全 文 ：书菊芋内生固氮菌分离、鉴定及特性研究
孟宪法，隆小华，康健，王雪晴，刘兆普
（南京农业大学资源与环境科学学院 江苏省海洋生物学重点实验室，江苏 南京２１００９５）
摘要：通过气相色谱，结合乙炔还原法，对菊芋根系的内生固氮菌进行了分离和鉴定。结果表明，筛选得到的７株
具有固氮酶活性的菌株，分别属于根瘤菌属，寡养单胞菌属，假单胞菌属和肠杆菌属。菌株之间固氮酶活性相差较
大，固氮酶活性较高的菌株较少，１００ｎｍｏｌ／（ｍＬ·ｈ）以上的只有ｃｈｏ１和ｃｈｏ９两株菌。菌株ｃｈｏ４的耐盐性较高，
可以在盐浓度为７％的条件下正常生长。分离得到的菌株中，有５株具有解磷活性，其中以菌株ｃｈｏ７的活性最高，
为６３．８４μｇ／ｍＬ。菌株全部都具有分泌生长素的能力，但差异较大，分泌ＩＡＡ浓度最高的是ｃｈｏ２，达到１３．４９
μｇ／ｍＬ。
关键词：菊芋；内生固氮菌；固氮酶活性；解磷活性；生长素
中图分类号：Ｑ９４５．１３　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１１）０６０１５７０７
　 生物固氮是自然界中仅次于光合系统的复杂生物反应系统。它为全球的植物提供了大约７５％的氮素，达
１．３９×１０８～１．７５×１０８ｔ［１，２］。生物固氮在提高土壤肥力、增强植物抗病能力等方面也发挥着极其重要的作用［３］。
１９６６年，Ｄｂｅｒｅｉｎｅｒ［４］首次成功地从热带禾本科植物点状雀稗（犘犪狊狆犪犾狌犿狀狅狋犪狋狌犿）根际中分离出具有较强固氮
作用的雀稗固氮菌（犃狕狅狋狅犫犪犮狋犲狉狆犪狊狆犪犾犻），并于１９７６年提出根际联合固氮的概念。１９９７年Ｂａｌｄａｎｉ等［５］根据菌
体能否定殖（植）在植物组织内，将固氮菌划分为自生固氮菌、共生固氮菌和内生固氮菌。内生固氮菌与植物之间
具有联合固氮作用，它存在于植物细胞间隙，是介于根际自生固氮和结瘤共生固氮之间的一种过渡类型［６，７］。内
生固氮菌通过分泌植物生长激素等多种生理活性物质，与病原菌竞争营养和空间等方面促进植物生长，在农业生
产实践中具有广阔的应用前景［８，９］。近年来，国内外学者对这类非豆科植物特殊的根际联合固氮菌展开了广泛
研究，陆续在水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）［１０，１１］、玉米（犣犲犪犿犪狔狊）［１２，１３］、甘蔗（犛犪犮犮犺犪狉狌犿狅犳犳犻犮犻狀犪狉狌犿）［１４，１５］等禾本科植
物的组织中分离出植物内生固氮菌。
菊芋（犎犲犾犻犪狀狋犺狌狊狋狌犫犲狉狅狊狌狊）是菊科向日葵属多年生草本植物，又称洋姜、鬼子姜，为耐寒、耐旱、耐贫瘠、耐盐
碱植物［１６］。原产北美洲，１７世纪传入欧洲，后传入中国。现在在全球的热带、温带、寒带以及干旱、半干旱地区都
有菊芋的分布。菊芋生态适应性强，其块茎中富含菊糖，可作为乙醇生产的优质原料［１７］。在生产实践中，菊芋施
肥量较少，尤其是氮肥，每ｈｍ２ 仅需７５ｋｇ的尿素［１８］，为水稻用量的５０％。且生物量巨大，每ｈｍ２ 每年可以收获
８００００ｋｇ左右的菊芋块茎，以及４００００ｋｇ秸秆［１９］。这可能是与其自身固氮作用有关，因而本试验对菊芋的内
生固氮菌开展研究，探究菊芋内生固氮菌的部分特性，为将来进一步研究和应用奠定基础，也可为开发优质环保
的生物菌肥提供菌种资源。
１　材料与方法
１．１　材料
１．１．１　供试材料　供试材料为南芋一号，２００９年１０月采集于南京农业大学江苏大丰“８６３”中试基地。将生长
旺盛的菊芋连根拔起，切取其根系，无菌水将附着的泥土清洗干净，立即用灭菌袋密封，途中置于冰盒中保持低
温，至实验室后立即放入－２０℃冰箱中保存待用。
１．１．２　培养基　Ａｓｈｂｙ培养基（１０００ｍＬ）：用以筛选、培养内生固氮菌的无氮培养基，ＫＨ２ＰＯ４０．２ｇ，ＣａＣＯ３
第２０卷　第６期
Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．６
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ 　　
１５７－１６３
２０１１年１２月
 收稿日期：２０１００９２５；改回日期：２０１０１１１０
