全 文 ：书犇犗犐：１０．１１６８６／犮狔狓犫２０１５０４１８ 犺狋狋狆：／／犮狔狓犫．犾狕狌．犲犱狌．犮狀
李州，彭燕．亚精胺对水分胁迫下白三叶脯氨酸代谢、抗氧化酶活性及其基因表达的影响．草业学报，２０１５，２４（４）：１４８１５６．
ＬｉＺ，ＰｅｎｇＹ．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅｏｎｐｒｏｌｉｎｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｗｈｉｔｅｃｌｏｖｅｒｌｅａｖｅｓｕｎｄｅｒｗａｔｅｒｓｔｒｅｓｓ．
ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１５，２４（４）：１４８１５６．
亚精胺对水分胁迫下白三叶脯氨酸代谢、
抗氧化酶活性及其基因表达的影响
李州，彭燕
（四川农业大学动物科技学院草业科学系，四川 雅安６２５０１４）
摘要：以广泛栽培的“拉丁诺”白三叶为供试材料，对其在不同水分胁迫处理下叶片相对含水量、活性氧成分、膜脂
过氧化产物、抗氧化酶活性、脯氨酸含量及其代谢酶活性等生理指标进行测定，并利用ＲＴ－ＰＣＲ技术分析４种抗
氧化酶基因在不同胁迫条件下的表达特性，分析外源亚精胺缓减水分胁迫的效应。结果表明，水分胁迫下白三叶
叶片相对含水量逐步降低，活性氧和丙二醛含量不断升高，外源亚精胺能显著提高胁迫下叶片相对含水量，有效降
低活性氧和膜脂过氧化产物的积累；外源亚精胺使水分胁迫下白三叶抗氧化酶活性和基因表达量发生改变，提高
了水分胁迫下白三叶叶片超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）、过氧化氢酶（ＣＡＴ）、过氧化物酶（ＰＯＤ）和抗坏血酸过氧化酶
（ＡＰＸ）基因的表达从而提高抗氧化酶活性，缓解了水分胁迫造成的氧化胁迫伤害；外源亚精胺提高了脯氨酸合成
代谢关键酶Δ’吡咯啉５羧酸合成酶（Ｐ５ＣＳ）和分解代谢关键酶脯氨酸脱氢酶（ＰｒｏＤＨ）活性，促进了水分胁迫下脯
氨酸的代谢，但对脯氨酸合成代谢鸟氨酸途径中关键酶———鸟氨酸转氨酶（ＯＡＴ）没有影响。外源亚精胺能有效提
高白三叶的抗水分胁迫能力，这与亚精胺诱导了胁迫下白三叶抗氧化酶基因表达，提高抗氧化酶活性和促进脯氨
酸的代谢从而减轻由水分胁迫造成的氧化伤害、稳定了细胞膜系统及提高渗透调节能力密切相关。
关键词：白三叶；亚精胺；水分胁迫；抗氧化酶；基因表达；脯氨酸　　
犈犳犳犲犮狋狊狅犳狊狆犲狉犿犻犱犻狀犲狅狀狆狉狅犾犻狀犲犿犲狋犪犫狅犾犻狊犿，犪狀狋犻狅狓犻犱犪狀狋犲狀狕狔犿犲犪犮狋犻狏犻狋狔犪狀犱犵犲狀犲
犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀犻狀狑犺犻狋犲犮犾狅狏犲狉犾犲犪狏犲狊狌狀犱犲狉狑犪狋犲狉狊狋狉犲狊狊
ＬＩＺｈｏｕ，ＰＥＮＧＹａｎ
犆狅犾犾犲犵犲狅犳犃狀犻犿犪犾犛犮犻犲狀犮犲犪狀犱犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔，犛犻犮犺狌犪狀犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犢犪’犪狀６２５０１４，犆犺犻狀犪
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ（Ｓｐｄ）ｏｎｒｅｌａｔｉｖｅｗａｔｅｒｃｏｎｔｅｎｔ，ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎ，ｍｅｍｂｒａｎｅｌｉｐｉｄｐｒｅｏｘｉ
ｄａｔｉｏｎ，ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｐｒｏｌｉｎｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄｉｎｗｈｉｔｅｃｌｏｖｅｒ（犜狉犻犳狅犾犻狌犿狉犲狆犲狀狊）
ｌｅａｖｅｓ，ｃｕｌｔｉｖａｒ‘Ｌａｄｉｎｏ’．Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｓｏｆｆｏｕｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｅｎｚｙｍｅｇｅｎｅｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｕ
ｓｉｎｇｓｅｍｉｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＲＴ－ＰＣＲｕｎｄｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｗａｔｅｒｓｔｒｅｓｓ．Ｕｎｄｅｒｗａｔｅｒｓｔｒｅｓｓ，ｒｅｌａｔｉｖｅｗａｔｅｒｃｏｎｔｅｎｔｇｒａｄ
ｕａｌｙｄｅｃｌｉｎｅｄｗｈｅｒｅａｓｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎａｎｄｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ（ＭＤＡ）ｃｏｎｔｅｎｔｉｎｃｒｅａｓｅｄ．ＥｘｏｇｅｎｏｕｓＳｐｄｓｉｇｎｉｆｉ
ｃａｎｔｌｙｉｍｐｒｏｖｅｄｒｅｌａｔｉｖｅｗａｔｅｒｃｏｎｔｅｎｔａｎｄｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｒｅｄｕｃｅｄｔｈｅａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎａｎｄＭＤＡ．
ＥｘｏｇｅｎｏｕｓＳｐｄｃｈａｎｇｅｄａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｉｅｓａｎｄｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｕｎｄｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｗａｔｅｒｓｔｒｅｓｓｒｅｇｉｍｅｓ
ａｎｄｉｎｃｒｅａｓｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ（ＳＯＤ），ｃａｔａｌａｓｅ（ＣＡＴ），ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＰＯＤ）ａｎｄａｓｃｏｒｂａｔｅ
ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＡＰＸ）ｇｅｎｅｓｔｏｉｍｐｒｏｖｅａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ，ｒｅｄｕｃｉｎｇｗａｔｅｒｓｔｒｅｓｓｉｎｊｕｒｙ．ＥｘｏｇｅｎｏｕｓＳｐｄ
第２４卷　第４期
Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．４
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
２０１５年４月
Ａｐｒｉｌ，２０１５
收稿日期：２０１４０４１５；改回日期：２０１４０５０９
基金项目：国家自然科学基金项目（ＮＳＦＣ３１３７２３７１）和十二五农村领域国家科技计划课题（２０１１ＢＡＤ１７Ｂ０３）资助。
作者简介：李州（１９８６），男，云南文山人，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｌｉｚｈｏｕ１９８６８１４＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ．Ｅｍａｉｌ：ｐｅｎｇｙａｎｌｅｅ＠１６３．ｃｏｍ
ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄｐｒｏｌｉｎｅｃａｔａｂｏｌｉｓｍａｎｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｆｒｏｍｔｈｅｇｌｕｔａｍａｔｅｐａｔｈｗａｙｄｕｒｉｎｇｗａｔｅｒｓｔｒｅｓｓａｌｔｈｏｕｇｈｉｔｈａｄ
ｎｏｅｆｆｅｃｔｏｎｔｈｅｏｒｎｉｔｈｉｎｅｐａｔｈｗａｙｏｆｐｒｏｌｉｎｅｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｅｘｏｇｅｎｏｕｓＳｐｄｃａｎｅｆｆｅｃ
ｔｉｖｅｌｙｉｍｐｒｏｖｅｗａｔｅｒｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅｏｆｗｈｉｔｅｃｌｏｖｅｒａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｉｍｐｒｏｖｉｎｇａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉ
ｔｉｅｓ，ｅｎｈａｎｃｉｎｇｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｇｅｎｅｓｅｎｃｏｄｉｎｇａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｅｎｚｙｍｅｓａｎｄａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇｐｒｏｌｉｎｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ｗｈｉｔｅｃｌｏｖｅｒ（犜狉犻犳狅犾犻狌犿狉犲狆犲狀狊）；ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ；ｗａｔｅｒｓｔｒｅｓｓ；ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｅｎｚｙｍｅ；ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；
ｐｒｏｌｉｎｅ
白三叶（犜狉犻犳狅犾犻狌犿狉犲狆犲狀狊）是一种世界性分布与栽培的多年生豆科饲草，由于具有蛋白质含量高、再生速度
快以及良好的固氮能力等特点，在改良天然草地和建植人工混播草地过程中发挥着巨大作用［１２］。然而，白三叶
属浅根型作物，喜冷凉湿润气候，抗逆性较差，干旱是限制其发展和利用的主要逆境因素［３］。多胺（ｐｏｌｙａｍｉｎｅ，
ＰＡｓ）是一类广泛分布于生物体内具有生理活性的低分子量脂肪族含氮碱，在植物体内主要包括腐胺（ｐｕｔｒｅｓ
ｃｉｎｅ，Ｐｕｔ）、亚精胺（ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ，Ｓｐｄ）和精胺（ｓｐｅｒｍｉｎｅ，Ｓｐｍ）等，众多研究表明，逆境胁迫下，多胺具有缓解氧
化压力、保护生物大分子结构并参与逆境胁迫信号传递的功能［４６］。Ｋａｓｕｋａｂｅ等［７］的研究发现，转亚精胺合成酶
基因的拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）植株体内亚精胺含量显著增加，并表现出了显著增强的耐旱性、耐冷性和
耐盐性等多种特性，并认为亚精胺在植物响应逆境胁迫过程中扮演着信号调节枢纽的作用。Ｓｕｎｇ等［８］研究表
明，外源亚精胺和精胺通过上调高盐胁迫下粗齿冷水花（犝犾狏犪犳犪狊犮犻犪狋犪）铁超氧化物歧化酶（ＦｅＳＯＤ）基因的表达
以提高其抗氧化保护能力，从而缓解了高盐胁迫下机体氧化性损伤。这与２０１１年Ａｒｙａｄｅｅｐ等［９］的研究相似，外
源亚精胺和精胺能有效提高盐胁迫下水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）抗坏血酸过氧化物酶（ＡＰＸ）和过氧化氢酶（ＣＡＴ）等抗
氧化酶活性，并诱导了盐胁迫下脯氨酸的积累。同时Ｊｉｎｎ等［１０］发现，水淹条件下外源亚精胺和精胺还能通过提
高抗氧化酶活性来帮助维持大葱（犃犾犾犻狌犿犳犻狊狋狌犾狅狊狌犿）体内活性氧平衡并防止膜脂过氧化带来的伤害。此外，逆
境胁迫下多胺还具有稳定细胞膜［１１］、提高可溶性糖含量［１２］、影响Ｃａ２＋和Ｋ＋通道，调节气孔关闭等［１３］作用。因
此，研究亚精胺诱导白三叶抗旱性机制不仅能为提高白三叶抗旱性提供理论基础和寻找新的途径，而且能进一步
了解亚精胺调控植物抗逆性的作用机理。
前人对于亚精胺诱导逆境胁迫下植物的耐受性主要集中在抗氧化酶活性的变化和有机渗透调节物质的积累
