全 文 ：书利用植物生产药用蛋白的进展、局限及应对策略
袁蓓１，２，李京生２，吴燕民１
（１．中国农业科学院生物技术研究所，北京１０００８１；２．深圳市农科集团有限公司，广东 深圳５１８０４０）
摘要：以植物作为生物反应器生产药用蛋白具有廉价、安全、易于存储和运输等优点。越来越多的动物实验及临床
试验研究结果显示，植物表达的外源药用蛋白，比如抗体、抗原、细胞因子等都能诱导机体产生免疫应答反应，但目
前实现商业化的却极少。限制其推广应用的主要原因是外源蛋白在植物中的表达量较低，免疫原性较差。通过表
达系统的选择，载体优化，使用免疫佐剂等方法可以突破这些障碍。本研究综述了近年来利用植物表达药用蛋白
的进展，讨论了限制其推广应用的因素及解决策略，并对利用植物生物反应器生产药用蛋白的前景进行了展望。
关键词：植物生物反应器；药用蛋白；表达量；免疫原性
中图分类号：Ｓ５６７ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１３）０４０２８３１７
犇犗犐：１０．１１６８６／ｃｙｘｂ２０１３０４３４
自１９８３年首次获得转基因植物［１３］至今，在农业及畜牧业领域，利用植物基因工程技术改良作物农艺性
状［４］，提高其对环境的适应能力［５］已经成为增强作物经济价值及生态价值必不可少的手段。随着植物基因工程
技术的不断发展，利用植物表达系统，包括植物组织细胞、植物病毒瞬时表达系统［６，７］、叶绿体表达系统［８，９］等作
为药用蛋白（如抗体、疫苗等）的“分子加工厂”成为植物基因工程发展的新趋势。许多研究证实，植物表达系统具
有表达活性哺乳动物蛋白的能力，并且在产品质量、成本和安全方面已显现出优势。转基因植物表达药用蛋白的
成本仅为微生物发酵培养的２％～１０％，动物细胞培养生产成本的０．１％～１％［１０］。巨大的经济利益推动着研究
的不断深入，越来越多的植物表达的药用蛋白进入临床试验阶段，而重组乙型肝炎疫苗［１１］、用于治疗龋齿的
ＣａｒｏＲＸＴＭ［１２］、新城疫疫苗［１３］、人类生长激素［１４］等更是实现了商业化。
在许多经济落后的国家和地区，基础医疗设施还很不完善，无法达到微生物发酵或动物细胞培养的条件要
求，而药用蛋白又无法长期存储和运输。因此，在这些地区植物生产系统以其在自然条件下即可生产，生产技术
简单而彰显出更大的吸引力。以植物为“工厂”，通过多种基因工程手段实现药用蛋白高水平、高活性表达，将为
人类医疗保健事业做出巨大的贡献。同时植物生物反应器作为“分子农业”的重要组成部分［１５，１６］，也可以改变种
植业过去产值低、产品价格低廉的现状，使农民在传统的种植业中，生产具高附加值的生物工程产品。
１ 转基因植物生产药用蛋白的研究进展
１．１ 抗体
自１９８９年，Ｈｉａｔｔ等［１７］首次在烟草（犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪犮狌犿）中成功表达了能够正确组装并具有功能的免疫球蛋
白以来，多种抗体包括ＩｇＧ、ｓＩｇＡ、ＩｇＭ、嵌合ＩｇＧ抗体、嵌合ＩｇＡ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ片段及具有双特异性ｓｃＦｖ片段
等先后成功的在烟草、马铃薯（犛狅犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿）、水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）、小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿）或拟南芥
（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）的叶片、块茎及种子等器官中表达（表１）。
目前利用植物表达完整抗体可采用３种不同的方法，一种是分别克隆抗体的重链和轻链基因，转化植物后，
再通过有性杂交并筛选获得表达完整抗体的植株［１７，３４］。在分别表达抗体的不同片段时，应尽量选用相同或相似
的启动子，以尽量缩小在不同时期，不同组织中各片段表达量的差异［３５］。以这种方法获得的重组抗体约占总可
溶性蛋白的１％～５％，但需要经历植物的２个世代才能获得，周期较长［１７，３６］。另一种获得重组抗体的方法是，同
第２２卷 第４期
Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．４
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
２８３－２９９
２０１３年８月
收稿日期：２０１２０８２１；改回日期：２０１２１０１５
基金项目：转基因生物新品种培育科技重大专项（２０１１ＺＸ０８００５００４）资助。
作者简介：袁蓓（１９８７），女，河南焦作人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：ｙｕａｎｂｅｉ１９８７１１２１＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：Ｗｕｙｍ６５＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
时转化分别含有抗体不同片段的载体到同一个植物中，以期实现抗体的胞内组装，这种方法缩短了获得抗体的时
间，但其转化难度大，组装效率低，植物表达的抗体仅占可溶性总蛋白的０．０５５％［３７］。为了克服以上问题，将抗体