基金项目：公益性行业（农业）科研专项经费项目（２００９０３００１０５），国家“９４８”项目（２０１２Ｓ９），国家科技支撑项目（２００９ＢＡＤＡ３Ｂ０４８和
２０１１ＢＡＤ１３Ｂ０９），江苏省科技支撑项目（ＢＥ２０１１３６８和ＢＥ２０１０３０５），教育部博士点基金（２０１０００９７１２００１６）和中央高校基本业务费
项目（Ｙ０２０１１００２４９）资助。
作者简介：孟宪法（１９８７），男，山东青岛人，硕士。Ｅｍａｉｌ：２０１１２０３００９＠ｎｊａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｓｅａ＠ｎｊａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
５ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０．２ｇ，甘露醇１０ｇ，ＮａＣｌ０．２ｇ，琼脂１８ｇ，ＣａＳＯ４·２Ｈ２Ｏ０．１ｇ，ｐＨ７．０±０．２。
Ｐｉｋｏｖａｓｋａｉａ’ｓ培养基（１０００ｍＬ）：用以检测细菌溶解无机磷的能力，Ｃａ３（ＰＯ４）２３．０ｇ，蔗糖 １０．０ｇ，
（ＮＨ４）２ＳＯ４０．５ｇ，ＮａＣｌ０．２ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０．１ｇ，ＫＣｌ０．２ｇ，酵母粉０．５ｇ，ＭｎＳＯ４１ｍＬ（４ｍｇ／Ｌ），ＦｅＳＯ４
（Ｆｅ·ＥＤＴＡ）０．１ｍＬ（２ｍｇ／Ｌ），琼脂１５ｇ，ｐＨ７．０±０．２。
ＣＣＭ培养基（１０００ｍＬ）：用以检测细菌的ＩＡＡ分泌活性，甘露醇５．０ｇ，蔗糖５．０ｇ，乳酸０．５ｍＬ，ＭｇＳＯ４·
７Ｈ２Ｏ０．２ｇ，ＫＨ２ＰＯ４０．２ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４０．８ｇ，ＣａＣｌ２·２Ｈ２Ｏ０．０６ｇ，ＮａＣｌ０．１ｇ，ＮａＭｏＯ４·２Ｈ２Ｏ２．５ｍｇ，酵母
粉０．１ｇ，Ｎａ·Ｆｅ·ＥＤＴＡ４ｍＬ（１．６４％），ＮＨ４ＮＯ３１ｇ，色氨酸０．１ｇ，ｐＨ７．０±０．２。
１．２　固氮菌分离及固氮酶活性测定
１．２．１　固氮菌的分离　菊芋根系采用流水冲洗１ｈ，稍拭干，称取１ｇ，用７０％的酒精浸泡３０～６０ｓ，２％的
ＮａＣｌＯ溶液处理５ｍｉｎ，进行表面灭菌，无菌水冲洗４次，并将最后１次冲洗过的无菌水进行涂布，检测消毒是否
彻底［２０］。
消毒后的菊芋根须用无菌的研钵研磨成浆，转入无菌三角瓶中，静置一段时间后，吸取上清液，梯度稀释至
１０－５～１０－８后，分别取１００μＬ涂布于Ａｓｈｂｙ培养基上，２８℃培养３～４ｄ。挑取培养特征相异的单个菌落纯化，
镜检，斜面保存。交替在ＬＢ培养基和Ａｓｈｂｙ培养基平板上划线转接７～８次，能够正常生长的菌株为固氮菌株，
待测其固氮酶活性。
１．２．２　固氮酶活性检测　纯化得到的固氮菌，利用乙炔还原法检测固氮酶活性，以筛选获得具有高固氮活性的
菌株。将ＬＢ液体培养的固氮菌，稀释至菌体浓度为１０８ 个／ｍＬ，取０．５ｍＬ稀释菌液与Ａｓｈｂｙ半固体培养基２
ｍＬ混匀后，培养于青霉素小瓶中，封口膜封口，每一菌株３个重复，２８℃培养２ｄ。在无菌的条件下将封口膜换
成橡胶塞，用石蜡密封，２８℃下继续培养２ｄ。用无菌注射器从瓶内抽取０．５ｍＬ的空气，随即注入０．５ｍＬ高纯
度的Ｃ２Ｈ４，相同温度下培养２ｄ。从瓶中抽取混合气体１ｍＬ注入ＧＣ５８９０Ｃ型气相色谱议中检测乙烯含量。色
谱条件：氧化铝柱长３ｍ，内径０．５３ｍｍ，柱温为５５℃，检测器温度为２２０℃，进样器温度为１６０℃，载气为Ｎ２，检
测器为火焰离子发生器（ＦＩＤ）。按下式计算固氮酶活性［２１］。
犖＝ 犺狓×犮×狏犺狊×２４．９×狋
其中，犺狓：样品峰值；犺狊：标准Ｃ２Ｈ４ 峰值；犮：标准Ｃ２Ｈ４ 浓度（ｎｍｏｌ／ｍＬ）；狏：培养容器体积（ｍＬ）；狋：样品培养间
（ｈ）；犖：产生的Ｃ２Ｈ４ 浓度（ｎｍｏｌ／ｍＬ·ｈ）；２４．９：常数，为标准浓度的Ｃ２Ｈ４ 在３０℃下测试时的体积（ｍＬ）。
１．３　固氮菌菌株鉴定［２１］
鉴定所得菌株的菌落形态、对各种碳源的适应性、耐盐性以及各种生化反应，以明确菌株的形态特性，生理生