等方面，缺乏系统性和完整性，对于亚精胺调控不同水分胁迫强度下不同类型抗氧化酶基因的表达模式以及对于
脯氨酸代谢的影响鲜有报道，在白三叶上几乎处于空白。本研究通过添加外源亚精胺的方法，对不同水分胁迫强
度下白三叶叶片活性氧积累、抗氧化保护系统以及脯氨酸代谢进行研究，并通过ＲＴ－ＰＣＲ技术研究不同处理和
胁迫强度下抗氧化酶基因的表达特异性和表达模式，旨在深入理解亚精胺参与调控植物逆境防御的生理和分子
机制，同时为丰富白三叶的抗逆栽培措施提供理论依据。
１　材料与方法
１．１　供试材料
本试验于２０１３年在四川农业大学草业工程试验室进行。以广泛种植的拉丁诺（Ｌａｄｉｎｏ）白三叶为供试材料，
采用沙培法进行培育。具体方法为：将白三叶种子用０．１％的高锰酸钾溶液消毒后，播种在装有石英砂的白色育
苗盘（长３５ｃｍ，宽２５ｃｍ，高１０ｃｍ）中，２４℃光照培养箱中进行发芽，待发芽７ｄ后用 Ｈｏａｇｌａｎｄ全营养液继续培
养，温度为白天２３℃，夜晚１９℃，时长各为１２ｈ，相对湿度为７０％，当幼苗长至３０ｄ（２片成熟叶片）时选取长势一
致的材料用２０％（Ｗ／Ｖ）聚乙二醇６０００（ＰＥＧ６０００）进行水分胁迫处理。
１．２　试验设计
本试验共设对照（ＣＫ）和外源亚精胺（ＣＫ＋Ｓｐｄ）２个处理（每处理设４个重复）和３个水分胁迫强度，分别
为：１）正常水分：ＣＫ（Ｈｏａｇｌａｎｄ全营养液正常培养）和ＣＫ＋Ｓｐｄ（Ｈｏａｇｌａｎｄ全营养液加入０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ外源亚
精胺正常培养）；２）轻度水分胁迫：ＣＫ（加２０％ＰＥＧ６０００的Ｈｏａｇｌａｎｄ全营养液胁迫３ｄ）和ＣＫ＋Ｓｐｄ（在加２０％
ＰＥＧ６０００的Ｈｏａｇｌａｎｄ全营养液中加入０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ的亚精胺胁迫３ｄ）；３）重度水分胁迫：ＣＫ（加２０％ＰＥＧ
９４１第４期 李州　等：亚精胺对水分胁迫下白三叶脯氨酸代谢、抗氧化酶活性及其基因表达的影响
６０００的Ｈｏａｇｌａｎｄ全营养液胁迫９ｄ）和ＣＫ＋Ｓｐｄ（在加２０％ ＰＥＧ６０００的 Ｈｏａｇｌａｎｄ全营养液中加入０．０５
ｍｍｏｌ／Ｌ的亚精胺胁迫９ｄ）。为了保持各个处理溶液中药品浓度一致，从进行处理开始，每３ｄ更换１次处理
液。
１．３　测定指标与方法
１．３．１　相对含水量（ｒｅｌａｔｉｖｅｗａｔｅｒｃｏｎｔｅｎｔ）　　叶片相对含水量采用烘干法测定［１４］，剪取叶片０．３ｇ，用普通吸
水纸将其包裹好，放入装满水的５０ｍＬ离心管中，盖好盖子，放置于避光处静置２４ｈ叶片吸水饱和后，取出叶片，
擦干表面水分，称量饱和鲜重，然后置于鼓风烘箱中在１０５℃下杀青４５ｍｉｎ，然后７５℃下烘至恒重，称其干重，重
复４次，取平均值。计算公式：相对含水量（％）＝（鲜重－干重）／（饱和鲜重－干重）×１００。
１．３．２　超氧阴离子产生速率（ｔｈｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅａｎｉｏｎ）和过氧化氢含量（Ｈ２Ｏ２ｃｏｎｔｅｎｔ）　　超氧阴离
子递减速率参照Ｅｌｓｔｎｅｒ和 Ｈｅｕｐｅｌ［１５］的方法稍加改进测定，剪取叶片０．３ｇ，用３ｍＬ５０ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液
（ｐＨ７．８）研磨，５０００ｒ／ｍｉｎ，离心１０ｍｉｎ。取上清液１ｍＬ，加入ｐＨ７．８磷酸缓冲液０．９ｍＬ和１０ｍｍｏｌ／Ｌ盐酸
羟胺０．１ｍＬ，混合并２５℃保温２０ｍｉｎ。加入１ｍＬ１７ｍｍｏｌ／Ｌ对氨基苯磺酸和１ｍＬ７ｍｍｏｌ／Ｌα萘胺，２５℃保
温２０ｍｉｎ，反应后的显色液加入３ｍＬ乙醚，充分摇匀，静置分层，吸取试管下层水相。５３０ｎｍ下测定吸光值，从
标准曲线查得ＮＯ２－浓度，计算Ｏ２－产生速率。Ｈ２Ｏ２ 含量参照Ｕｃｈｉｄａ等［１６］的方法稍加改动进行测定，称取新
鲜植物组织０．２ｇ，按材料与提取剂１∶１的比例加入４℃下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后，转入离心管
３０００ｒ／ｍｉｎ下离心１０ｍｉｎ，分层弃去残渣，上清液即为样品提取液。用移液枪吸取样品提取液１ｍＬ，加入５％硫
酸钛和浓氨水，待沉淀形成后３０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃去上清液。沉淀用丙酮反复洗涤３～５次，直到去除植
物色素。向洗涤后的沉淀中加入２ｍｏｌ／Ｌ硫酸５ｍＬ，待完全溶解后，４１５ｎｍ比色。
１．３．３　抗氧化酶活性（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙ）和丙二醛（ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ，ＭＤＡ）含量　　粗酶液的提取，
称取植物鲜重０．４ｇ放入研钵中，放入液氮（能够完全覆盖组织）研磨组织破碎后，待液氮完全挥发后加入２ｍＬ
预冷的磷酸缓冲液和０．１ｇＰＶＰ在冰上充分研磨，然后转入离心管中，再用２ｍＬ缓冲液充分清洗研钵，一并转
入离心管中。４℃下１５０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，上清液即为粗酶提取液。将粗酶液分装入各管中进行 ＭＤＡ和抗
氧化酶的活性测定。ＭＤＡ含量采用硫代巴比妥酸法测定［１７］；超氧化物歧化酶（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ，ＳＯＤ）活
性采用核黄素ＮＢＴ法测定［１８］；过氧化氢酶（ｃａｔａｌａｓｅ，ＣＡＴ）活性采用紫外吸收法测定［１９］；过氧化物酶活性（ｐｅｒ
ｏｘｉｄａｓｅ，ＰＯＤ）采用愈创木酚显色法［１９］；抗坏血酸过氧化物酶（ａｓｃｏｒｂａｔｅｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＡＰＸ）采用紫外吸收法测
定［２０］。
１．３．４　游离脯氨酸（ｆｒｅｅｐｒｏｌｉｎｅ）含量及其代谢酶活性　　采用茚三酮比色法测定［２１］，取不同处理的剪碎混匀
