６
基金项目：四川省育种攻关项目（２００６ＹＺＧＧ０７１０）资助。
作者简介：胡盨（１９８４），女，四川成都人，硕士。Ｅｍａｉｌ：４０２８４２３０＠ｑｑ．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｙｑｗ１４＠ｓｉｃａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
１　材料与方法
１．１　材料
材料为三角紫叶酢浆草及其体细胞无性系变异株
系，样品于２００８年４月取自四川农业大学园艺生物技
术研究中心苗圃。采集当年新发尚未完全展开的嫩
叶，冰袋保存移至实验室。迅速吸干材料表面的水分
后，液氮研磨成粉状，ＥＰ管分装后保存于－７０℃超低
温冰箱以备用。
１．２　总基因组ＤＮＡ提取与检测
采用改良的ＣＴＡＢ（ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉ
ｕｍｂｒｏｍｉｄｅ，十六烷基三甲基溴化铵）法［２６，２７］提取材
料的总基因组ＤＮＡ，改良之处为用苯酚∶氯仿∶异戊
醇２５∶２４∶１抽提３次。ＤＮＡ风干后用灭菌ＴＥ缓
冲液溶解，０．８％琼脂糖凝胶电泳检测。ＴＥ缓冲液
（ＴＥｂｕｆｆｅｒ）是将ＴｒｉｓＨＣｌ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）用 ＨＣｌ调
节至ｐＨ＝８．０，再加ＥＤＴＡ缓冲液（１ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ＝
８．０）配成。ＥＤＴＡ缓冲液是由ＥＤＴＡＮａ２（ｅｔｈｙｌｅｎｅ
ｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄｄｉｓｏｄｉｕｍｓａｌｔ，乙二胺四乙酸
二钠盐）溶液用ＮａＯＨ调节ｐＨ配成。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ核
酸蛋白仪检测ＤＮＡ溶液的纯度，其 ＯＤ２６０／２８０值均在
１．８～２．０，满足ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应对ＤＮＡ模板质量的
要求。
１．３　ＰＣＲ扩增和反应体系优化设计
针对影响ＩＳＳＲ反应体系的主要因素 Ｍｇ２＋、Ｔａｑ
ＤＮＡ聚合酶、引物、模板ＤＮＡ、ｄＮＴＰ的浓度进行五
因素五水平Ｌ２５（５６）正交实验设计，各因素水平见表
１，实施方案见表２［已省略Ｌ２５（５６）正交设计表中的空
列］。反应液中除表１中所列外，还包括２．５μＬ１０×
ｂｕｆｆｅｒ（不含 Ｍｇ２＋），灭菌去离子水补足２５μＬ。先用
引物ＵＢＣ８１１进行正交设计扩增反应，反应程序初步
设定为：９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性５０ｓ，５８℃退火
４５ｓ，７２℃延伸１．５ｍｉｎ，４０次循环；７２℃延伸７ｍｉｎ；
４℃保存。产物用１．５％的琼脂糖凝胶电泳，ＥＢ（ｅｔｈｉｄ
ｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ，溴化乙锭）染色后在ＳＹＮＧＥＮＥＧｅｎｅ
Ｇｅｎｉｕｓ成像系统下照相。每处理均设置３次重复，分
别在完全相同条件下进行３个批次的ＰＣＲ扩增和电
泳检测。ＩＳＳＲ引物为加拿大的不列颠哥伦比亚大学
公布的序列，编号为 ＵＢＣ８０１～ＵＢＣ９００共１００个，由
上海生物工程有限公司合成。ＴａｑＤＮＡ聚合酶、１０×
Ｂｕｆｆｅｒ（不含 Ｍｇ２＋）、ＭｇＣｌ２（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）和ｄＮＴＰ
混合物（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）购自天根生化科技（北京）有限
表１　犐犛犛犚反应体系因素水平表
犜犪犫犾犲１　犉犪犮狋狅狉狊犪狀犱犾犲狏犲犾狊狅犳犐犛犛犚－犘犆犚狉犲犪犮狋犻狅狀
因素
Ｆａｃｔｏｒ
水平Ｌｅｖｅｌ
１ ２ ３ ４ ５
Ｍｇ２＋（ｍｍｏｌ／Ｌ） ０．７５ １．００ １．２５ １．５０ １．７５
ＴａｑＤＮＡ聚合酶
ＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｕ）
０．６ ０．９ １．２ １．５ １．８
引物Ｐｒｉｍｅｒ（μｍｏｌ／Ｌ） ０．１ ０．２ ０．３ ０．４ ０．５
ｄＮＴＰ（ｍｍｏｌ／Ｌ） ０．１０ ０．１５ ０．２０ ０．２５ ０．３０
模板ＤＮＡＴｅｍｐｌａｔｅＤＮＡ（ｎｇ） ２０ ４０ ６０ ８０ １００
表２　犐犛犛犚反应体系犔２５（５６）正交实验设计
犜犪犫犾犲２　犔２５（５６）狅狉狋犺狅犵狅狀犪犾犱犲狊犻犵狀犳狅狉犐犛犛犚－犘犆犚
编号
Ｎｏ．
Ｍｇ２＋
（ｍｍｏｌ／Ｌ）
ＴａｑＤＮＡ聚合酶