化特性等。通过菌株１６ＳｒＲＮＡ的检测分析，确定其菌属。
１．３．１　菌落形态特性　取０．１ｍＬ菌体浓度为１０８ 个／ｍＬ的稀释菌液，涂布于ＬＢ培养基上，２８℃恒温培养２ｄ
后观察菌落形态特性。
１．３．２　生理生化特性　唯一碳源试验：分别以葡萄糖、麦芽糖、乳糖、菊糖、蔗糖、甘露醇作为唯一碳源取代Ａｓｈ
ｂｙ培养基中的蛋白胨，接种固氮菌，２８℃恒温培养２ｄ后，观察其生长情况。
耐盐性：制备供试菌株的稀释菌液，取０．１ｍＬ分别涂布于ＮａＣｌ浓度为３％～８％的牛肉膏蛋白胨培养基上，
２８℃恒温培养２ｄ后观察菌落生长情况。
生化反应测定：按照东秀珠和蔡妙英［２２］及周德庆［２３］的试验方法，分别检测供试菌株的油脂水解试验、Ｍ．Ｒ．
试验、Ｖ．Ｐ．试验、明胶分解试验、Ｈ２Ｓ的产生、吲哚试验、淀粉水解酶试验、过氧化氢酶试验及革兰氏染色等生化
反应特性。
１．３．３　１６ＳｒＲＮＡ 序列检测　使用１６ＳｒＤＮＡ 的通用引物，进行 ＰＣＲ 扩增，引物序列：引物１，２７ｆ：５′
ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ３′，引物２，１４９２ｒ：５′ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ３′［２４］。引物由南京金斯
瑞生物科技有限公司合成。扩增程序为：９５℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性４０ｓ，５８℃退火３０ｓ，７２℃延长１．５ｍｉｎ，３０
个循环；７２℃下延伸８ｍｉｎ。扩增后，取５μＬ的扩增样品在１％的琼脂糖凝胶上１３０Ｖ电压下进行电泳检测，将
８５１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．６
亮度好、纯度高的特异性条带（１５００ｂｐ左右）回收之后，置于－２０℃下保存，送往上海美季生物技术有限公司测
序，所得基因序列与ＧｅｎｅＢａｎｋ报道序列进行同源性分析。
１．４　固氮菌解磷性及分泌植物生长激素特性检测
检测固氮菌株对无机磷的分解作用以及菌株自身分泌吲哚乙酸（ＩＡＡ）的特性，以利于进一步探究固氮菌对
菊芋的促生机理。
１．４．１　解磷性检测　将１ｍＬ供试菌株的悬浮液（１×１０８ 个／ｍＬ），接种于５０ｍＬＰｉｋｏｖａｓｋａｉａ’ｓ液体培养基中，
每一菌株３个重复，置于摇床上，２８℃，１６０ｒ／ｍｉｎ，培养１０ｄ之后，在４℃下１００００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，对照组除
不接种菌株外，处理相同。采用钼酸铵比色法测定有效磷（Ｐ）的含量［２５］，标准曲线采用ＫＨ２ＰＯ４ 制作。取１ｍＬ
上清液，５ｍＬ钼锑抗显色液，定容至５０ｍＬ，３０℃水浴３０ｍｉｎ后，在７００ｎｍ波长下，进行比色。
１．４．２　ＩＡＡ分泌特性检测　将１ｍＬ供试菌株的悬浮液（１×１０８ 个／ｍＬ）接种于盛有５０ｍＬＣＣＭ 液体培养基
的三角瓶中，每一菌株３个重复，置于摇床上２８℃，１６０ｒ／ｍｉｎ培养１２ｄ，对照除不接种菌株外，处理相同。将菌
株培养液在４℃１００００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ。采用Ｓａｌｋｏｗｓｋｉ比色法［２６］测定其产生植物生长激素的能力，标准曲
线采用３ＩＡＡ制作。取１ｍＬ上清液加比色液（０．５ｍｏｌ／ＬＦｅＣｌ３２ｍＬ，高氯酸１００ｍＬ）后，在黑暗中静止０．５ｈ
后，在５３０ｎｍ波长下，进行比色。
２　结果与分析
２．１　固氮菌分离及固氮酶活性
通过对根内固氮菌的分离、纯化，得到了７株固氮酶活性较高的菌株，编号为ｃｈｏ１～ｃｈｏ５、ｃｈｏ７和ｃｈｏ９。它
们之间的固氮酶活性相差较大，为２６．７４～２０７．３４ｎｍｏｌ／（ｍＬ·ｈ）。固氮酶活性较高的菌株较少，只有ｃｈｏ１和
ｃｈｏ９的固氮酶活性高于１００ｎｍｏｌ／（ｍＬ·ｈ）。菌株ｃｈｏ１的固氮酶活性为２０７．３４ｎｍｏｌ／（ｍＬ·ｈ），与其他菌株差
异显著（表１）。
２．２　固氮菌形态学、生理生化特性及１６ＳｒＲＮＡ鉴定
２．２．１　菌落特性　筛选得到的固氮菌株菌落均呈圆形，表面光滑，粘稠，易挑起，但颜色差异较大。菌株ｃｈｏ２和