叶片０．２ｇ，分别置于大试管中，加入５ｍＬ３％磺基水杨酸溶液，管口加盖玻璃球，置于水浴中浸提１０ｍｉｎ。取出
试管待冷却至室温后，吸取上清液２ｍＬ，加２ｍＬ冰乙酸和３ｍＬ显色液，于沸水浴中加热４０ｍｉｎ，取出冷却后加
入５ｍＬ甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层在波长为５２０ｎｍ下比色，从标准曲线中查
出测定液中脯氨酸浓度。鸟氨酸转氨酶（ｏｒｎｉｔｈｉｎｅａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＯＡＴ）活性采用茚三酮法测定［２２］；Δ’吡咯
啉５羧酸合成酶（ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ５ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，Ｐ５ＣＳ）活性参照ＧａｒｃｉａＲｉｏｓ等［２３］的方法；脯氨酸脱氢酶
（ｐｒｏｌｉｎｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＰｒｏＤＨ）活性参照Ｓａｎｃｈｅｚ等［２４］的方法。
１．３．５　基因表达分析　　白三叶叶片总ＲＮＡ提取参照捷倍斯公司试剂盒（ＰｌａｎｔＲＮＡＫｉｔ）说明书，提取的总
ＲＮＡ参照美国ＢｉｏＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ公司反转录试剂盒（ｉＳｃｒｉｐｔＴＭｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ）说明书进行反转录获
得ｃＤＮＡ第一链。以白三叶肌动蛋白基因（βＡｃｔｉｎ）为内参，根据白三叶ＰＯＤ基因设计半定量引物。根据Ｇｅｎ
Ｂａｎｋ中的已知的红三叶（犜狉犻犳狅犾犻狌犿狆狉犪狋犲狀狊犲）ＳＯＤ基因、蚕豆（犞犻犮犻犪犳犪犫犪）ＣＡＴ基因和蒺藜苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅
狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪）ＡＰＸ基因序列，ＧｅｎＢａｎｋ编号分别为：ＡＹ４３４４９７．１、ＪＱ０４３３４８．１、ＸＭ＿００３６０１９９５．１，使用近源物种
基因序列相似性的ＴＢＬＡＳＴＸ分析，在白三叶已有的表达序列标签（ＥＳＴ）中鉴定出了白三叶ＳＯＤ、ＣＡＴ、ＡＰＸ
基因序列片段，ＧｅｎＢａｎｋ编号分别为：ＦＹ４６１２７４．１、ＦＹ４６４９８８．１和ＦＹ４６０６７４．１，他们与前面已知相应基因序列
的相似性分别达到９４％，９３％和９５％，因而可用于设计引物（表１）。
０５１ 草　业　学　报 第２４卷
　　以获得的ｃＤＮＡ第一链为模板进行ＰＣＲ扩增。
βＡｃｔｉｎ、ＳＯＤ、ＣＡＴ和ＰＯＤ基因反应程序为：９４℃３
ｍｉｎ；９４℃ ３０ｓ，５７℃ ３０ｓ，７２℃ １ｍｉｎ，３０个循环；
７２℃５ｍｉｎ。ＡＰＸ基因反应程序为：９４℃３ｍｉｎ；９４℃
３０ｓ，６２．５℃３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ，３０个循环；７２℃５ｍｉｎ。
１．４　统计分析
采用Ｅｘｃｅｌ２００３进行绘图；ＳＡＳ９．１软件进行方
差分析和显著性分析（犘＜０．０５）；Ｑｕａｎｔｉｔｙｏｎｅ进行
半定量分析。
２　结果与分析
２．１　亚精胺对水分胁迫下白三叶叶片相对含水量的
影响
植物叶片的相对含水量（ＲＷＣ）可以直接反应植
物体在干旱环境下水分的亏缺程度。随着水分胁迫强
度的加大，白三叶叶片ＲＷＣ呈明显的下降趋势。正
常水分和轻度胁迫下，外源亚精胺对白三叶叶片相对
含水量没有显著影响。重度胁迫下ＣＫ处理和ＣＫ＋
Ｓｐｄ处理的ＲＷＣ分别下降了５７％和４６％，此时ＣＫ
＋Ｓｐｄ处理维持了显著较高的ＲＷＣ（图１）。
表１　试验中所用到的引物
犜犪犫犾犲１　犃犾狆狉犻犿犲狉狊狌狊犲犱犻狀狋犺犻狊犲狓狆犲狉犻犿犲狀狋
基因 Ｇｅｎｅ 引物序列（５′－３′）Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ
犆狌／犣狀ＳＯＤ ＴＣＡＣＣＴＴＣＣＡＣＴＴＴＣＡＡＡＣＣＴＣＴＣ
ＴＧＴＴＧＧＡＣＣＴＴＣＧＴＣＴＴＣＴＴＧＡＧＴ
ＣＡＴ ＧＴＣＴＴＣＴＴＴＧＴＴＣＡＣＧＡＴＧＧＧＡＴＧ
ＧＡＡＡＧＴＧＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＴＣＡＡＧＧＡＴ
ＰＯＤ ＴＣＴＡＧＧＧＣＡＡＣＧＧＴＴＡＡＴＴＣＡＴＴＣ
ＧＧＴＡＣＧＧＡＴＴＴＴＣＣＣＡＴＴＴＣＴＴＧ
ＡＰＸ ＧＣＡＧＣＡＴＣＡＧＴＴＧＧＣＡＡＧＡＣＣ
ＧＧＣＡＡＡＣＣＴＧＡＧＡＣＴＡＡＡＴＡＣＡＣＧＡ
βＡｃｔｉｎ ＴＴＡＣＡＡＴＧＡＡＴＴＧＣＧＴＧＴＴＧ
ＡＧＡＧＧＡＣＡＧＣＣＴＧＡＡＴＧＧ
图１　亚精胺对水分胁迫下白三叶叶片相对含水量的影响
犉犻犵．１　犈犳犳犲犮狋狊狅犳狊狆犲狉犿犻犱犻狀犲狅狀狉犲犾犪狋犻狏犲狑犪狋犲狉
犮狅狀狋犲狀狋狌狀犱犲狉狑犪狋犲狉狊狋狉犲狊狊
　　　不同字母表示在０．０５水平上差异显著（犘＜０．０５）。下同。Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｌｅｔｔｅｒｓｉｎｄｉｃａｔｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓａｔ犘＜０．０５ｌｅｖｅｌ．Ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ．
２．２　亚精胺对水分胁迫下白三叶叶片活性氧成分和
膜脂过氧化产物的影响
水分胁迫过程中，不同处理超氧阴离子产生速率、
Ｈ２Ｏ２ 和 ＭＤＡ含量反应一致，都随着水分胁迫强度
的加大不断增大，说明水分胁迫过程中活性氧和膜脂
过氧化产物不断积累，细胞氧化性损伤不断增大（图
２）。与正常水分相比较，轻度水分胁迫使ＣＫ处理的
超氧阴离子产生速率和 ＭＤＡ含量显著上升，但并未对ＣＫ＋Ｓｐｄ处理造成显著影响，而ＣＫ＋Ｓｐｄ处理分别在轻
度水分胁迫和重度水分胁迫下维持了显著低的超氧阴离子产生速率和 ＭＤＡ含量，说明外源亚精胺有效缓解了