ＴａｑＤＮＡ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｕ）
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
（μｍｏｌ／Ｌ）
模板ＤＮＡ
Ｔｅｍｐｌａｔｅ
ＤＮＡ（ｎｇ）
ｄＮＴＰ
（ｍｍｏｌ／Ｌ）
１ ０．７５ ０．６ ０．１ ２０ ０．１０
２ ０．７５ ０．９ ０．２ ４０ ０．１５
３ ０．７５ １．２ ０．３ ６０ ０．２０
４ ０．７５ １．５ ０．４ ８０ ０．２５
５ ０．７５ １．８ ０．５ １００ ０．３０
６ １．００ ０．６ ０．２ ８０ ０．３０
７ １．００ ０．９ ０．３ １００ ０．１０
８ １．００ １．２ ０．４ ２０ ０．１５
９ １．００ １．５ ０．５ ４０ ０．２０
１０ １．００ １．８ ０．１ ６０ ０．２５
１１ １．２５ ０．６ ０．３ ４０ ０．２５
１２ １．２５ ０．９ ０．４ ６０ ０．３０
１３ １．２５ １．２ ０．５ ８０ ０．１０
１４ １．２５ １．５ ０．１ １００ ０．１５
１５ １．２５ １．８ ０．２ ２０ ０．２０
１６ １．５０ ０．６ ０．４ １００ ０．２０
１７ １．５０ ０．９ ０．５ ２０ ０．２５
１８ １．５０ １．２ ０．１ ４０ ０．３０
１９ １．５０ １．５ ０．２ ６０ ０．１０
２０ １．５０ １．８ ０．３ ８０ ０．１５
２１ １．７５ ０．６ ０．５ ６０ ０．１５
２２ １．７５ ０．９ ０．１ ８０ ０．２０
２３ １．７５ １．２ ０．２ １００ ０．２５
２４ １．７５ １．５ ０．３ ２０ ０．３０
２５ １．７５ １．８ ０．４ ４０ ０．１０
３４１第２０卷第５期 草业学报２０１１年
公司，扩增仪为ＢｉｏＲａｄ公司的ＰＴＣ２００和ｉＣｙｃｌｅｒ。采用正交设计直观分析法对实验结果进行评判打分［２８］。
将评分结果输入ＤＰＳ７．５５统计软件进行方差分析（随机区组模型）。
１．４　引物退火参数和反应程序参数筛选
根据正交实验结果确定合适的反应体系，在１００条引物中筛选出多态性好、扩增重复性好、谱带较多且清晰
的引物。根据引物的理论Ｔｍ（ｍｅｌｔｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ＤＮＡ解链温度）值，初步设定梯度温度范围为５０～６０℃进
行温度梯度ＰＣＲ以确定引物的最适退火温度。设置每个引物的每个梯度温度重复至少２次。退火时间和循环
次数分别设置３个梯度，即４５，６０和７０ｓ以及３５，４０和４５次，每个处理重复至少２次。
２　结果与分析
２．１　正交设计实验各因素对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ的影响
根据正交设计各处理反应结果的电泳图谱，其中１次重复的电泳图谱见图１，采用直观分析法对３个重复
（区组）的ＰＣＲ产物电泳结果独立评分，将每个重复的２５个处理从高到低依次打分。扩增条带越多、亮度越强、
弥散越少则评分越高，反之评分越低；最高记２５分，最低记１分。３次重复电泳图谱的直观评分结果见表３。
图１　三角紫叶酢浆草犐犛犛犚反应体系正交设计实验结果电泳图谱
犉犻犵．１　犜犺犲犲犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊狉犲狊狌犾狋狊狅犳犐犛犛犚－犘犆犚狅狉狋犺狅犵狅狀犪犾犱犲狊犻犵狀犳狅狉犗．狋狉犻犪狀犵狌犾犪狉犻狊
引物ＵＢＣ８１１ＰｒｉｍｅｒＵＢＣ８１１；１～２５：处理编号，对应表２ＴｒｅａｔｍｅｎｔＮｏ．ｗｈｉｃｈｗａｓｓｈｏｗｅｄｉｎＴａｂｌｅ２；Ｍ：分子量标准ＤＮＡｌａｄｄｅｒｍａｒｋｅｒ．
　　评分的方差分析结果见表４。由犉值可知，该
正交设计中５个因素对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应影响从大
到小依次为：Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰ、引物、Ｔａｑ 酶、模板
ＤＮＡ。区组（重复）间的差异不显著，证明３次重复
评分结果有较强的一致性。２５个处理间多重比较
（新复极差法）表明，处理１１（直观评分结果均值为
２４．７，下同）和处理２３（均值２４．３）为最优处理且两
者差异不显著；处理１２（均值２２．７）和处理２２（均值
２２．３）次之。由于各因素水平间的差异极显著，可以
在因素内进行多重比较。
Ｍｇ２＋浓度对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ影响最大。评分结果
均值随 Ｍｇ２＋浓度增加呈增加趋势（图２），５个浓度
之间差异达极显著水平。Ｍｇ２＋浓度为０．７５～１．００
ｍｍｏｌ／Ｌ（处理１～１０），扩增结果虽有条带但数目较
少且淡弱；Ｍｇ２＋浓度为１．２５～１．７５ｍｍｏｌ／Ｌ（处理
１１～２５），条带数相对增加且更加明亮清晰，尤其以
表３　电泳图谱的直观评分结果