ｃｈｏ７的生长速度较慢，菌株ｃｈｏ３则可以在ＬＢ培养基上快速生长（表２）。
表１　菊芋内生固氮菌固氮酶活性
犜犪犫犾犲１　犖犻狋狉狅犵犲狀犪狊犲犪犮狋犻狏犻狋狔狅犳犲狀犱狅狆犺狔狋犻犮犫犪犮狋犲狉犻犪狊狋狉犪犻狀狊犻狊狅犾犪狋犲犱犳狉狅犿犼犲狉狌狊犪犾犲犿犪狉狋犻犮犺狅犽犲 ｎｍｏｌ／（ｍＬ·ｈ）
项目Ｉｔｅｍ ｃｈｏ１ ｃｈｏ２ ｃｈｏ３ ｃｈｏ４ ｃｈｏ５ ｃｈｏ７ ｃｈｏ９
固氮酶活性Ｎｉｔｒｏｇｅｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ ２０７．３４ａ ８５．３１ｂ ２６．７４ｃ ３２．０４ｃ ７５．５３ｂｃ ４０．９４ｃ １０３．５９ｂ
　注：同行不同小写字母表示差异显著（犘＜０．０５），下同。
　Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｔｔｅｒｓｗｉｔｈｉｎｔｈｅｓａｍｅｒｏｗｍｅａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（犘＜０．０５），ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ．
表２　菊芋内生固氮菌菌落形态特性
犜犪犫犾犲２　犆狅犾狅狀狔犿狅狉狆犺狅犾狅犵狔狅犳犲狀犱狅狆犺狔狋犻犮犫犪犮狋犲狉犻犪狊狋狉犪犻狀狊犻狊狅犾犪狋犲犱犳狉狅犿犼犲狉狌狊犪犾犲犿犪狉狋犻犮犺狅犽犲
菌株号
Ｓｔｒａｉｎｃｏｄｅ
菌落特征
Ｃｏｌｏｎｙｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ
ｃｈｏ１ 菌落呈圆形，凸起不明显，表面光滑，粘稠，浅黄色，生长较快。Ｃｉｒｃｕｌａｒ，ｒａｉｓｅｄ，ｓｍｏｏｔｈｂｏｒｄｅｒ，ｒｏｐｙ，ｌｉｇｈｔｙｅｌｏｗ，ｆａｓｔｃｏｌｏｎｙｇｒｏｗｔｈ．
ｃｈｏ２ 菌落呈圆形，凸起不明显，表面光滑，粘稠，浅灰白色，生长较慢。Ｃｉｒｃｕｌａｒ，ｒａｉｓｅｄ，ｓｍｏｏｔｈｂｏｒｄｅｒ，ｒｏｐｙ，ｌｉｇｈｔｙｅｌｏｗ，ｆａｓｔｃｏｌｏｎｙｇｒｏｗｔｈ．
ｃｈｏ３ 菌落呈圆形，凸起不明显，表面光滑，粘稠，浅灰白色，生长快速。Ｃｉｒｃｕｌａｒ，ｒａｉｓｅｄ，ｓｍｏｏｔｈｂｏｒｄｅｒ，ｒｏｐｙ，ｌｉｇｈｔｇｒａｙ，ｆａｓｔｃｏｌｏｎｙｇｒｏｗｔｈ．
ｃｈｏ４ 菌落呈圆形，有凸起，表面光滑，粘稠，黄色，生长较快。Ｃｉｒｃｕｌａｒ，ｃｏｎｖｅｘ，ｓｍｏｏｔｈｂｏｒｄｅｒ，ｒｏｐｙ，ｙｅｌｏｗ，ｆａｓｔｃｏｌｏｎｙｇｒｏｗｔｈ．
ｃｈｏ５ 菌落呈圆形，有凸起，表面光滑，粘稠，灰白色，生长较快。Ｃｉｒｃｕｌａｒ，ｃｏｎｖｅｘ，ｓｍｏｏｔｈｂｏｒｄｅｒ，ｒｏｐｙ，ｇｒａｙ，ｆａｓｔｃｏｌｏｎｙｇｒｏｗｔｈ．
ｃｈｏ７ 菌落呈圆形，凸起不明显，表面光滑，粘稠，浅灰白色，生长较慢。Ｃｉｒｃｕｌａｒ，ｒａｉｓｅｄ，ｓｍｏｏｔｈｂｏｒｄｅｒ，ｒｏｐｙ，ｌｉｇｈｔｇｒａｙ，ｆａｓｔｃｏｌｏｎｙｇｒｏｗｔｈ．
ｃｈｏ９ 菌落呈圆形，有凸起，表面光滑，粘稠，灰白色，生长较快。Ｃｉｒｃｕｌａｒ，ｃｏｎｖｅｘ，ｓｍｏｏｔｈｂｏｒｄｅｒ，ｒｏｐｙ，ｇｒａｙ，ｆａｓｔｃｏｌｏｎｙｇｒｏｗｔｈ．
９５１第２０卷第６期 草业学报２０１１年
２．２．２　生理生化特性　碳源利用特性结果分析表明，待测菌株均对葡萄糖、麦芽糖和蔗糖具有较高的适应性；菌
株ｃｈｏ２和ｃｈｏ４在以乳糖为碳源的培养基上生长不良；菌株ｃｈｏ２在以甘露醇为碳源的培养基上生长不良；菌株
ｃｈｏ２和ｃｈｏ７在以菊糖为唯一碳源的培养基上适应性较差，表现为不生长或生长不良，可见不同菌株对碳源的利
用存在着差异（表３）。
表３　菊芋内生固氮菌对不同碳源利用特性
犜犪犫犾犲３　犝狋犻犾犻狕犪狋犻狅狀犮犺犪狉犪犮狋犲狉犻狊狋犻犮狊狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀狋犮犪狉犫狅狀狊狅狌狉犮犲狊犫狔狋犺犲犲狀犱狅狆犺狔狋犻犮
犫犪犮狋犲狉犻犪狊狋狉犪犻狀狊犻狊狅犾犪狋犲犱犳狉狅犿犼犲狉狌狊犪犾犲犿犪狉狋犻犮犺狅犽犲
菌株号
Ｓｔｒａｉｎｃｏｄｅ