不同片段的基因同时构建在一个表达盒内，这样便可以快速、高效的获得具有完整结构的重组抗体，但值得注意
的是，启动子和终止子的选择需要更为严格［３８，３９］。
表１ 免疫治疗或免疫诊断植物抗体
犜犪犫犾犲１ 犜犺犲狉犪狆犲狌狋犻犮犪狀犱犱犻犪犵狀狅狊狋犻犮狆犾犪狀狋犪狀狋犻犫狅犱犻犲狊
抗体Ａｎｔｉｂｏｄｙ 疾病Ｄｉｓｅａｓｅ 植物Ｐｌａｎｔｓ 参考文献Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
ＳｃＦｖ 乙肝 ＨｅｐａｔｉｔｉｓＢ 烟草犖．狋犪犫犪犮狌犿 ［１１］
ＳＩｇＡ（ＣａｒｏＲｘ） 龋齿Ｄｅｎｔａｌｃａｒｉｅｓ 烟草犖．狋犪犫犪犮狌犿 ［１２］
ＤｏｘｏＲＸ 癌症副作用Ｃａｎｃｅｒｓｉｄｅｅｆｆｅｃｔｓ 烟草犖．狋犪犫犪犮狌犿 ［１８］
ＳＩｇＡ（ＲｈｉｎｏＲｘ） 普通感冒Ｉｎｆｌｕｚａ 烟草犖．狋犪犫犪犮狌犿 ［１９］
Ｆｖ 非霍奇金淋巴瘤ＮｏｎＨｏｄｇｋｉｎｌｙｍｐｈｏｍａ 烟草犖．狋犪犫犪犮狌犿 ［２０］
ＩｇＧ（ＩＣＡＭ１） 普通感冒Ｉｎｆｌｕｚａ 烟草犖．狋犪犫犪犮狌犿 ［２１］
ＨｂｓＡｂ 疫苗纯化Ｖａｃｃｉｎｅｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ 烟草犖．狋犪犫犪犮狌犿 ［２２］
ＩｇＧ 免疫诊断Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ 苜蓿犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪 ［２３］
ＳｃＦＶ 癌症Ｃａｎｃｅｒ 小麦犜．犪犲狊狋犻狏狌犿 ［２４］
ＳｃＦＶ 癌症Ｃａｎｃｅｒ 水稻犗．狊犪狋犻狏犪 ［２４，２５］
ＳｃＦＶ 癌症Ｃａｎｃｅｒ 水稻犗．狊犪狋犻狏犪 ［２４］
ＳｃＦｖ、ｃｈｉｍｅｒｉｃＩｇＧ 肿瘤Ｔｕｍｏｕｒ 烟草犖．狋犪犫犪犮狌犿 ［２６］
ＳｃＦＶ 淋巴瘤Ｌｙｍｐｈｏｍａ 烟草犖．狋犪犫犪犮狌犿 ［２７］
ＩｇＧ 直肠癌Ｒｅｃｔａｌｃａｒｃｉｎｏｍａ 烟草犖．狋犪犫犪犮狌犿 ［２８］
ＩｇＧ 生殖器疱疹Ｇｅｎｉｔａｌｈｅｒｐｅｓ 大豆犌犾狔犮犻狀犲犿犪狓 ［２９］
ＩｇＡ 疱疹 Ｈｅｒｐｅｓ 莱茵衣藻犆犺犾犪犿狔犱狅犿狅狀犪狊狉犲犻狀犺犪狉犱狋犻犻 ［３０］
ＭＤＸ０６０ 霍奇金淋巴瘤 Ｈｏｄｇｋｉｎｌｙｍｐｈｏｍａ 浮萍犔犲犿狀犪犿犻狀狅狉 ［３１］
ＩｇＧ１ 炭疽病Ａｎｔｈｒａｘ 莱茵衣藻犆．狉犲犻狀犺犪狉犱狋犻犻 ［３２］
烟草犖．狋犪犫犪犮狌犿 ［３３］
究竟何种植物或植物组织最适合用于抗体的商业化生产还没有定论（表１）。大多数研究利用烟草表达抗
体，也有一些通过大豆、水稻、小麦、浮萍、衣藻等表达。表达部位多数选择叶片等绿色组织，其主要优势是具有庞
大的生物量，比如烟草、苜蓿及百脉根（犔狅狋狌狊犮狅狉狀犻犮狌犾犪狋狌狊）等，一年可收获多次，产量可达２～６ｔ／ｈｍ２。不足之处
在于收获的材料需立即处理或短时低温储存，否则抗体蛋白易被降解，并且由于绿色组织中含有大量色素等杂
质，提纯工艺较为复杂。与之相比，种子、果实或块茎中蛋白及脂类成分单一，使重组抗体的纯化变得较为简单，
并且长期常温储存，不会发生降解，有利于长途运输，降低了生产成本，例如，在水稻中表达ｓｃＦｖ，室温下放置半
年抗体水平仍没有显著减少［２４］，含有重组抗体的马铃薯块茎在冷藏室中储藏１８个月后，仍保持５０％的抗体活
性［２９］。但种子、果实或块茎自身的产量较低，因而极大限制了重组抗体的产量。
尽管有大量关于抗体在植物中成功表达的报道，但目前，只有为数不多植物源抗体产品获得批准上市或进行
临床试验。一个是在古巴已经实现商业化的，用于生产重组乙型肝炎病毒疫苗的植物源单克隆抗体［１１］。另一个
是ＣａｒｏＲＸＴＭ，由ＰｌａｎｅｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ公司生产的一种能够抑制口腔内变异链球菌，用于治疗龋齿的单克隆抗
体，在欧洲以医疗设备授权销售，但尚未正式上市。此外，用于癌症的治疗的ＤｏｘｏＲＸ，目前已进入二期临床实
验；ＲｈｉｎｏＲＸ及ＩＣＡＭ１用于普通感冒的预防，一期试验已完成；ＬａｒｇｅＳｃａｌｅＢｉｏｌｏｇｙ公司研制的用于非霍奇金
淋巴瘤的Ｆｖ抗体，正处在一期临床试验阶段。
限制植物源抗体推广上市的因素，除了表达量较低外，糖基化方式的差异，使人们对其安全性产生顾虑。比
４８２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．４
较植物源与动物源蛋白质糖基化方式的差异，显示植物中蛋白的糖基化方式多种多样，一部分含有大量的甘露
糖，另一部分以Ｎ连糖苷键的方式在糖基化位点加入α１，３岩藻糖和β１，２木糖，而动物细胞中却在糖基化位点
加入α１，６岩藻糖、葡萄糖和唾液酸。大量研究表明，糖基化的细微差别并不会影响抗体对抗原的识别和结
合［２３，２６，２９］。同时通过基因工程手段，可以使植物表达与动物细胞中糖基化方式完全相同的免疫球蛋白［４０］。比如
融合内质网滞留信号序列（ＫＤＥＬ），使蛋白的糖基化仅发生在内质网中，只以Ｎ连甘露糖的方式存在［４１］，或者运
用基因敲除的原理，在缺失木糖和岩藻糖糖基化位点的突变体植株［拟南芥、小立碗藓（犘犺狔狊犮狅犿犻狋狉犲犾犾犪狆犪狋犲狀狊）
等］中表达抗体蛋白［４２，４３］，或者运用ＲＮＡｉ技术，调节宿主植物中木聚糖和岩藻聚糖的含量［４４］。此外还可采用基