水分胁迫下白三叶叶片膜脂过氧化程度（图２Ａ，Ｃ）。如图２Ｂ所示，轻度水分胁迫和重度水分胁迫都使ＣＫ和
ＣＫ＋Ｓｐｄ处理的Ｈ２Ｏ２ 含量显著增高，但添加外源亚精胺处理显著降低了白三叶在轻度和重度胁迫强度下的
Ｈ２Ｏ２ 水平，一定程度上缓解了水分胁迫带来的氧化伤害。
２．３　亚精胺对水分胁迫下白三叶叶片抗氧化酶活性的影响
轻度水分胁迫下ＣＫ＋Ｓｐｄ处理的叶片ＳＯＤ活性比正常水分条件下高出了２．７个百分点达到显著水平，而
ＣＫ处理几乎处于同一水平，且ＣＫ＋Ｓｐｄ处理的ＳＯＤ活性在轻度和重度胁迫下显著高于ＣＫ处理（图３Ａ）。轻
度水分胁迫使ＣＫ和ＣＫ＋Ｓｐｄ处理的ＣＡＴ活性分别上升了６５％和８４％，二者之间存在显著差异，重度胁迫下
两处理的ＣＡＴ活性又急剧下降，但ＣＫ＋Ｓｐｄ处理下降幅度小于ＣＫ处理，维持了显著较高的ＣＡＴ活性（图
３Ｂ）。外源亚精胺显著提高了正常水分和轻度胁迫条件下白三叶叶片ＰＯＤ活性，但此种效益在重度胁迫下并未
表现出来（图３Ｃ）。ＡＰＸ活性随着胁迫程度的增大而升高，重度胁迫下，ＣＫ和ＣＫ＋Ｓｐｄ处理的ＡＰＸ活性分别
是正常水分条件下的１．６和１．８倍，此时ＣＫ＋Ｓｐｄ处理的ＡＰＸ活性显著高于ＣＫ处理（图３Ｄ）。
２．４　亚精胺对水分胁迫下白三叶叶片抗氧化酶基因表达的影响
半定量ＲＴ－ＰＣＲ结果显示，ＳＯＤ基因的相对表达量随着胁迫强度的加大逐渐增强，与ＳＯＤ活性变化相一
１５１第４期 李州　等：亚精胺对水分胁迫下白三叶脯氨酸代谢、抗氧化酶活性及其基因表达的影响
致，水分胁迫诱导了ＳＯＤ基因的表达，而添加外源亚精胺能进一步提高ＳＯＤ的表达量，在重度胁迫下，ＣＫ＋Ｓｐｄ
处理维持了显著较高的ＳＯＤ表达量（图４Ａ）。正常水分和轻度水分胁迫下ＣＫ和ＣＫ＋Ｓｐｄ处理的ＣＡＴ基因稳
定表达无显著差异，但重度胁迫下ＣＫ处理的叶片ＣＡＴ基因表达量显著降低，而ＣＫ＋Ｓｐｄ处理的叶片ＣＡＴ基
因仍具有显著较高的表达量（图４Ｂ）。
图２　亚精胺对水分胁迫下白三叶叶片活性氧成分和 犕犇犃的影响
犉犻犵．２　犈犳犳犲犮狋狊狅犳狊狆犲狉犿犻犱犻狀犲狅狀狋犺犲犵犲狀犲狉犪狋犻狅狀狉犪狋犲狅犳狊狌狆犲狉狅狓犻犱犲犪狀犻狅狀，犎２犗２犪狀犱犕犇犃犮狅狀狋犲狀狋狌狀犱犲狉狑犪狋犲狉狊狋狉犲狊狊
　
图３　亚精胺对水分胁迫下白三叶叶片抗氧化保护酶活性的影响
犉犻犵．３　犈犳犳犲犮狋狊狅犳狊狆犲狉犿犻犱犻狀犲狅狀狋犺犲犪犮狋犻狏犻狋犻犲狊狅犳犪狀狋犻狅狓犻犱犪狋犻狏犲犲狀狕狔犿犲狌狀犱犲狉狑犪狋犲狉狊狋狉犲狊狊　
水分胁迫同时也诱导了ＰＯＤ基因的相对表达量，但添加外源亚精胺处理使正常水分和胁迫下白三叶叶片
ＰＯＤ表达量进一步提升（图４Ｃ）。轻度水分胁迫下，ＣＫ和ＣＫ＋Ｓｐｄ处理的ＰＯＤ表达量显著增加，分别比正常
水分下上升了１２１％和１３５％，二者差异显著（图４Ｃ）。外源亚精胺对正常水分下白三叶ＡＰＸ基因的表达量影响
显著，大大激活了ＡＰＸ基因的表达，但轻度水分胁迫下有所下降。ＣＫ处理的ＡＰＸ基因表达在轻度胁迫下有所
上升，但未达到显著水平，重度胁迫下ＣＫ＋Ｓｐｄ处理的 ＡＰＸ基因表达是ＣＫ处理的２．４倍，达到显著水平（图
４Ｄ）。
２５１ 草　业　学　报 第２４卷
图４　亚精胺对水分胁迫下白三叶叶片抗氧化酶基因表达的影响
犉犻犵．４　犈犳犳犲犮狋狊狅犳狊狆犲狉犿犻犱犻狀犲狅狀狋犺犲犵犲狀犲犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狅犳犪狀狋犻狅狓犻犱犪狋犻狏犲犲狀狕狔犿犲狌狀犱犲狉狑犪狋犲狉狊狋狉犲狊狊
Ｗ：正常水分 Ｗｅｌｗａｔｅｒｅｄ；Ｍ：轻度水分胁迫 Ｍｉｌｄｗａｔｅｒｓｔｒｅｓｓ；Ｈ：重度水分胁迫 Ｈｅａｖｙｗａｔｅｒｓｔｒｅｓｓ．
　
图５　亚精胺对水分胁迫下白三叶叶片脯氨酸含量及代谢酶活性的影响
犉犻犵．５　犈犳犳犲犮狋狊狅犳狊狆犲狉犿犻犱犻狀犲狅狀犳狉犲犲狆狉狅犾犻狀犲犮狅狀狋犲狀狋犪狀犱犪犮狋犻狏犻狋犻犲狊狅犳犻狋狊犿犲狋犪犫狅犾犻犮犲狀狕狔犿犲狌狀犱犲狉狑犪狋犲狉狊狋狉犲狊狊
３５１第４期 李州　等：亚精胺对水分胁迫下白三叶脯氨酸代谢、抗氧化酶活性及其基因表达的影响
２．５　亚精胺对水分胁迫下白三叶叶片脯氨酸含量及其代谢酶活性的影响
游离氨基酸含量在响应水分胁迫的过程中急剧升高，重度胁迫下ＣＫ和ＣＫ＋Ｓｐｄ处理的白三叶叶片游离
脯氨酸含量分别是胁迫前的２９和３４倍，此时两处理的游离氨基酸含量没有表现出显著差异，但ＣＫ＋Ｓｐｄ处理
在轻度胁迫下积累了显著较高的游离脯氨酸（图５Ａ）。
鸟氨酸转氨酶（ＯＡＴ）和Δ’吡咯啉５羧酸合成酶（Ｐ５ＣＳ）是脯氨酸合成代谢两个不同途径的关键酶，ＯＡＴ
活性随着水分胁迫强度的增加逐步升高，特定水分胁迫强度下ＣＫ和ＣＫ＋Ｓｐｄ处理间均未表现出显著差异（图
５Ｂ）。而Ｐ５ＣＳ活性在ＣＫ处理中呈先下降后上升的趋势，ＣＫ＋Ｓｐｄ处理的Ｐ５ＣＳ活性在正常水分和轻度胁迫下
变化不大，重度胁迫下快速上升，且活性在３种胁迫强度下均显著高于ＣＫ处理组（图５Ｃ）。这说明外源亚精胺
主要通过诱导Ｐ５ＣＳ活性从而促进脯氨酸在白三叶叶片内的积累。ＰｒｏＤＨ是脯氨酸分解代谢途径的关键酶，在
响应水分胁迫的过程中，两个处理的ＰｒｏＤＨ活性先升高后下降，轻度胁迫下有较大幅度的上升。轻度和重度水
分胁迫下，ＣＫ＋Ｓｐｄ处理的ＰｒｏＤＨ活性均显著高于ＣＫ处理，说明外源亚精胺处理促进了白三叶叶片脯氨酸在
水分胁迫下的分解代谢（图５Ｄ）。
３　讨论
多胺参与逆境胁迫下植物抗氧化防御已被广泛报道，它的分子作用机制和信号作用也越来越受到人们的关
注。Ｗｅｎ等［２５］和 Ｈｅ等［２６］研究发现，过量表达亚精胺合酶的转基因梨（犘狔狉狌狊ｓｐｐ．）植株通过上调ＳＯＤ和ＡＰＸ
等抗氧化酶活性，降低了胁迫下Ｈ２Ｏ２ 含量和膜脂过氧化产物 ＭＤＡ积累，有效缓减了盐胁迫和甘露醇导致的水
分胁迫。而转入反义亚精胺合酶基因的梨树体内亚精胺含量降低，盐胁迫和镉胁迫下抗氧化防御系统功能减弱，
ＭＤＡ含量显著增加，膜脂过氧化程度加剧，植株耐受性减弱［２７］。外源亚精胺亦能显著提高非生物胁迫下多种抗
氧化酶活性，增强植物抗氧化防御［２８］。本研究中，外源亚精胺显著提高了水分胁迫下白三叶ＳＯＤ、ＣＡＴ、ＰＯＤ和
ＡＰＸ活性，使得细胞内超氧阴离子产生速率和Ｈ２Ｏ２ 含量显著下降，ＭＤＡ含量显著降低，细胞膜脂过氧化程度