碳源培养基Ｃａｒｂｏｎｓｏｕｒｃｅ
葡萄糖Ｇｌｕｃｏｓｅ 麦芽糖 Ｍａｌｔｏｓｅ 乳糖Ｌａｃｔｏｓｅ 菊糖Ｉｎｕｌｉｎ 蔗糖Ｓｕｃｒｏｓｅ 甘露醇 Ｍａｎｎｉｔｏｌ
ｃｈｏ１ ＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋
ｃｈｏ２ ＋＋ ＋＋＋ ＋ ＋ ＋＋＋ ＋
ｃｈｏ３ ＋＋ ＋＋ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋＋
ｃｈｏ４ ＋＋＋ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋
ｃｈｏ５ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋
ｃｈｏ７ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋ ＋ ＋＋＋ ＋＋＋
ｃｈｏ９ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋
　注：＋，＋＋，＋＋＋分别表示菌株生长情况为，生长，生长较好，生长旺盛。
　Ｎｏｔｅ：＋，＋＋，＋＋＋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｇｒｏｗｔｈ，ｇｏｏｄｇｒｏｗｔｈ，ｌｕｓｈｇｒｏｗｔｈ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
　　待测固氮菌株均能在盐浓度为５％及以下的培养
基上生长，但随着盐浓度的增加，不同菌株间耐盐性差
异较大。ｃｈｏ７和ｃｈｏ９具有较高的耐盐活性，ｃｈｏ４可
以在富盐培养基上正常生长。当盐浓度到达８％时，
菌株均不能生长（表４）。
待测菌株均具有分解色氨酸产生吲哚的能力，并
可以产生过氧化氢酶，且均为革兰氏阴性菌；只有菌株
ｃｈｏ１、ｃｈｏ３、ｃｈｏ４、ｃｈｏ９可以分解硫氨基酸产生 Ｈ２Ｓ；
固氮菌在油脂、明胶、淀粉等水解试验中表现各不相
同，葡萄糖水解产物也各不相同（表５）。
２．２．３　１６ＳｒＲＮＡ序列　测序结果在ＧｅｎＢａｎｋ数据
库中进行比对，结合固氮菌的生理生化特征（表５），本
研究分离筛选出的固氮菌菌株ｃｈｏ１、ｃｈｏ４属于根瘤菌
属；菌株ｃｈｏ２、ｃｈｏ５、ｃｈｏ７属于寡养单胞菌属；菌株
ｃｈｏ３属于假单胞菌属；菌株 ｃｈｏ９ 属于肠杆菌属
（表６）。
表４　菊芋内生固氮菌对犖犪犆犾的耐受性
犜犪犫犾犲４　犖犪犆犾狋狅犾犲狉犪狀犮犲狅犳犲狀犱狅狆犺狔狋犻犮犫犪犮狋犲狉犻犪狊狋狉犪犻狀狊
犻狊狅犾犪狋犲犱犳狉狅犿犼犲狉狌狊犪犾犲犿犪狉狋犻犮犺狅犽犲
菌株号
Ｓｔｒａｉｎｃｏｄｅ
ＮａＣｌ浓度ＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｏｆＮａＣｌ
３％ ４％ ５％ ６％ ７％ ８％
ｃｈｏ１ ＋＋＋ ＋ ＋ － － －
ｃｈｏ２ ＋＋＋ ＋＋ ＋ － － －
ｃｈｏ３ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋ － － －
ｃｈｏ４ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋ ＋ －
ｃｈｏ５ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋ － － －
ｃｈｏ７ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ － －
ｃｈｏ９ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋ ＋ － －
　注：－，＋，＋＋，＋＋＋分别表示菌落生长情况为，不生长，生长，生
长较好，生长旺盛。
　Ｎｏｔｅ：－，＋，＋＋，＋＋＋ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｎｏｇｒｏｗｔｈ，ｇｒｏｗｔｈ，ｇｏｏｄ
ｇｒｏｗｔｈ，ｌｕｓｈｇｒｏｗｔｈ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