犜犪犫犾犲３　犜犺犲犵狉犪犱犻狀犵狉犲狊狌犾狋狊狅犳狋犺犲犲犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊
处理编号
ＴｒｅａｔｍｅｎｔＮｏ．
重复编号ＲｅｐｅａｔＮｏ．
１ ２ ３
处理编号
ＴｒｅａｔｍｅｎｔＮｏ．
重复编号ＲｅｐｅａｔＮｏ．
１ ２ ３
１ １ １ １ １４ １０ １０ １２
２ ８ ６ ６ １５ １９ １８ １６
３ ６ ８ ８ １６ １８ １７ １７
４ ７ ８ ７ １７ １４ １４ １２
５ ６ ７ ６ １８ １２ １３ １２
６ １２ １１ １２ １９ ８ ７ ９
７ ９ ６ ８ ２０ ９ ８ ９
８ ７ ８ ７ ２１ ９ １０ １０
９ ３ ２ ３ ２２ ２２ ２２ ２３
１０ ６ ７ ６ ２３ ２１ ２０ ２０
１１ ２５ ２４ ２５ ２４ １４ １３ １５
１２ ２５ ２４ ２３ ２５ ４ ３ ３
１３ ４ ３ ３
４４１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．５
１．２５ｍｍｏｌ／Ｌ突出（图１）。反应液中游离 Ｍｇ２＋直接
影响Ｔａｑ酶的活性、引物与模板的结合效率和产物特
异性。由于 Ｍｇ２＋能与多种带负电荷的基团结合，反
应液中游离的 Ｍｇ２＋ 浓度会随反应液成分变化而变
化。因此，确定合适的 Ｍｇ２＋浓度对三角紫叶酢浆草
ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应至关重要。由上述最优处理（处理
１１，１２）可以看出，适宜的 Ｍｇ２＋浓度为１．２５ｍｍｏｌ／Ｌ。
ｄＮＴＰ浓度对反应结果的影响仅次于 Ｍｇ２＋（表
４）。评分结果均值随ｄＮＴＰ浓度增加明显提高；当
ｄＮＴＰ浓度达０．３０ｍｍｏｌ／Ｌ时，结果均值有减少趋势
（图３）。当ｄＮＴＰ浓度为０．１０ｍｍｏｌ／Ｌ（处理１，７，
１３，１９，２５）时，产物条带弱而模糊（图１）；当浓度为
０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ（处理４，１０，１１，１７，２３）时，条带数目多
且清晰明亮。０．２０和０．３０ｍｍｏｌ／Ｌ浓度结果差异显
著，其余各水平间差异极显著。参考上述最优处理，确
定ｄＮＴＰ浓度为０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ。
表４　犘犆犚反应各因素间方差分析表
犜犪犫犾犲４　犞犪狉犻犪狀犮犲犪狀犪犾狔狊犻狊犳狅狉犳犪犮狋狅狉狊狅犳犘犆犚狉犲犪犮狋犻狅狀
变异来源
Ｓｏｕｒｃｅ
平方和
ＳＳ
自由度
ＤＦ
均方
ＭＳ
犉值
犉ｖａｌｕｅ
镁离子 Ｍｇ２＋ １２８５．３８６７ ４ ３２１．３４６７ ４８８．５３３８
Ｔａｑ酶
Ｔａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
３６７．７８６７ ４ ９１．９４６７ １３９．７８３８
引物Ｐｒｉｍｅｒ ４３０．４５３３ ４ １０７．６１３３ １６３．６０１４
模板ＤＮＡＴｅｍｐｌａｔｅ
ＤＮＡ
７３．２５３３ ４ １８．３１３３ ２７．８４１２
混合脱氧核苷酸
ｄＮＴＰ
１０５９．１２００ ４ ２６４．７８００ ４０２．５３７２
区组Ｂｌｏｃｋ ２．４２６７ ２ １．２１３３ １．８４４５
误差Ｅｒｒｏｒ ３１．５７３３ ４８ ０．６５７８
总和 Ｔｏｔａｌ ３４９９．７８６７
　注：代表在０．０１水平上差异显著。
　Ｎｏｔｅ： ｍｅａｎｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔｔｈｅ０．０１ｌｅｖｅｌ．
图２　犕犵２＋浓度与评分结果均值的关系
犉犻犵．２　犚犲犾犪狋犻狅狀狊犺犻狆犫犲狋狑犲犲狀犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀
狅犳犕犵２＋犪狀犱狋犺犲犿犲犪狀狅犳犵狉犪犱犻狀犵狉犲狊狌犾狋
图３　犱犖犜犘浓度与评分结果均值的关系
犉犻犵．３　犚犲犾犪狋犻狅狀狊犺犻狆犫犲狋狑犲犲狀犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀
狅犳犱犖犜犘犪狀犱狋犺犲犿犲犪狀狅犳犵狉犪犱犻狀犵狉犲狊狌犾狋
引物浓度对扩增产物也有较大影响：浓度不足，ＰＣＲ扩增效率低；浓度偏高则错配、非特异性扩增和生成引
物二聚体的几率增加（图４）。引物浓度对不同分子量片段的扩增具有选择性。在扩增结果图谱（图１）中，引物
浓度为０．１μｍｏｌ／Ｌ（处理１，１０，１４，１８，２２）和０．２μｍｏｌ／Ｌ（处理２，６，１５，１９，２３）时，几乎没有分子量小于３００ｂｐ
的片段，而大于１０００ｂｐ的片段明显存在；浓度高于０．３μｍｏｌ／Ｌ的处理均能观察到小于３００ｂｐ的片段；浓度达
０．５μｍｏｌ／Ｌ（处理５，９，１３，１７，２１），几乎没有大于１０００ｂｐ清晰明亮的片段。说明引物浓度低时有利于扩增大片