因敲入的方法，将人的β１，４半乳糖基转移酶与免疫球蛋白基因融合后共表达，结果表明大大增加了免疫球蛋白
的半乳糖基化，同时减少了木糖基化和岩藻糖基化［４５］。当然，也有关于在植物中表达唾液酸同时使植物表达的
重组蛋白的唾液酸化的报道［４６］。以上研究结果表明，糖基化方式存在差异不会影响植物源抗体商业化发展。
１．２ 抗原
全球每年因传染性疾病死亡的人数约占总死亡人数的２５％，其中发展中国家占４５％［４７］。疫苗是防治传染
性疾病最有效的手段。目前使用的常规疫苗多为弱毒疫苗或灭活疫苗，弱毒疫苗易反强，存在安全隐患；而灭活
疫苗往往不能引起足够的免疫应答反应。利用细菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞培养生产病毒抗原蛋白作为疫
苗，可起到较好的免疫保护作用，但其生产工艺复杂、投资成本较高、运输过程需要专门的冷链系统，在发展中国
家每年有超过３千万以上的儿童因支付不起昂贵的疫苗费用而染病。因此，利用植物系统生产廉价、安全高效、
易于大范围推广的疫苗，具有十分重要的社会效益和经济效益。
目前已有１００多种抗原蛋白在植物细胞、植物组织、植物悬浮细胞培养物或瞬时表达系统中得到表达（表
２）。Ｉ期临床试验结果表明植物源疫苗抗原是安全的，通过注射抗原蛋白粗提液或直接饲喂免疫，免疫动物均可
产生免疫应答反应，且在随后的攻毒反应中，可以发挥免疫保护作用［９２］。第一个被许可上市的兽用转基因植物
疫苗是２００６年２月，美国农业部批准的美国ＤｏｗＡｇｒｏｓｃｉｅｎｃｅ公司开发的烟草表达的转基因鸡新城疫植物疫苗
“ＮＥＷＣＡＳＴＬＥＣｏｎｃｅｎｔ”。这具有里程碑意义，推动了其他转基因植物疫苗的发展。兽用猫细小病毒抗原蛋白
植物疫苗已完成临床试验，鸡球虫病毒抗原蛋白植物疫苗的研制已进入ＩＩ期临床试验阶段，狂犬病毒抗原蛋白
已完成Ｉ期临床试验，猪传染性胃肠炎病毒衣壳蛋白及禽流感病毒抗原蛋白可饲疫苗的研制正处在Ｉ期临床试
验阶段。利用植物表达的人用转基因植物疫苗抗原蛋白有十多种，主要包括人类广泛感染的乙肝病毒、ＨＩＶ、大
肠杆菌等病原蛋白。１９９７年，美国ＦＤＡ同意大肠杆菌热敏肠毒素Ｂ亚单位（ＬＴＢ）转基因疫苗的人类临床试
验，试验证实植物细胞可保护抗原在到达小肠粘膜之前不被消化，重组抗原可诱导人体产生系统免疫和粘膜免疫
反应且没有表现出任何不良反应。植物源乙肝病毒表面抗原蛋白、非霍奇金肿瘤植物疫苗的研制已进入ＩＩ期临
床试验阶段。
检索我国国家专利局数据库发现，获得批准的疫苗专利有９项，包括霍乱疫苗（专利号：ＣＮ９９１１９５０５．１）、口
服禽流感疫苗、乙肝表面抗原（专利号：ＣＮ０１１２８４８６．２）、重组口蹄疫疫苗（专利号：ＣＮ００１１１４９１．３）、牛病毒性腹
泻病毒转基因疫苗（专利号：ＣＮ２０１０１０１２０７５９．５）、口蹄疫疫苗（专利号：ＣＮ０１１４５１６６．１；ＣＮ０１１４５１６５．３；
ＣＮ２００５１００１０７２８．３）、丙肝病毒疫苗（专利号：ＣＮ２００６１００７８０４１．８）、乙肝病毒疫苗（专利号：ＣＮ０３１２０９８１．５）。
以畜禽饲用牧草或人类饮食中包含的植物中表达疫苗蛋白，通过直接食用即可获得免疫保护是植物源疫苗
研制的最理想目标。如牧草、番茄、香蕉、马铃薯块茎等，这样不仅可以降低成本，也使得免疫接种变得简便安全。
口服免疫引起免疫应答的给药剂量是注射免疫剂量的１００倍左右，因此提高抗原蛋白在植物中的表达量显得尤
为重要。
此外大量口服转基因植物表达的自身抗原蛋白还可用于治疗自身免疫疾病，比如糖尿病［９３］。
１．３ 其他药用蛋白
近年来，许多其他药用蛋白也实现了在植物中的表达，包括酶类、蛋白替代品、免疫系统刺激或抑制因子、生
物高分子聚合物、生长因子和粘合蛋白等（表３）。
５８２第２２卷第４期 草业学报２０１３年
表２ 植物源疫苗抗原
犜犪犫犾犲２ 犘犾犪狀狋犱犲狉犻狏犲犱狏犪犮犮犻狀犲犪狀狋犻犵犲狀
抗原Ａｎｔｉｇｅｎ 疾病Ｄｉｓｅａｓｅ 植物Ｐｌａｎｔｓ 参考文献Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
大肠杆菌热敏毒素Ｂ亚基犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻ｈｅａｔ
ｌａｂｉｌｅｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎＢｓｕｂｕｎｉｔ
腹泻Ｄｉａｒｒｈｅａ 烟草犖．狋犪犫犪犮狌犿 ［４８］
马铃薯犛．狋狌犫犲狉狅狊狌犿 ［４８５０］
玉米犣犲犪犿犪狔狊 ［５１，５２］
大豆犌．犿犪狓 ［５３］
霍乱毒素Ｂ亚基ＣｈｏｌｅｒａｔｏｘｉｎＢＳｕｂｕｎｉｔ 霍乱Ｃｈｏｌｅｒａ 马铃薯犛．狋狌犫犲狉狅狊狌犿 ［５４，５５］
番茄犛狅犾犪狀狌犿犾狔犮狅狆犲狉狊犻犮狌犿 ［５６］
烟草犖．狋犪犫犪犮狌犿 ［５７］
水稻犗．狊犪狋犻狏犪 ［５８］
乙肝病毒表面抗原 ＨｅｐａｔｉｔｉｓＢｓｕｒｆａｃｅａｎｔｉｇｅｎ 乙肝 ＨｅｐａｔｉｔｉｓＢ 烟草犖．狋犪犫犪犮狌犿 ［５９，６０］
马铃薯犛．狋狌犫犲狉狅狊狌犿 ［６１］
羽扇豆、生菜犔狌狆犻狀狌狊狆狅犾狔狆犺狔犾犾狌狊，
犔犪犮狋狌犮犪狊犪狋犻狏犪
［６１］
香蕉犕狌狊犪狆犪狉犪犱犻狊犻犪犮犪 ［６２］
番茄犛．犾狔犮狅狆犲狉狊犻犮狌犿 ［６３］
炭疽病抗原Ａｎｔｈｒａｘａｎｔｉｇｅｎ 炭疽病Ａｎｔｈｒａｘ 番茄犛．犾狔犮狅狆犲狉狊犻犮狌犿 ［６４］