２．２．４　固氮菌解磷性及分泌植物生长激素特性　待测固氮菌，均具有分泌生长素的能力，产生的ＩＡＡ浓度为
２．６７～１３．４９μｇ／ｍＬ，其中以ｃｈｏ２为最高；除菌株ｃｈｏ３和ｃｈｏ５不具有解磷活性外，剩余５株固氮菌均具有分解
无机磷的活性，但解磷活性差异较大（表７）。
３　讨论
氮肥在菊芋生物量积累中，起着至关重要的作用［１９］。内生固氮菌定植于宿主植物体内，受到保护的同时，可
有效的为植物提供氮素营养，且不需要与特异性宿主结成根瘤，提高了内生固氮菌的应用范围。同时内生固氮菌
０６１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．６
大多数还具有溶解有机磷、矿物磷，以及分泌植物激素的特性，增强了植株的抗病性和适应性［７］。在研究中发现，
菊芋对土壤肥力要求低，可以在少量施加甚至不施加氮肥的中度和轻度盐碱地生长良好。在施氮量不足的条件
下，菊芋的总生物量可以达到１５０００ｋｇ／（ｈｍ２·年）以上，土壤中氮素处于净消耗状态［２７］。从微生物角度入手，
在发现菊芋根际固氮菌的数量没有显著增加的情况下，从根系中分离得到了７株性状良好的内生固氮菌，分别为
２株根瘤菌属，３株寡养单胞菌属，１株假单胞菌属和１株肠杆菌属。与禾本科植物相比，菊芋根系中的内生固氮
菌的种类较为单一，除常见的内生固氮菌［２８，２９］，如根瘤菌、假单胞杆菌和肠杆菌外，首次发现嗜麦芽窄食单胞菌
（犛狋犲狀狅狋狉狅狆犺狅犿狅狀犪狊犿犪犾狋狅狆犺犻犾犻犪）。
表５　菊芋内生固氮菌的生化反应特性
犜犪犫犾犲５　犅犻狅犮犺犲犿犻犮犪犾犮犺犪狉犪犮狋犲狉犻狊狋犻犮狊狅犳犲狀犱狅狆犺狔狋犻犮犫犪犮狋犲狉犻犪狊狋狉犪犻狀狊犻狊狅犾犪狋犲犱犳狉狅犿犼犲狉狌狊犪犾犲犿犪狉狋犻犮犺狅犽犲
菌株号Ｓｔｒａｉｎｃｏｄｅ Ａ Ｂ Ｃ Ｄ Ｅ Ｆ Ｇ Ｈ Ｉ
ｃｈｏ１ － ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋ ＋ －
ｃｈｏ２ ＋ － － ＋ － ＋ － ＋ －
ｃｈｏ３ ＋ ＋ － － ＋ ＋ － ＋ －
ｃｈｏ４ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ －
ｃｈｏ５ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ － ＋ －
ｃｈｏ７ ＋ － － ＋ － ＋ － ＋ －
ｃｈｏ９ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ － ＋ －
　－，＋分别表示反应呈阴性及阳性Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｐｏｓｉｔｉｖｅａｎｄｎｅｇａｔｉｖｅｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；Ａ：油脂水解试验ｇｒｅａｓｅｌｙｓｉｓ；Ｂ：Ｍ．Ｒ．试验 Ｍ．Ｒ．ｔｅｓｔ；Ｃ：Ｖ．
Ｐ．试验Ｖ．Ｐ．ｔｅｓｔ；Ｄ：明胶分解Ｇｅｌａｔｉｎｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ；Ｅ：Ｈ２Ｓ的产生ＰｒｏｄｕｃｅＨ２Ｓ；Ｆ：吲哚试验Ｉｎｄｏｌｅ；Ｇ：淀粉水解酶试验Ａｍｙｌｏｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ；Ｈ：
过氧化氢酶试验Ｃａｔａｌａｓｅ；Ｉ：革兰氏染色Ｇｒａｍｓｔａｉｎ．
表６　菊芋内生固氮菌菌株名录
犜犪犫犾犲６　犖犪犿犲犾犻狊狋狅犳犲狀犱狅狆犺狔狋犻犮犫犪犮狋犲狉犻犪狊狋狉犪犻狀狊犻狊狅犾犪狋犲犱犳狉狅犿犼犲狉狌狊犪犾犲犿犪狉狋犻犮犺狅犽犲
菌株号
Ｓｔｒａｉｎｃｏｄｅ
属名
Ｇｅｎｅｒａｎａｍｅ
与ＧｅｎｅＢａｎｋ比对结果ＲｅｓｕｌｔｏｆｃｏｎｔｒａｓｔｗｉｔｈＧｅｎｅＢａｎｋ
物种Ｓｐｅｃｉｅｓ 同源性Ｒｅｌａｔｉｖｉｔｙ（％）
ｃｈｏ１ 根瘤菌属犚犺犻狕狅犫犻狌犿ｓｐｐ． 犚犺犻狕狅犫犻狌犿狉犪犱犻狅犫犪犮狋犲狉（ＡＪ３８９８８６） ９９．５