减小，从而增强了水分胁迫下白三叶抗氧化胁迫能力。这与 Ｋｕｂｉｓ［２９］在研究外源亚精胺缓解水分胁迫下黄瓜
（犆狌犮狌犿犻狊狊犪狋犻狏狌狊）叶片氧化压力的研究相一致，他发现外源亚精胺能通过提高ＰＯＤ等多种抗氧化酶活性降低
胁迫下叶片超氧自由基和Ｈ２Ｏ２ 含量，以达到缓解氧化压力的作用。
Ｋａｓｕｋａｂｅ等［７］研究表明，多胺在提高植物逆境胁迫能力上扮演着双重作用，一是以胁迫保护化合物的方式
直接参与抵御环境胁迫，二是起到胁迫信号调节器的作用，能诱导ＤＲＥＢ等胁迫响应转录因子及ｒｄ２９Ａ等胁迫
保护蛋白基因的表达。尸胺能诱导冰叶日中花（犕犲狊犲犿犫狉狔犪狀狋犺犲犿狌犿犮狉狔狊狋犪犾犾犻狌犿）中ＳＯＤ基因的表达已被证
实［３０］，而烟草（犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪犮狌犿）中ＰＯＤ基因的表达受精胺的影响［３１］。其他已有报道也证实亚精胺和精胺均
能上调转录因子键合ＤＮＡ活力并诱导多种基因的表达［３２３３］。本研究通过半定量ＲＴ－ＰＣＲ技术分析亚精胺对
水分胁迫下４种抗氧化酶基因的影响，结果显示外源亚精胺不同程度地上调了正常水分和水分胁迫下白三叶叶
片中ＳＯＤ、ＣＡＴ、ＰＯＤ和ＡＸＰ基因的表达水平，并使ＣＡＴ基因的表达模式发生改变，使其在水分胁迫下始终保
持较高的稳定表达。这说明亚精胺通过调控多种抗氧化基因的表达从分子水平上参与了水分胁迫下白三叶抗氧
化防御系统。
积累可溶性糖、脯氨酸和甜菜碱等物质是植物响应水分亏缺最主要的方式之一，这些有机渗透调节物质对于
植物体应对水分胁迫十分重要［３４３６］。Ｃｒａｍｅｒ等［３７］，Ｓｚａｂａｄｏｓ和Ｓａｖｏｕｒｅ［３８］认为，脯氨酸在干旱防御上的作用不
仅仅是渗透调节，而在渗透保护功能上意义重大，它的积累和代谢可以维持干旱胁迫下细胞内结构和膜的稳定
性，同时具有清除超氧阴离子等自由基的作用。本研究结果显示，水分胁迫下游离脯氨酸在白三叶叶片内迅速积
累，且外源亚精胺提高了轻度水分胁迫下白三叶叶片游离脯氨酸含量，这也印证了Ｒｏｙｃｈｏｕｄｈｕｒｙ等［３９］和Ｄｕａｎ
等［２８］的研究结果，即逆境胁迫下外源亚精胺能显著提高水稻等植物体内脯氨酸的含量，且抑制亚精胺合酶的表
达能显著抑制脯氨酸的积累。ＯＡＴ和Ｐ５ＣＳ分别是合成脯氨酸鸟氨酸途径和谷氨酸途径中的限速和调节
酶［４０］，而ＰｒｏＤＨ则是脯氨酸分解途径的限速酶［４１］。外源亚精胺同时显著提高了谷氨酸合成途径中Ｐ５ＣＳ活性
和分解途径中ＰｒｏＤＨ活性，但对ＯＡＴ活性影响不明显，表明外源亚精胺主要通过调节谷氨酸途径促进脯氨酸
４５１ 草　业　学　报 第２４卷
在白三叶叶片内的积累，同时也通过提高ＰｒｏＤＨ活性促进水分胁迫下脯氨酸在白三叶叶片内的降解和利用。
综上所述，外源亚精胺通过上调水分胁迫下白三叶叶片抗氧化酶基因ＳＯＤ、ＣＡＴ、ＰＯＤ和ＡＰＸ表达，显著
提高了胁迫下抗氧化酶活性，有效缓解了水分胁迫导致的氧化性伤害，稳定了细胞膜结构；外源亚精胺还通过提
高谷氨酸合成途径关键酶Ｐ５ＣＳ活性和降解关键酶ＰｒｏＤＨ活性，促进了水分胁迫下脯氨酸的代谢，增强了胁迫
下白三叶渗透调节和消除氧胁迫的能力，提高了叶片相对含水量，在减轻水分胁迫对白三叶生理功能的影响中发
挥作用。
犚犲犳犲狉犲狀犮犲狊：
［１］　ＺｈｕＳＳ，ＺｏｎｇＳＧ，ＬｖＹ，犲狋犪犾．Ｔｈｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓａｎｄｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｐｒｏｓｐｅｃｔｓｏｆｗｉｌｄｒｅｄｃｌｏｖｅｒａｎｄｗｈｉｔｅｃｌｏｖｅｒｉｎＤａＸｉｎａｎｌｉｎｇ．
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［２］　ＬｉＺ，ＰｅｎｇＹ，ＳｕｎＸＹ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｒｅｓｐｏｎｓｅｓｏｆｗｈｉｔｅｃｌｏｖｅｒｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅａｆｔｙｐｅｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅｅｎｚｙｍｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｏｓ
ｍｏｔｉｃａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｕｎｄｅｒｄｒｏｕｇｈｔｓｔｒｅｓｓ．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１３，２２（２）：２５７２６３．
［３］　ＭｅｒｃｅｒＣＦ，ＷａｔｓｏｎＲＮ．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｎｅｍａｔｉｃｉｄｅｓａｎｄｐｌａｎｔｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｎｗｈｉｔｅｃｌｏｖｅｒｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅａｎｄｓｅａｓｏｎａｌｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｏｆｎｅｍａｔｏｄｅｓｐａｒａ
ｓｉｔｉｚｉｎｇｗｈｉｔｅｃｌｏｖｅｒｉｎｇｒａｚｅｄｐａｓｔｕｒｅ．ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２００７，３９：２９８３０４．
［４］　ＺｈｏｕＸＭ，ＺｈａｏＹＣ，ＺｈｏｕＰＨ．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｃｈａｎｇｅｏｆｐｏｌｙａｍｉｎｅｃｏｎｔｅｎｔｓａｎｄｄｒｏｕｇｈｔｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｒｉｃｅｓｅｅｄｌｉｎｇｓｕｎｄｅｒｗａｔｅｒ
ｓｔｒｅｓｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｕｎａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ），２０１０，３６（１）：１７２１．
［５］　ＨｅＬ，ＮａｄａＫ，ＫａｓｕｋａｂｅＹ，犲狋犪犾．Ｅｎｈａｎｃｅｄｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｏｆｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｔｏｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｐｈｏｔｏｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｄｕｅｔｏｉｎｔｅｒｒｕｐｔｉｏｎｏｆｃｈｉｌｉｎ
ｄｕｃｅｄｉｎｃｒｅａｓｅｏｆｓａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｌｅａｖｅｓｏｆｓｐｉｎａｃｈ（犛狆犻狀犪犮犻犪狅犾犲狉犪犮犲犪Ｌ．）．ＰｌａｎｔＣｅｌＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００２，４３：１９６
２０６．
［６］　ＬｉＪ，ＨｕＸＨ，ＧｕｏＳＲ．Ｅｆｆｅｃｔｏｆｅｘｏｇｅｎｏｕｓｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅｏｎｐｏｌｙａｍｉｎｅｃｏｎｔｅｎｔａｎｄａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｉｎｒｏｏｔｓｏｆｃｕｃｕｍｂｅｒｓｅｅｄｌｉｎｇｓ
ｕｎｄｅｒｒｏｏｔｚｏｎｅｈｙｐｏｘｉａｓｔｒｅｓｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｌａｎｔＥｃｏｌｏｇｙ，２００６，３０（１）：１１８１２３．
［７］　ＫａｓｕｋａｂｅＹ，ＨｅＬ，ＮａｄａＫ，犲狋犪犾．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅｓｙｎｔｈａｓｅｅｎｈａｎｃｅｓｔｏｌｅｒａｎｃｅｔｏｍｕｌｔｉｐｌｅｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｓｔｒｅｓｓａｎｄｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｓ
ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｖａｒｉｏｕｓｓｔｒｅｓｓｒｅｇｕｌａｔｅｄｇｅｎｅｓｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪．Ｐｌａｎｔ＆ＣｅｌＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００４，４５：７１２７２２．
［８］　ＳｕｎｇＭＳ，ＣｈｏｗＴＪ，ＬｅｅＴＭ．Ｐｏｌｙａｍｉｎｅａｃｃｌｉｍａｔｉｏｎａｌｅｖｉａｔｅｓｈｙｐｅｒｓａｌｉｎｉｔｙｉｎｄｕｃｅｄｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓｉｎａｍａｒｉｎｅｇｒｅｅｎｍａｃｒｏａｌｇａ，犝犾狏犪犳犪狊
犮犻犪狋犪，ｂｙｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅｅｎｚｙｍｅｇｅｎｅ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈｙｃｏｌｏｇｙ，２０１１，４７（３）：５３８５４７．
［９］　ＡｒｙａｄｅｅｐＲ，ＳｕｐｒａｔｉｍＢ，ＤｉｂｙｅｎｄｕＮＳ．Ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎｏｆｓａｌｉｎｉｔｙｓｔｒｅｓｓｂｙｅｘｏｇｅｎｏｕｓｌｙａｐｐｌｉｅｄｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅｏｒｓｐｅｒｍｉｎｅｉｎｔｈｒｅｅｖａｒｉｅｔｉｅｓｏｆｉｎ
ｄｉｃａｒｉｃｅｄｉｆｆｅｒｉｎｇｉｎｔｈｅｉｒｌｅｖｅｌｏｆｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０１１，１６８：３１７３２８．
［１０］　ＪｉｎｎＣＹ，ＣｈｅｎｇＷＬ，ＤｅｎｉｓｅＹＴＦ，犲狋犪犾．Ｗａｔｅｒｌｏｇｇｉｎｇｔｏｌｅｒａｎｃｅｏｆｗｅｌｓｈｏｎｉｏｎ（犃犾犾犻狌犿犳犻狊狋狌犾狅狊狌犿Ｌ．）ｅｎｈａｎｃｅｄｂｙｅｘｏｇｅｎｏｕｓｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ
ａｎｄｓｐｅｒｍｉｎｅ．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００９，４７：７１０７１６．
［１１］　ＳｅｒａｆｉｎｉＦｒａｃａｓｓｉｎｉＤ，ＤｉＳＡ，ＤｅｌＤＳ．Ｓｐｅｒｍｉｎｅｄｅｌａｙｓｌｅａｆｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅｉｎ犔犪犮狋狌犮犪狊犪狋犻狏犪ａｎｄｐｒｅｖｅｎｔｓｔｈｅｄｅｃａｙｏｆｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍｓ．
ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１０，４８：６０２６１１．
［１２］　ＳｏｎｇＷ Ｘ，ＤｕＨ Ｙ，ＬｉＨＰ，犲狋犪犾．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅｏｎｏｒｇａｎｉｃｏｓｍｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓｕｂｓｔａｎｃｅｉｎｌｅａｖｅｓｏｆｍａｉｚｅｓｅｅｄｌｉｎｇｕｎｄｅｒｏｓｍｏｔｉｃ