段，引物浓度高时有利于扩增小片段。多重比较表明，除浓度０．１和０．４μｍｏｌ／Ｌ差异不显著外，其余浓度水平间
差异极显著。结合上述最优处理参数综合考虑，确定引物浓度为０．３μｍｏｌ／Ｌ。
Ｔａｑ酶在０．６～０．９Ｕ（图１和５），扩增产物弥散少、条带丰富且明亮清晰，评分结果均值随酶量增加而增加。
Ｔａｑ酶量继续增加，条带弥散程度增加，非特异性产物增多，酶量超过０．９Ｕ后结果均值逐渐降低。１．５和１．８Ｕ
之间结果差异显著，其余各水平间差异达极显著。从保证扩增结果和酶量充足综合考虑，确定２５μＬ反应液含
Ｔａｑ酶０．９Ｕ。
５４１第２０卷第５期 草业学报２０１１年
图４　引物浓度与评分结果均值的关系
犉犻犵．４　犚犲犾犪狋犻狅狀狊犺犻狆犫犲狋狑犲犲狀犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狅犳
狆狉犻犿犲狉犪狀犱狋犺犲犿犲犪狀狅犳犵狉犪犱犻狀犵狉犲狊狌犾狋
图５　犜犪狇酶浓度与评分结果均值的关系
犉犻犵．５　犚犲犾犪狋犻狅狀狊犺犻狆犫犲狋狑犲犲狀狇狌犪狀狋犻狋狔狅犳犜犪狇
狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲犪狀犱狋犺犲犿犲犪狀狅犳犵狉犪犱犻狀犵狉犲狊狌犾狋
　　模板ＤＮＡ量对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应影响最小（表４）。
图６　模板犇犖犃量与评分结果均值的关系
犉犻犵．６　犚犲犾犪狋犻狅狀狊犺犻狆犫犲狋狑犲犲狀狇狌犪狀狋犻狋狔狅犳狋犲犿狆犾犪狋犲
犇犖犃犪狀犱狋犺犲犿犲犪狀狅犳犵狉犪犱犻狀犵狉犲狊狌犾狋
在所设水平范围内，反应结果评分均值波动不剧烈（图
６）。因素内多重比较表明，除１００ｎｇ达到极显著外，
其他各水平结果均值差异都不显著。可见，选择ＤＮＡ
量在６０～１００ｎｇ内均可获得较好的扩增效果。
２．２　退火温度对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ的影响
ＩＳＳＲ引物序列较长（１７～２４ｂｐ），不同引物的最
佳退 火 温 度 差 异 较 大。同 样 的 实 验 条 件，引 物
ＵＢＣ８１８和 ＵＢＣ８９９（表５）的扩增结果差异很大（图
７）。例如引物 ＵＢＣ８９９，退火温度为５０．８和５０．０℃
时，虽然大片段得到扩增，但背景很弥散，特异性差；退
火温度高于５６．４℃后，扩增条带减少且亮度变弱，大
片段明显减少而小片段增多。８个梯度温度中，引物
ＵＢＣ８９９的最佳退火温度为５３．９℃。选出的适合三
图７　不同退火温度对犐犛犛犚－犘犆犚产物的影响
犉犻犵．７　犜犺犲犲犳犳犲犮狋狅犳犪狀狀犲犪犾犻狀犵狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲狅狀犐犛犛犚－犘犆犚犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀
　１～８：退火温度依次为６０．０，５９．５，５８．３，５６．４，５３．９，５２．１，５０．８和５０．０℃。１－８：Ｔｈｅａｎｎｅａｌｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｗｅｒｅ６０．０，５９．５，５８．３，５６．４，
５３．９，５２．１，５０．８ａｎｄ５０．０℃，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
６４１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．５
角紫叶酢浆草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ的引物及其最佳退火温度见表５。
２．３　退火时间对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ的影响
退火时间对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增结果有影响，部分引物退火时间筛选结果见图８。引物ＵＢＣ９００和ＵＢＣ８５２的
退火时间为４５ｓ时扩增不完全或有弥散；为７０ｓ时，弥散加重；６０ｓ时条带完整明亮且无弥散背景。而ＵＢＣ８３５
３种退火时间的结果差异不明显。由此推断，引物退火时间会因引物序列不同而有所差异。根据实验结果综合
考虑，确定退火时间为６０ｓ。
２．４　循环次数对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ的影响
ＩＳＳＲ－ＰＣＲ循环次数对扩增产物量有影响（图９）。循环次数偏少，产物扩增不完全，条带不明亮；循环次数
偏多，错配几率增加，非特异性产物增多，条带易弥散；循环次数还受各反应成分的用量限制。以引物 ＵＢＣ９００
和ＵＢＣ８９９为例，循环次数为３５，条带有缺失且较弱，循环次数为４５的产物弥散严重，循环次数为４０的产物效