ｃｈｏ２ 寡养单胞菌属犛狋犲狀狅狋狉狅狆犺狅犿狅狀犪狊ｓｐｐ． 犛狋犲狀狅狋狉狅狆犺狅犿狅狀犪狊犿犪犾狋狅狆犺犻犾犻犪（ＤＱ１１３４５４） ９８．９
ｃｈｏ３ 假单胞菌属犘狊犲狌犱狅犿狅狀犪狊ｓｐｐ． 犘狊犲狌犱狅犿狅狀犪狊ｓｐ．１２Ｂ＿３（ＡＹ６８９０７９） ９９．５
ｃｈｏ４ 根瘤菌属犚犺犻狕狅犫犻狌犿ｓｐｐ． 犚犺犻狕狅犫犻狌犿狉犪犱犻狅犫犪犮狋犲狉（ＡＪ３８９８９７） ９９．０
ｃｈｏ５ 寡养单胞菌属犛狋犲狀狅狋狉狅狆犺狅犿狅狀犪狊ｓｐｐ． 犛狋犲狀狅狋狉狅狆犺狅犿狅狀犪狊ｓｐ．ＦＢ２０６（ＡＹ２５９５１９） ９８．２
ｃｈｏ７ 寡养单胞菌属犛狋犲狀狅狋狉狅狆犺狅犿狅狀犪狊ｓｐｐ． 犛狋犲狀狅狋狉狅狆犺狅犿狅狀犪狊犿犪犾狋狅狆犺犻犾犻犪（ＡＦ１００７３４） ９９．５
ｃｈｏ９ 肠杆菌属犈狀狋犲狉狅犫犪犮狋犲狉ｓｐｐ． 犈狀狋犲狉狅犫犪犮狋犲狉ｓｐ．Ｌ３Ｒ２－１（ＥＵ１３９８５１） ９７．０
表７　菊芋内生固氮菌的解磷性及产生的犐犃犃浓度
犜犪犫犾犲７　犘犱犻狊狊狅犾狌狋犻狅狀犪犫犻犾犻狋狔犪狀犱犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狅犳犐犃犃犻狀犲狓狌犱犪狋犲狊狅犳犲狀犱狅狆犺狔狋犻犮犫犪犮狋犲狉犻犪
狊狋狉犪犻狀狊犻狊狅犾犪狋犲犱犳狉狅犿犼犲狉狌狊犪犾犲犿犪狉狋犻犮犺狅犽犲 μｇ／ｍＬ
项目Ｉｔｅｍ ｃｈｏ１ ｃｈｏ２ ｃｈｏ３ ｃｈｏ４ ｃｈｏ５ ｃｈｏ７ ｃｈｏ９
解磷量Ｐｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ ５５．４９ａ ３６．５１ｂ － ２５．１１ｃ － ６３．８４ｄ ４５．２６ｅ
吲哚乙酸ＩＡＡ ６．９８ｂｃ １３．４９ａ ７．０９ｂ ２．７９ｄ ６．１６ｃ ３．２６ｄ ２．６７ｄ
　　菊芋内生高固氮酶活性的菌株较少，但性状良好，它们具有较好耐盐能力，均可在５％的ＮａＣｌ浓度下正常生
长，菌株ｃｈｏ４甚至可以在７％的高盐培养条件下生长。除ｃｈｏ３和ｃｈｏ５外的固氮菌，均具有解磷活性，可以分解
１６１第２０卷第６期 草业学报２０１１年
土壤中的难溶无机磷，将之转变为植物可以吸收利用的有效磷素，以利于菊芋在磷素较少的土壤中生长。所得菌
株均具有较高的ＩＡＡ分泌的特性，分泌的ＩＡＡ可促进菊芋生长，也可促进菊芋根系对土壤中的水分和养分的吸
收并可为有益菌附生创造有利条件，这与许多学者的研究结果相一致［３０］。
综上，试验中从菊芋根部筛选得到的固氮菌株，具有高效的固氮酶活性，能够从空气中固定大量的氮。这使
菊芋具备了耐贫瘠的特性，即使不施加氮肥，也可以积累较高的生物量。同时，菌株还具有良好的解磷性和植物
激素的分泌特性，增强了菊芋的抗逆性，也是菊芋粗放种植、适合盐碱化土壤生长非耕地的可能原因之一。
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ｕｂｉｌｉｚｉｎｇｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｒｏｍｗｉｌｄｒｉｃｅ（犘狅狉狋犲狉犲狊犻犪犮狅犪狉犮狋犪狋犪Ｔａｔｅｏｋａ）［Ｊ］．ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃａｎｄＥｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ
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ｂａｃｔｅｒｉａｏｎｓｅｅｄｌｉｎｇｓｏｆ犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪ａｎｄ犕犲犱犻犮犪犵狅狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪［Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００３，