ｓｔｒｅｓｓ．ＡｃｔａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅＢｏｒｅｌｉｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓｉｓＳｉｎｉｃａ，２０１０，１９（７）：６６７０．
［１３］　ＶｅｌａｒｄｅＢｕｅｎｄｉａＡＭ，ＳｈａｂａｌａＳ，ＣｖｉｋｒｏｖａＭ，犲狋犪犾．Ｓａｌｔｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｔｂａｒｌｅｙｖａｒｉｅｔｉｅｓｄｉｆｆｅｒｉｎｔｈｅｅｘｔｅｎｔｏｆｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｔｈｅ
ＲＯＳｉｎｄｕｃｅｄＫ＋ｅｆｆｌｕｘｂｙｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１２，６１：１８２３．
［１４］　ＢａｒｒｓＨＤ，ＷｅａｔｈｅｒｌｅｙＰＥ．Ａｒｅｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｔｕｒｇｉｄｉｔｙｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｆｏｒｅｓｔｉｍａｔｉｎｇｗａｔｅｒｄｅｆｉｃｉｔｓｉｎｌｅａｖｅｓ．ＡｕｓｔｒａｌｉａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆ
ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，１９６２，１５：４１３４２８．
［１５］　ＥｌｓｔｎｅｒＥＦ，ＨｅｕｐｅｌＡ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｎｉｔｒｉｔｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｆｒｏｍｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅ：ａｓｉｍｐｌｅａｓｓａｙｆｏｒｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７６，７０：６１６６２０．
［１６］　ＵｃｈｉｄａＡ，ＡｎｄｒｅＴＩ，ＴａｋａｓｈｉＨ．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｈｙｄｒｏｇｅｎｐｅｒｏｘｉｄｅａｎｄｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｏｎｂｏｔｈｓａｌｔａｎｄｈｅａｔｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎｒｉｃｅ．ＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ，
２００２，１６３：５１５５２３．
［１７］　ＤｈｉｎｄｓａＲＳ，ＤｈｉｎｄｓａＰＰ，ＴｈｏｒｐｅＴＡ．Ｌｅａｆｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ：ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｉｎｃｒｅａｓｅｄｌｅａｖｅｓｏｆｍｅｍｂｒａｎｅｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙａｎｄｌｉｐｉｄｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ，
ａｎｄｄｅｃｒｅａｓｅｄｌｅｖｅｌｓｏｆｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅａｎｄｃａｔａｌａｓｅ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＢｏｔａｎｙ，１９８１，３２：９３１０１．
［１８］　ＧｉａｎｎｏｐｏｌｉｔｉｅｓＣＮ，ＲｉｅｓＳＫ．Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ：Ｉ．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｉｎｈｉｇｈｅｒｐｌａｎｔｓ．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９７７，５９：３０９３１４．
［１９］　ＣｈａｎｃｅＢ，ＭａｅｈｌｙＡＣ．Ａｓｓａｙｏｆｃａｔａｌａｓｅａｎｄｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ．ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９５５，２：７６４７７５．
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５５１第４期 李州　等：亚精胺对水分胁迫下白三叶脯氨酸代谢、抗氧化酶活性及其基因表达的影响
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ｉｎｄｉｃａｒｉｃｅｄｉｆｆｅｒｉｎｇｉｎｔｈｅｉｒｌｅｖｅｌｏｆｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０１１，１６８：３１７３２８．
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ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｐｌａｎｔｇｒｏｗｔｈａｎｄａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅ．ＣｕｒｒｅｎｔＳｃｉｅｎｃｅ，２００５，８８：４２４４３８．
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６５１ 草　业　学　报 第２４卷