果在上述两者之间。ＵＢＣ８１８只有在循环次数为３５时扩增产物主带和非主带效果均较好。综合考虑大多数引
物的扩增效果，选择循环次数为４０次。
图８　不同退火时间对犐犛犛犚－犘犆犚产物的影响
犉犻犵．８　犜犺犲犲犳犳犲犮狋狅犳犪狀狀犲犪犾犻狀犵狋犻犿犲狅狀犐犛犛犚－犘犆犚
１～３：退火时间依次为４５，６０和７０ｓ。
１－３：Ｔｈｅａｎｎｅａｌｉｎｇｔｉｍｅｓｗｅｒｅ４５，６０ａｎｄ７０ｓ．
图９　不同循环次数对犐犛犛犚－犘犆犚产物的影响
犉犻犵．９　犜犺犲犲犳犳犲犮狋狅犳犮狔犮犾犲狋犻犿犲狊狅狀犐犛犛犚－犘犆犚
１～３：循环次数依次为３５，４０和４５次。
１－３：Ｔｈｅｃｙｃｌｅｔｉｍｅｓｗｅｒｅ３５，４０ａｎｄ４５ｔｉｍｅｓ．
综合上述分析，经过优化后的三角紫叶酢浆草ＩＳＳＲ反应体系如下：２５μＬ反应体系中含１０×ｂｕｆｆｅｒ２．５μＬ，
Ｍｇ２＋１．２５ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｔａｑ酶０．９Ｕ，引物０．３μｍｏｌ／Ｌ，模板ＤＮＡ８０ｎｇ，ｄＮＴＰ０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ。反应程序为：９４℃
预变性５ｍｉｎ；９４℃变性５０ｓ，退火时间６０ｓ（表５），７２℃延伸１．５ｍｉｎ，循环４０次；７２℃延伸７ｍｉｎ，４℃保存。
２．５　优化ＩＳＳＲ－ＰＣＲ体系的验证
采用优化后的ＩＳＳＲ反应体系，以三角紫叶酢浆草野生型和其体细胞无性系变异株系为材料，用不同引物分
别扩增进行验证（图１０）（差异性条带用箭头标出）。可以看出，扩增产物电泳条带丰富并且清晰明亮。其中，引
物ＵＢＣ８２２、ＵＢＣ８７９、ＵＢＣ８５４、ＵＢＣ８６８能明显稳定地反映出２种材料基因组ＤＮＡ之间的差异。由此证明，优
化后的ＩＳＳＲ反应体系很灵敏，可有效检测三角紫叶酢浆草的变异株系。
３　讨论
ＰＣＲ反应受诸多因素的影响：ＰＣＲ反应体系成分、引物退火条件、反应程序等。在反应液各因素中，ｄＮＴＰ
作为ＰＣＲ反应的“原料”，其浓度不足则扩增不完全，其浓度升高会降低反应液中自由 Ｍｇ２＋的浓度［２９］而影响
Ｔａｑ酶活性，进而影响扩增。本实验中ｄＮＴＰ浓度对产物的影响很大，这与紫椴（犜犻犾犻犪犪犿狌狉犲狀狊犻狊）［３０］和北美驼
绒藜（犆犲狉犪狋狅犻犱犲狊犾犪狀犪狋犪）［３１］ＩＳＳＲ体系优化研究结果一致。但在枇杷（犈狉犻狅犫狅狋狉狔犪犼犪狆狅狀犻犮犪）［２７］和水曲柳（犉狉犪狓犻
狀狌狊犿犪狀犱狊犺狌狉犻犮犪）［３２］上，ｄＮＴＰ对产物结果影响却很小，可能与不同物种和不同因素水平设计有关。
７４１第２０卷第５期 草业学报２０１１年
表５　优选犐犛犛犚引物及其最适退火温度
犜犪犫犾犲５　犜犺犲狅狆狋犻犿犪犾犪狀狀犲犪犾犻狀犵狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲狅犳狊犲犾犲犮狋犲犱狆狉犻犿犲狉狊犳狅狉犐犛犛犚－犘犆犚
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
引物序列（５′→３′）
Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ
（５′→３′）
最佳退火温度
Ｍｏｓｔｓｕｉｔａｂｌｅ
Ｔａ（℃）
解链温度
Ｔｍ
（℃）
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
引物序列（５′→３′）
Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ
（５′→３′）
最佳退火温度
Ｍｏｓｔｓｕｉｔａｂｌｅ
Ｔａ（℃）
解链温度
Ｔｍ
（℃）
ＵＢＣ８１１ ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＣ ５８．３ ５２ ＵＢＣ８５２ ＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＲＡ ５３．９ ５２
ＵＢＣ８１３ ＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＴ ５３．９ ５０ ＵＢＣ８５４ ＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＲＧ ５８．３ ５８
ＵＢＣ８１５ ＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＧ ５３．９ ５２ ＵＢＣ８５６ ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＹＡ ５９．５ ５４
ＵＢＣ８１８ ＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＧ ５８．３ ５３ ＵＢＣ８６８ ＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ ５０．８ ４８