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犐狊狅犾犪狋犻狅狀犪狀犱犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犲狀犱狅犵犲狀犻犮狀犻狋狉狅犵犲狀犳犻狓犻狀犵犫犪犮狋犲狉犻犪犻狀狋犺犲狉狅狅狋狊
狅犳犑犲狉狌狊犪犾犲犿犪狉狋犻犮犺狅犽犲（犎犲犾犻犪狀狋犺狌狊狋狌犫犲狉狅狊狌狊）
ＭＥＮＧＸｉａｎｆａ，ＬＯＮＧＸｉａｏｈｕａ，ＫＡＮＧＪｉａｎ，ＷＡＮＧＸｕｅｑｉｎｇ，ＬＩＵＺｈａｏｐｕ
（ＣｏｌｅｇｅｏｆＲｅｓｏｕｒｃｅｓａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＪｉａｎｇｓｕＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＭａｒｉｎｅＢｉｏｌｏｇｙ，
ＮａｎｊｉｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００９５，Ｃｈｉｎａ）
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狌狊）ｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｕｓｉｎｇａｃｅｔｙｌｅｎｅｒｅｄｕｃｔｉｏｎａｓｓａｙ（ＡＲＡ）ｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｇａｓｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
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犘狊犲狌犱狅犿狅狀犪狊（１ｓｔｒａｉｎ）ａｎｄ犈狀狋犲狉狅犫犪犮狋犲狉（１ｓｔｒａｉｎ）．Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｉｎｎｉｔｒｏｇｅｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｗｅｒｅｆｏｕｎｄ
ａｍｏｎｇｔｈｅＥＮＢｓｔｒａｉｎｓ．Ｔｈｅｎｉｔｒｏｇｅｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｔｗｏｓｔｒａｉｎｓ，ｃｈｏ１ａｎｄｃｈｏ９，ｗｅｒｅｈｉｇｈｅｒｔｈａｎ１００
ｎｍｏｌ／（ｍＬ·ｈ）．Ｃｈｏ４ｓｔｒａｉｎｈａｄｔｈｅｓｔｒｏｎｇｅｓｔｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅａｎｄｃｏｕｌｄｇｒｏｗｎｏｒｍａｌｙｉｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆ７％ＮａＣｌ．
Ｆｉｖｅｓｔｒａｉｎｓｓｈｏｗｅｄｔｈｅｐｏｗｅｒｏｆｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎａｎｄｓｔｒａｉｎｃｈｏ７ｈａｄｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔａｂｉｌｉｔｙ （６３．８４
μｇ／ｍＬ）．ＡｌｔｈｅＥＮＢｓｔｒａｉｎｓｃｏｕｌｄｅｘｃｒｅｔｅＩＡＡ，ｂｕｔｔｈｅｒｅｗａｓａｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｎｔｈｅａｂｉｌｉｔｙｔｏｄｏｓｏ，
ａｎｄｓｔｒａｉｎｃｈｏ２ｈａｄｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔａｃｔｉｖｉｔｙ（１３．４９μｇ／ｍＬ）．
犓犲狔狑狅狉犱狊：Ｊｅｒｕｓａｌｅｍａｒｔｉｃｈｏｋｅ；ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｓ；ｎｉｔｒｏｇｅｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ；Ｐｓｏｌｕｂｉｌｉｚｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ；ＩＡＡ
３６１第２０卷第６期 草业学报２０１１年