狂犬病毒糖蛋白Ｒａｂｉｅｓｖｉｒｕｓｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ 狂犬病Ｒａｂｉｅｓ 番茄犛．犾狔犮狅狆犲狉狊犻犮狌犿 ［６５］
ＴＧＥＶ衣壳蛋白ＴＧＥＶｃａｐｓｉｄｐｒｏｔｅｉｎ 猪传染性胃肠炎 Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅｇａｓ
ｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓｏｆｓｗｉｎｅ
玉米犣．犿犪狔狊 ［６６］
烟草犖．狋犪犫犪犮狌犿 ［６６］
拟南芥犃．狋犺犪犾犻犪狀犪 ［６７］
诺瓦克病毒衣壳蛋白Ｎｏｖａｋｖｉｒｕｓｃａｐｓｉｄｐｒｏｔｅｉｎｓ 腹泻Ｄｉａｒｒｈｅａ 马铃薯犛．狋狌犫犲狉狅狊狌犿 ［６８７０］
烟草犖．狋犪犫犪犮狌犿 ［６８，６９］
番茄犛．犾狔犮狅狆犲狉狊犻犮狌犿 ［６８］
犬细小病毒抗原蛋白Ｃａｎｉｎｅｐａｒｖｏｖｉｒｕｓａｎｔｉｇｅｎｉｃ
ｐｒｏｔｅｉｎ
犬细小病毒病Ｃａｎｉｎｅｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ 烟草犖．狋犪犫犪犮狌犿 ［７１］
兔乳头瘤病毒抗原蛋白 Ｒａｂｂｉｔｐａｐｉｌｏｍａｖｉｒｕｓ
ａｎｔｉｇｅｎｉｃｐｒｏｔｅｉｎ
兔乳头瘤Ｒａｂｂｉｔｐａｐｉｌｏｍａ 烟草犖．狋犪犫犪犮狌犿 ［７２］
人乳头瘤病毒衣壳蛋白 Ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｏｍａｖｉｒｕｓ
ｃａｐｓｉｄｐｒｏｔｅｉｎｓ
宫颈癌Ｃｅｒｖｉｃａｌｃａｒｃｉｎｏｍａ 烟草，马铃薯犖．狋犪犫犪犮狌犿，犛．
狋狌犫犲狉狅狊狌犿
［７３］
人巨细胞病毒糖蛋白Ｂ亚基 Ｈｕｍａｎｃｙｔｏｍｅｇａｌｏ
ｖｉｒｕｓｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎＢｓｕｂｕｎｉｔ
恶性肿瘤，孕妇早产 Ｔｕｍｏｕｒ，ｐｒｅ
ｍａｔｕｒｅｂｉｒｔｈ
烟草犖．狋犪犫犪犮狌犿 ［７４］
ＶＰ６０ 兔出血症Ｒａｂｂｉｔｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｄｉｓｅａｓｅ 马铃薯犛．狋狌犫犲狉狅狊狌犿 ［７５］
ＶＰ１ 口蹄疫Ｆｏｏｔａｎｄｍｏｕｔｈｄｉｓｅａｓｅ 拟南芥犃．狋犺犪犾犻犪狀犪 ［７６］
苜蓿犕．狊犪狋犻狏犪 ［７７］
衣藻犆犺犾犪犿狔犱狅犿狅狀犪狊 ［７８，７９］
烟草犖．狋犪犫犪犮狌犿 ［８０］
新城疫病毒 ＨＮ抗原蛋白 Ｎｅｗｃａｓｔｌｅｄｉｓｅａｓｅｖｉ
ｒｕｓＨＮａｎｔｉｇｅｎ
新城疫Ｎｅｗｃａｓｔｌｅｄｉｓｅａｓｅ 烟草悬浮细 胞 犖．狋犪犫犪犮狌犿
ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｅｌ
［１３］
鼠疫杆菌融合抗原蛋白Ｆ１Ｖｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ 肺炎型鼠疫Ｐｎｅｕｍｏｎｉｃｐｌａｇｕｅ 生菜犔．狊犪狋犻狏犪 ［８１］
烟草犖．狋犪犫犪犮狌犿 ［８２，８３］
呼吸道合胞病毒Ｆ蛋白Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｃｙｔｉａｌｖｉ
ｒｕｓＦｐｒｏｔｅｉｎ
呼吸道合胞病毒肺炎 Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ
ｓｙｎｃｙｔｉａｌｖｉｒｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａ
番茄犛．犾狔犮狅狆犲狉狊犻犮狌犿 ［８４］
６８２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．４
续表２ Ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ
抗原Ａｎｔｉｇｅｎ 疾病Ｄｉｓｅａｓｅ 植物Ｐｌａｎｔｓ 参考文献Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
牛瘟病毒血凝素抗原蛋白 Ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔｖｉｒｕｓｈｅ
ｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｐｒｏｔｅｉｎａｎｔｉｇｅｎ
牛瘟Ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ 木豆Ｐｉｇｅｏｎｐｅａ ［８５］
麻风病毒血凝素抗原蛋白Ｌｅｐｒｉａｓｉｓｖｉｒｕｓｈｅｍａｇ
ｇｌｕｔｉｎｉｎｐｒｏｔｅｉｎａｎｔｉｇｅｎ
麻风病Ｌｅｐｒｉａｓｉｓ 烟草犖．狋犪犫犪犮狌犿 ［８６］
病毒样颗粒Ｖｉｒｕｓｌｉｋｅｐａｒｔｉｃｌｅ Ｈ１Ｎ１禽流感 Ｈ１Ｎ１ａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａ 烟草犖．狋犪犫犪犮狌犿 ［８７］
禽流感血凝素抗原蛋白 Ａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａｈｅｍａｇ
ｇｌｕｔｉｎｉｎｐｒｏｔｅｉｎａｎｔｉｇｅｎ
Ｈ５Ｎ１禽流感 Ｈ５Ｎ１ａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａ 百脉根犔．犮狅狉狀犻犮狌犾犪狋狌狊 ［８８］