ＵＢＣ８２２ ＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＡ ５８．３ ５０ ＵＢＣ８７３ ＧＡＣＡＧＡＣＡＧＡＣＡＧＡＣＡ ５８．３ ４８
ＵＢＣ８２３ ＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＣ ５０．０ ５２ ＵＢＣ８７６ ＧＡＴＡＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＣＡ ５３．９ ４０
ＵＢＣ８２５ ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＴ ５０．０ ５０ ＵＢＣ８７９ ＣＴＴＣＡＣＴＴＣＡＣＴＴＣＡ ５０．８ ４２
ＵＢＣ８２６ ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＣ ６０．０ ５２ ＵＢＣ８８０ ＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡ ５３．９ ４８
ＵＢＣ８３５ ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＴＣ ５８．３ ５８ ＵＢＣ８８１ ＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧ ５９．５ ５４
ＵＢＣ８４０ ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＹＴ ５６．４ ５６ ＵＢＣ８９５ ＡＧＡＧＴＴＧＧＴＡＧＣＴＣＴＴＧＡＴＣ ５３．９ ５８
ＵＢＣ８４１ ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＹＣ ５３．９ ５８ ＵＢＣ８９９ ＣＡＴＧＧＴＧＴＴＧＧＴＣＡＴＴＧＴＴＣＣＡ ５３．９ ６４
ＵＢＣ８４９ ＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＹＡ ５６．４ ５６ ＵＢＣ９００ ＡＣＴＴＣＣＣＣＡＣＡＧＧＴＴＡＡＣＡＣＡ ５２．１ ６２
　注：Ｙ＝Ｃ或 Ｔ；Ｒ＝Ａ或 Ｇ；Ｔａ：退火温度；Ｔｍ：解链温度。
　Ｎｏｔｅ：Ｙ＝（Ｃ，Ｔ）；Ｒ＝（Ａ，Ｇ）；Ｔａ：Ａｎｎｅａｌｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ；Ｔｍ：Ｍｅｌｔｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ．
图１０　优化后的犐犛犛犚－犘犆犚体系对三角紫叶酢浆草及其体细胞无性系变异株系的扩增结果
犉犻犵．１０　犜犺犲犲犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊狉犲狊狌犾狋狊狌狊犻狀犵狋犺犲狅狆狋犻犿犻狕犲犱犐犛犛犚－犘犆犚狉犲犪犮狋犻狅狀狊狔狊狋犲犿犳狅狉犗．狋狉犻犪狀犵狌犾犪狉犻狊
Ｗ：野生型 Ｗｉｌｄｔｙｐｅ；Ｖ：变异型Ｔｈｅｍｕｔａｎｔ；Ｍ：分子量标准ＤＮＡｌａｄｄｅｒｍａｒｋｅｒ；箭头所指为差异性条带Ａｒｒｏｗｓｐｏｉｎｔｅｄｔｏｓｐｅｃｉｆｉｃｂａｎｄｓ．
　　ＩＳＳＲ不同引物的退火温度差异很大是ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应的突出特点。一般而言，退火温度偏低会使引物与
模板非特异性结合的几率增大，错配扩增增加，产物条带数目增加，结果可信度降低；退火温度过高，ＰＣＲ反应特
异性增强，产物条带数目降低，大片段扩增减少。因此，在允许的范围内选择较高的退火温度可减少引物和模板
之间的非特异性结合，提高ＰＣＲ反应的特异性［３３］。本实验引物退火温度筛选过程中，也出现了部分引物（如
ＵＢＣ８１８、ＵＢＣ８５６及ＵＢＣ８９１）退火温度范围在５０～６０℃内，温度越高，条带数目越多的情况，需重新调整梯度温
度范围来寻找最佳退火温度。在实验结果中发现，相同的引物，不同ＤＮＡ模板其退火温度也有差异。例如，同
样的引物序列（ＵＢＣ８１１），酢浆草属的不同种（犗．狋狉犻犪狀犵狌犾犪狉犻狊和犗．狋狌犫犲狉狅狊犪），最适退火温度分别是５８．３和
５０．０℃，相差甚远［６］。可能是因为ＤＮＡ溶液含有的其他成分影响ＰＣＲ反应体系进而影响引物与模板结合能
力，造成退火温度的变化。一些文献［３４，３５］指出用公式Ｔｍ＝２℃×（Ａ＋Ｔ）＋４℃×（Ｃ＋Ｇ）计算出ＤＮＡ解链温
度（公式中的Ａ，Ｔ，Ｃ和Ｇ分别指引物中腺嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶和鸟嘌呤碱基的含量），上下浮动１～３℃得
到引物的理论退火温度则接近引物的退火温度；将Ｔｍ值和通过实验选出的最适退火温度比对，并无明显规律