ＺＰ３ＴＭＶ衣壳蛋白ＺＰ３ＴＭＶｃａｐｓｉｄｐｒｏｔｅｉｎ 免疫避孕Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｔｒａｃｅｐｔｉｏｎ 烟草犖．狋犪犫犪犮狌犿 ［８９］
牛痘病毒抗原蛋白Ｃｏｗｐｏｘｖｉｒｕｓａｎｔｉｇｅｎ 天花Ｓｍａｌｐｏｘ 烟草犖．狋犪犫犪犮狌犿 ［９０］
ＳＡＲＳ冠状病毒Ｓ蛋白ＳＡＲＳＣｏｒｏｎａｖｉｒｕｓＳｐｒｏ
ｔｅｉｎ
ＳＡＲＳ 番茄、烟草犛．犾狔犮狅狆犲狉狊犻犮狌犿，
犖．狋犪犫犪犮狌犿
［９１］
第一个实现在植物中表达的药用蛋白是１９８６年通过烟草愈伤组织表达的人类生长激素［１４］。到目前为止，
进入市场的植物源药用蛋白包括乳铁蛋白、重组人内因子、生长因子、载脂蛋白等，同时还有大量的其他植物源药
用蛋白正处在临床试验阶段，相信在不久的将来，会有更多的药用蛋白通过植物表达，并安全高效的发挥其药物
学作用，以低廉的价格使更多发展中国家的人民受益。
综上所述，利用植物表达系统生产药用蛋白取得了显著的成就，但表达量低、免疫原性差等缺点限制了它的
进一步发展与扩大化生产。如何采取有效手段解决这些问题，是促进植物生产药物蛋白商业化的当务之急。
２ 提高表达量及增强免疫原性的策略
影响重组药用蛋白在植物中表达量的因素包括很多方面，比如表达系统的选择、外源基因的整合、基因表达
水平、蛋白的分拣与定位和分离纯化等。而增强药用蛋白的免疫原性则可采取多种疫苗联用，或者使用免疫佐剂
等方法。
２．１ 表达系统的选择
植物表达系统包括核转化系统、叶绿体转化系统、植物悬浮细胞培养技术和瞬时转化系统。目前绝大多数重
组蛋白通过核转化系统表达，核转化系统可稳定遗传，能够进行药用蛋白的翻译后加工及折叠过程，形成具有活
性的重组蛋白［１１８］。但其生产周期长，表达量低，且如果与近缘作物或杂草杂交，会造成基因漂移。叶绿体转化
系统也是一种稳定的遗传转化系统。由于每个植物细胞中含有约１００００个叶绿体拷贝，重组蛋白的表达量可达
到可溶性蛋白的７０％［１１９］。并且由于花粉中不含叶绿体，这样就给基因漂移设下了天然的生物屏障。但叶绿体
表达系统与原核表达系统相似，无法进行高级蛋白的翻译后加工。并且虽然有关于番茄、茄子（犛狅犾犪狀狌犿犿犲犾狅狀
犵犲狀犪）、生菜、大豆叶绿体转化系统成功建立的报道［１２０，１２１］，常规的叶绿体转化系统仍局限在烟草中。植物细胞悬
浮培养体系在无菌条件下，可快速、廉价、均质地生产高纯度药用蛋白。比如用于治疗新城疫的 ＨＮ抗原蛋白［１３］
和用于治疗高雪氏症的葡糖脑苷脂酶［１１７］。但它也不是最理想的表达系统，因为随着重组药用蛋白的不断表达，
体系中的蛋白酶含量随之增高，不利于重组蛋白的大量积累，且较为成熟的植物悬浮细胞培养体系只有在烟草、
拟南芥、胡萝卜（犇犪狌犮狌狊犮犪狉狅狋犪）和水稻中建立［１２２］。瞬时转化系统包括农杆菌介导的瞬时转化系统、病毒介导的
瞬时转化系统及近年来新兴的 Ｍａｇｎｉｆｅｃｔｉｏｎ技术。瞬时转化系统快速、高效，但稳定性较差，无法稳定遗传，需
要重复转化，不利于推广应用。
总之，没有任何一种表达系统是完美的，根据目的蛋白的性质及用途选择适合的表达系统，是实现药用蛋白
高水平表达的基础。
２．２ 外源基因的整合
通过增加目的基因的拷贝数来获得高表达重组药用蛋白的转基因植株是利用植物生产药用蛋白研究中不可
７８２第２２卷第４期 草业学报２０１３年
或缺的。在稳定遗传转化系统中，通过单拷贝纯合植株的自交或高表达植株间的杂交都能有效的增加外源基因
的拷贝数及表达水平，并且这种方法获得的多拷贝转化植株不易引起基因沉默［１２３］。在目的基因拷贝数一定时，
可通过把目的基因整合到染色质转录活跃区进行目的基因的高表达。目前主要通过以下２种策略实现目的基因
在染色质转录高活跃区的整合。一是选择基因的弱化表达，使大量整合在低表达位点的细胞由于选择标记基因
表达量不够而在选择培养基条件下不能存活，只有那些少量整合在转录活跃区的细胞由于表达了足够的选择基
因产物才能存活下来形成抗性植株。二是在表达载体上添加基因的某些调控序列（如骨架基质结合区，ＭＡＲｓ），
使表达载体整合到宿主细胞的染色体后能阻断整合位置附近染色体的构象对外源基因表达单元的影响，即消除
位置效应。
表３ 植物源其他药用蛋白
犜犪犫犾犲３ 犜犺犲狆狉狅犱狌犮狋犻狅狀狅犳犫犻狅狆犺犪狉犿犪犮犲狌狋犻犮犪犾狆狉狅狋犲犻狀狊
蛋白Ｐｒｏｔｅｉｎ 用途Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ 植物Ｐｌａｎｔｓ 参考文献Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
人体蛋白ＣＨｕｍａｎｐｒｏｔｅｉｎＣ 抗凝剂Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ 烟草犖．狋犪犫犪犮狌犿 ［９４］
水蛭素 Ｈｉｒｕｄｉｎ 凝血酶抑制剂Ｔｈｒｏｍｂｉｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒ 油菜犅狉犪狊狊犻犮犪犮犪犿狆犲狊狋狉犻狊 ［９４］
人类表皮生长因子ＥＧＦｒｅｃｏｍｂｉｎａ 伤口修复和细胞再生 Ｗｏｕｎｄｈｅａｌｉｎｇ，ｃｅｌｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ 烟草犖．狋犪犫犪犮狌犿 ［９４］
α干扰素αｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ 乙肝、丙肝 ＨＢＶ，ＨＣＶ 水稻犗．狊犪狋犻狏犪 ［９４］
血红蛋白 Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ 血液替代品Ｂｌｏｏｄｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ 烟草犖．狋犪犫犪犮狌犿 ［９４］
α１抗胰蛋白酶α１ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ 蛋白酶抑制剂Ｐｒｏｔｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ 水稻犗．狊犪狋犻狏犪 ［９５］
抑肽酶Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ 胰蛋白酶抑制剂Ｔｒｙｐｓｉｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒ 玉米犣．犿犪狔狊 ［９５］
血管紧张肽转化酶 Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎｃｏｎ
ｖｅｒｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅ
高血压 Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ 烟草、番茄 犖．狋犪犫犪犮狌犿，犛．犾狔
犮狅狆犲狉狊犻犮狌犿
［９５］
大豆犌．犿犪狓 ［９６］
生长激素Ｇｒｏｗｔｈｈｏｒｍｏｎｅ 生长激素Ｇｒｏｗｔｈｈｏｒｍｏｎｅ 烟草、水稻悬浮细胞 犖．狋犪犫犪
犮狌犿，犗．狊犪狋犻狏犪ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｅｌ
［９７９９］
红细胞生成素Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ 贫血症Ａｎｅｍｉａ 烟草犖．狋犪犫犪犮狌犿 ［１００］
脑啡呔Ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ 反超镇痛剂Ａｎｔａｌｇｅｓｉｃ 拟南芥犃．狋犺犪犾犻犪狀犪 ［１００］
β干扰素βｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ 乙肝、丙肝 ＨＢＶ，ＨＣＶ 烟草犖．狋犪犫犪犮狌犿 ［１００］
血清白蛋白Ｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ 肝硬化、烧伤、外科手术Ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ，ｂｕｒｎ，ｓｕｒｇｅｒｙ 烟草犖．狋犪犫犪犮狌犿 ［１００］
γ干扰素γｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ 乙肝、丙肝 ＨＢＶ，ＨＣＶ 水稻悬浮细胞犗．狊犪狋犻狏犪ｓｕｓｐｅｎ
ｓｉｏｎｃｅｌ
［１０１］
三聚体胶原蛋白Ｔｒｉｍｅｒｃｏｌａｇｅｎ 胶原蛋白Ｃｏｌａｇｅｎ 烟草犖．狋犪犫犪犮狌犿 ［１０２］
乳铁蛋白Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ 抗菌剂Ａｎｔｉｓｅｐｔｉｃｓ 马铃薯犛．狋狌犫犲狉狅狊狌犿 ［１０３］
水稻犗．狊犪狋犻狏犪 ［１０４］
抗生物素蛋白Ａｖｉｄｉｎ 分子标记 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｓ 玉米犣．犿犪狔狊 ［１０５］
牛胰蛋白酶Ｂｏｖｉｎｅｔｒｙｐｓｉｎ 蛋白降解Ｐｒｏｔｅｉｎｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ 玉米犣．犿犪狔狊 ［１０６］
牛β酪蛋白Ｂｏｖｉｎｅβｃａｓｅｉｎ 食品添加剂Ｆｏｏｄａｄｄｉｔｉｖｅｓ 大豆犌．犿犪狓 ［１０７］
艾滋病毒杀菌剂 ＨＩＶｍｉｃｒｏｂｉｃｉｄｅｓ 抑制艾滋病传播ＩｎｈｉｂｉｔｔｈｅｓｐｒｅａｄｏｆＡＩＤＳ 玉米犣．犿犪狔狊 ［１０８］
大豆犌．犿犪狓 ［１０９］
溶菌酶Ｌｙｓｏｚｙｍｅ 抑菌剂Ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔ 水稻犗．狊犪狋犻狏犪 ［１１０，１１１］
剪股颖犃犵狉狅狊狋犻狊狊狋狅犾狅狀犻犳犲狉犪
长链不饱和脂肪酸Ｌｏｎｇｃｈａｉｎｐｏｌｙ
ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄｆａｔｔｙａｃｉｄｓ
食品添加剂Ｆｏｏｄａｄｄｉｔｉｖｅｓ 小立碗藓犘．狆犪狋犲狀狊 ［１１２］
红细胞生成素Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ 慢性肾性贫血Ｃｈｒｏｎｉｃｒｅｎａｌａｎｅｍｉａ 小立碗藓犘．狆犪狋犲狀狊 ［１１３］
烟草犖．狋犪犫犪犮狌犿 ［１１４］
白介素Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ 克罗恩病Ｃｒｏｈｎ’ｓｄｉｓｅａｓｅ 水稻犗．狊犪狋犻狏犪 ［１１５］