性，这与Ｐｉｓｓａｒｄ等［６］、付燕等［２７］的结论一致。
目前优化ＩＳＳＲ体系的研究中都多采用温度梯度ＰＣＲ方法寻找引物的最佳退火温度，这种方法受到ＰＣＲ扩
８４１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．５
增仪机型和其温度梯度自动生成方式（每个温度点之间温度梯度距离不均等）的限制，对某些特异性较差的引物
效率则较低。例如，ｉＣｙｃｌｅｒ扩增仪第４和第５温度点之间相差达２．５℃，第１和第２温度点之间相差仅０．５℃，得
到的扩增结果仅代表８个退火温度点的情况（图７）。近几年来，降落ＰＣＲ（ｔｏｕｃｈｄｏｗｎＰＣＲ，ＴＤ－ＰＣＲ）［３６］被越
来越多应用于有非特异性产物和没有适宜退火温度等的情况，例如，刘丽丽等［３７］用梯度温度ＰＣＲ和ＴＤ－ＰＣＲ
相结合的方式高效地优化了东南石栎ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系。又如，本实验中很难找到引物 ＵＢＣ８６８的最适退
火温度，以梯度温度扩增结果作参考，改用降落ＰＣＲ能迅速得到满意的扩增效果。
经过本实验优选对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应影响较大的因素水平组合、筛选引物退火条件和优化反应程序，得到三
角紫叶酢浆草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增电泳图谱清晰而稳定、重复性好，能迅速有效地检测出无性系变异株系与野生型
之间的差异。随着进一步深入细致的研究，将会找到更多合适的引物，提高ＩＳＳＲ标记在种间、种内居群间等水
平的鉴别速度和灵敏度，为物种的鉴定和种质资源的确立提供更有力的分子生物学证据［３８］。
酢浆草属植物富含花色素苷、维生素Ｃ和草酸，除观赏价值外，还具有食用、药用和工业原料［２，９，３９］等潜在价
值，均待开发利用。三角紫叶酢浆草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的建立，填补了国内酢浆草属植物分子标记的空白，
为利用分子标记技术研究酢浆草属植物（特别是三角紫叶酢浆草）的分类、种质资源鉴定和遗传多样性等提供了
理论依据并奠定了技术基础。
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犫犲狉狅狊犪）ｒｅｖｅａｌｓｔｗｏｐｏｔｅｎｔｉａｌｍａｔｅｒｎａｌｇｅｎｏｍｅｃｏｎｔｒｉｂｕｔｏｒｓ［Ａ］．ＦａｌＲｅｓｅａｒｃｈＳｙｍｐｏｓｉｕｍ［Ｃ］．Ｓｔ．Ｔｈｏｍａｓ（ＵＳＶＩ）：Ｕｎｉｖｅｒ
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ｉｎｔｒａｍｏｒｐｈｏｔｙｐｅｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｎｄｔｈｅｓｐａｔｉａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆ犗狓犪犾犻狊狋狌犫犲狉狅狊犪Ｍｏｌ．［Ｊ］．Ｇｅｎｅｔｉｃａ，２００８，１３２（１）：７１８５．
［９］　ＰｉｓｓａｒｄＡ，ＲｏｊａｓＢｅｌｔｒａｎＪＡ，ＦａｕｘＡＭ，犲狋犪犾．Ｅｖｉｄｅｎｃｅｏｆｉｎｔｒａｖａｒｉｅｔａｌｇｅｎｅｔｉｃｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙｉｎｔｈｅｖｅｇｅｔａｔｉｖｅｌｙｐｒｏｐａｇａｔｅｄｃｒｏｐｏｃａ
（犗狓犪犾犻狊狋狌犫犲狉狅狊犪Ｍｏｌ．）ｉｎｔｈｅＡｎｄｅａｎｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｆａｒｍｉｎｇｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＳｙｓｔｅｍａｔｉｃｓａｎｄＥｖｏｌｕｔｉｏｎ，２００８，２７０（１２）：５９７４．
［１０］　ＴａｐｉａＣ，ＥｓｔｒｅｌａＪ．Ｇｅｎｅｔｉｃｅｒｏｓｉｏｎｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎｕｌｕｃｕｓ（犝犾犾狌犮狌狊狋狌犫犲狉狅狊狌狊Ｃａｌｄａｓ），ｏｃａ（犗狓犪犾犻狊狋狌犫犲狉狅狊犪 Ｍｏｌ．）ａｎｄｍａｓｈｕａ
（犜狉狅狆犪犲狅犾狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿Ｒ．＆Ｐ．）ｉｎａｇｒｏｓｙｓｔｅｍｓｏｆｔｈｅｐｒｏｖｉｎｃｅｓｏｆＣａａｒ，ＣｈｉｍｂｏｒａｚｏａｎｄＴｕｎｇｕｒａｈｕａ，Ｅｃｕａｄｏｒ［Ａ］．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ
ｏｆｔｈｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳｙｍｐｏｓｉｕｍ“ＭａｎａｇｉｎｇＢｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＥｃｏｓｙｓｔｅｍｓ”［Ｃ］．Ｍｏｎｔｒｅａｌ：ＵｎｉｔｅｄＮａｔｉｏｎｓＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｔｈｅ
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ＨＵＳｕ１，３，ＷＡＮＧＹｏｎｇｑｉｎｇ２，ＴＡＯＬｉａｎ２
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犃犫狊狋狉犪犮狋：ＡｎｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｄｅｓｉｇｎｗａｓｕｓｅｄｔｏｏｐｔｉｍｉｚｅａｎＩＳＳＲ（ｉｎｔｅｒｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔｓ）－ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒ
ａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｆｏｒ犗狓犪犾犻狊狋狉犻犪狀犵狌犾犪狉犻狊，ｉｎｖｏｌｖｉｎｇｆｉｖｅｌｅｖｅｌｓｏｆｆｉｖｅｍａｉｎｆａｃｔｏｒｓ
（Ｍｇ２＋，ＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ｐｒｉｍｅｒ，ｔｅｍｐｌａｔｅＤＮＡａｎｄｄＮＴＰ）．Ｔｈｅａｎｎｅａｌｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｆｓｕｉｔａｂｌｅ
ｐｒｉｍｅｒｓ，ｗｈｉｃｈｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍ１００ｒａｎｄｏｍＩＳＳＲｐｒｉｍｅｒｓ，ｗａｓｏｐｔｉｍｉｚｅｄａｎｄｔｈｅｒｅａｃｔｉｏｎｐｒｏｇｒａｍｗａｓｉｍ
ｐｒｏｖｅｄｓｏｔｈａｔａｓｕｉｔａｂｌｅＩＳＳＲ－ＰＣＲｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｆｏｒ犗．狋狉犻犪狀犵狌犾犪狉犻狊ｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｔｈｅｒｅａｃｔｉｏｎｓｗｅｒｅ
ｐｅｒｆｏｒｍｅｄｉｎａ２５μＬｖｏｌｕｍｅｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ２．５μＬ１０×ｂｕｆｆｅｒ，１．２５ｍｍｏｌ／ＬＭｇ
２＋，０．９ＵＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，
０．３μｍｏｌ／Ｌｐｒｉｍｅｒ，６０～１００ｎｇｔｅｍｐｌａｔｅＤＮＡ，ａｎｄ０．２５ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ．Ｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｒｅａｃｔｉｏｎｐｒｏｇｒａｍ
ｗａｓ：９４℃ｆｏｒ５ｍｉｎ，ｆｏｌｏｗｅｄｂｙ４０ｃｙｃｌｅｓｏｆ９４℃ｆｏｒ５０ｓ，ａｎｎｅａｌｉｎｇａｔａｓｕｉｔａｂｌｅｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｆｏｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｐｒｉｍｅｒｓｆｏｒ６０ｓ，７２℃ｆｏｒ１．５ｍｉｎ，ｅｘｔｅｎｓｉｏｎａｔ７２℃ｆｏｒ７ｍｉｎａｎｄｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎａｔ４℃．Ｔｈｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆ
ｔｈｉｓｓｙｓｔｅｍｐｒｏｖｉｄｅｓａｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｂａｓｉｓａｎｄｔｅｃｈｎｉｃａｌｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｔｈｅｇｅｎｕｓ犗狓犪犾犻狊ｂｙ
ＩＳＳＲｍａｒｋｅｒｓ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犗狓犪犾犻狊狋狉犻犪狀犵狌犾犪狉犻狊；ＩＳＳＲ；ｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ
０５１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．５