番茄犛．犾狔犮狅狆犲狉狊犻犮狌犿 ［１１６］
葡糖脑苷脂酶Ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ 高雪氏病Ｇａｕｃｈｅｒ’ｓｄｉｓｅａｓｅ 烟草犖．狋犪犫犪犮狌犿 ［１１７］
８８２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．４
２．３ 复制水平
在病毒介导的瞬时转化系统中，药用蛋白基因编码序列与病毒复制酶基因以外的其他基因同框融合［６］，将病
毒的复制酶基因与药用蛋白基因同时整合入植物的基因组中，可实现病毒载体中的药用蛋白基因在植物内的高
水平稳定表达［６５］，比如近年来发展起来的 Ｍａｇｎｉｆｅｃｔｉｏｎ技术，通过农杆菌将病毒复制子转入植物宿主细胞内，外
源蛋白的瞬时表达量可达总可溶性蛋白的８０％［９９］。
２．４ 转录水平
２．４．１ 启动子 启动子的选择是提高外源基因表达水平的关键。启动子不仅影响转录水平，它还决定了外源基
因表达的时空特异性。常用的启动子分为组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子和人工合成启动子。
最常见的组成型启动子为花椰菜花叶病毒３５Ｓ（ＣａＭＶ３５Ｓ）启动子和泛素启动子，分别应用于双子叶植物和单子
叶植物。其他组成型启动子包括甘露碱合成酶启动子、烟草组成型启动子、水稻肌动蛋白启动子、香蕉肌动蛋白
启动子及木尔坦棉花曲叶病毒Ｃ１启动子等。在组成型启动子控制下，外源基因在植物的不同组织、不同时期表
达水平基本相同，因此当受体植物具有较大的生物量时，选择组成型启动子可大量表达外源基因。但由于外源基
因持续表达对植物体内底物分子大量消耗，往往会影响宿主植物的生长发育。目前利用组成型启动子调控表达
的药用蛋白包括单克隆抗体、ＣＴＢ、ＬＴＢ、ＨＢｓＡｇ、人类生长激素、抗生素蛋白、白介素等［１４，２３，４８，５６，５９，６３，１０５，１１６］。
组织特异性启动子调控下的基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达，并表现出发育调节的特性。这
样外源基因的表达就几乎不影响宿主植物的生长发育，并且在植物的种子或果实中表达有利于外源蛋白的浓缩，
提高收获效率，简化下游加工过程。常用的组织特异性启动子有马铃薯块茎蛋白ｐａｔａｔｉｎ启动子、番茄特异性启
动子Ｅ８、种子特异性启动子、叶片特异性启动子等，实现了药用蛋白（ＬＴＢ、口蹄疫ＶＰ１抗原蛋白、ＣＴＢ、ＨＢｓＡｇ
等）特异性在马铃薯块茎、番茄果实、玉米种子、水稻种子、烟草叶片等组织中的特异性表达［１７，４８，５４，６１，９７，１１５］。Ｖｅｎ
ｔｒｉａＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ生物公司利用种子特异性启动子在玉米和水稻中生产乳铁蛋白和溶菌酶［１０３，１０４，１１０，１１１］。此外，２００９
年，Ｗａｋａｓａ等［１２４］描述了一种在水稻愈伤组织中高表达外源基因的愈伤组织特异性启动子。绿原酸生物股份有
限公司利用叶绿体特异性启动子建立了烟草叶绿体遗传转化体系，ＤｏｗＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓＬＬＣ公司获得了其独家使
用权，并用于生产霍乱疫苗、干扰素等产品［５４，５５，９４］。
诱导型启动子的转录活性受某些特定的物理或化学信号、外界环境变化的调节，比如乙醇、四环素等化学成
分的浓度，干旱、盐胁迫、温度变化、光刺激等环境因素，机械损伤等物理因素都可能诱导基因的特异性表达。与
组织特异性启动子相比，诱导型启动子对外源基因表达的调控更为严格。当然这要依赖于诱导物的特异性和可
调节性。从水稻中分离获得的α淀粉酶基因的启动子是一个蔗糖饥饿诱导型启动子，在它的调控下γ干扰素及
生长激素在水稻悬浮细胞中实现可控表达［１０１，１２５］。
以上３种启动子都可以实现外源基因的表达与调控，但为了进一步提高外源基因的表达水平，人们通过修饰
不同启动子的顺式作用元件、改变启动子中顺式作用元件的拷贝数和它们之间的间隔，合成了人工启动子。可显
著提高外源基因的表达水平。如重复ＣａＭＶ３５启动子的增强子序列，构建双３５Ｓ启动子，可显著提高外源基因
的表达水平［３３，１０２］。复合启动子Ｍａｃ启动子（由甘露碱合成酶基因启动子与ＣａＭＶ３５Ｓ启动子的双增强子序列
杂合而成）与双３５Ｓ启动子相比，使犌犝犛基因在烟草叶片中的表达量增加了３～５倍，在根和下胚轴中增加了
１０～１５倍［１２６］。Ｐｏｇｒｅｂｎｙａｋ等［９１］构建了一个超级启动子，由 Ｍａｃ启动子串联３个章鱼碱合酶启动子的活化子
序列和一个 Ｍａｃ启动子的活化子元件复合而成，该启动子已用于ＳＡＲＳ冠状病毒Ｓ蛋白的表达。１９９５年首次
有关于双向启动子构建的报道［１２７］，２００５年Ｓａｍｍａｒｃｏ和Ｇｒａｂｃｚｙｋ［１２８］报道称，他们构建了一个由四环素诱导的
双向启动子，可以实现２个不同基因的同时快速诱导表达。Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ等［１２９］构建的包含多个顺式调控元件的双
向启动子可以实现２个反向基因的同时高水平表达。双向启动子的构建对于药用蛋白在植物中的表达具有十分
重要的意义，同时双向表达２个基因，可以提高转基因的效率，并且降低了空间位阻，有利于重组蛋白的高水平表
达。
２．４．２ 转录因子 转录因子是一群能与基因５′端上游特定序列专一性结合，从而保证目的基因以特定的强度
在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。多项研究表明共表达转录因子可提高转基因植物中重组蛋白的表达水
９８２第２２卷第４期 草业学报２０１３年
平［１３０，１３１］。Ｙａｎｇ等［１３２］指出，在水稻中表达转录因子ＲＥＢ（水稻胚乳ｂＺＩＰ），可以使外源溶菌酶的表达量提高２～
４倍。如果转录因子本身可直接与他所调节的启动子结合，那么通过正反馈调节，转录因子的表达水平会进一步
得到提高［１３３］，从而进一步增强重组蛋白基因的表达。实现转录因子与重组蛋白共表达可以通过构建双价载体，
或通过分别含有转录因子与重组蛋白转基因植株间的杂交，或利用瞬时转化系统向重组蛋白转基因植株提供转
录因子［１３４］，再者也可利用质体转化向定位在质体中的重组蛋白提供转录因子［１３５］等。利用组成型启动子持续表
达转录因子，会产生大量畸形植株，有些还会导致不育［１３２］。这是由于同一转录因子在不同细胞、植物生长发育
的不同时期发挥的作用是不同的。因此采用组织特异性启动子，比如胚乳特异性启动子调节转录因子的表达，既
可提高重组蛋白的表达水平，又不影响植株的生长发育［１３６，１３７］。
２．４．３ 终止子 转录终止子位于ｐｏｌｙ（Ａ）位点下游，通过终止转录和对 ｍＲＮＡ３′端的加工调节转录水平，进而
影响外源基因在植物中的表达水平。常用的终止子有胭脂碱合酶终止子、章鱼碱合酶终止子、ＣａＭＶ３５终止子、
１环丙胺１羧酸盐合酶终止子、热击蛋白１８．２终止子、核酮糖１，５二磷酸羧化／氧化酶小亚基２ｂ终止子、泛素５
终止子等。Ｎａｇａｙａ等［１３８］分别比较了以上终止子，发现即使使用不同的启动子及不同的植物宿主，热击蛋白１８．２
终止子在提高外源基因表达水平上都是效率最高的，因为在热击蛋白１８．２终止子的作用下，ｍＲＮＡ的积累水平
得到提高。
２．５ 翻译水平
２．５．１ ｍＲＮＡ的稳定性 当重组蛋白的基因被成功转录后，ｍＲＮＡ的稳定性是决定重组蛋白表达水平的重要
因素。影响ｍＲＮＡ稳定性的序列元件包括：ｍＲＮＡ５′端帽子结构、５′ＵＴＲ、３′ＵＴＲ等。帽结构具有两方面的功
能：其一是保护ｍＲＮＡ分子５′末端免受核酸酶的降解作用，从而维持分子的稳定性；其二是提高ｍＲＮＡ分子在
真核蛋白质合成体系中的转译活性。从帽子结构到起始密码子ＡＵＧ之间的序列称为５′非翻译区，即５′ＵＴＲ，
它是核糖体识别元件之一。５′ＵＴＲ可以影响ｍＲＮＡ半衰期，由此间接调控 ｍＲＮＡ稳定性。而３′ＵＴＲ以其独
具的茎环结构在诸种元件中显得最为引人注目。然而３′ＵＴＲ序列中包含一些富含ＡＵ的区域，会降低 ｍＲＮＡ
的稳定性。在基因合成或修饰时通过改变ｍＲＮＡ的５′ＵＴＲ序列，避免３′ＵＴＲ中的ＡＵ富含区，采用某些异源
植物或植物病毒中的３′ＵＴＲ序列等方式，可以提高 ｍＲＮＡ 的稳定性，进而改变 ｍＲＮＡ 翻译效率［１３９，１４０］。
ｍＲＮＡ的降解起始于ｐｏｌｙ（Ａ）降解或断裂位点断裂。通过保护 ｍＲＮＡ分子内的断裂位点，也可以增强 ｍＲＮＡ
的稳定性。此外，内含子在增强ｍＲＮＡ稳定性方面也有着重要的作用，在构建重组基因时，使用可以改善基因
核加工稳定性的内含子取代基因自身内含子［１４１，１４２］，可提高重组蛋白的表达水平。在许多情况下，某些特定的细
胞外因素也会影响到胞内ｍＲＮＡ分子的稳定性。例如葡萄糖会增强胰岛素 ｍＲＮＡ的稳定性；生长激素有助于
催乳素ｍＲＮＡ的稳定性等［１４３］。
２．５．２ 起始密码子侧翼序列 真核生物中翻译起始的扫描模型认为，核糖体与 ｍＲＮＡ的５′末端结合，然后沿
着ｍＲＮＡ扫描直至起始密码子ＡＵＧ后，起始翻译过程。研究表明，ＡＵＧ侧翼序列在翻译起始过程中发挥重要
作用，ＡＡＣＡＡＵＧＧＣ，ＵＡＡＡＣＡＡＵＧＧＣＵ和ＧＣＣＡＵＧＧＣＧ侧翼序列常存在于高表达的基因序列起始位点
上下游，被认为是有利于翻译起始的序列［１４４］。高水平表达基因起始密码子的－３位点多为嘌呤碱基，而＋４、＋５
位点多为ＧＣ［１４５］，在起始密码子之后连接ＧＣＴＴＣＣＴＣＣ或在起始密码子之前添加ＡＣＣ或ＡＣＡ都可增强翻译
起始效率［１４６］。Ｎ端 Ｍｅｔ后连接ＡｌａＳｅｒＳｅｒＧＵＳ，可使ＧＵＳ活性提高３０～４０倍［１４７］。
２．５．３ 编码区 编码区内近起始密码子位点，如果存在茎环结构，会使４０Ｓ核糖体起始复合物的移动速度减
慢，这有助于起始复合物与起始密码子的识别，有助于翻译起始，起始密码子与茎环结构间的距离以１４个核苷
酸最佳［１４８］。但是如果二级结构存在于较远位置或编码区存在连续稀有密码子时，会使核糖体的移动速度减慢
甚至从ｍＲＮＡ上脱落，导致翻译终止［１４９］。因此进行密码子优化时，在不改变重组蛋白氨基酸序列的前提下，翻
译起始序列应与植物的Ｋｏｚａｋ序列保持一致［１５０］，利用密码子的简并性，按照宿主植物偏爱密码子对外源基因进
行优化，可完全化学合成新基因或采用定点突变方法去除稀有密码子。每个密码子对应特定的ｔＲＮＡ分子，正
是由于宿主植物中ｔＲＮＡ的浓度决定了其密码子偏爱性。因此在优化基因序列时，应避免连续使用相同密码
子，使得同一类ｔＲＮＡ分子被大量占用，从而降低翻译效率。在烟草中表达ＣＴＢ抗原蛋白，按照烟草偏爱密码子
０９２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．４
进行优化并提高ＧＣ含量，优化后的犆犜犅基因表达量提高了１５倍［５７］。在植物中表达外源蛋白，还要注意液泡
定位信号的去除，防止蛋白酶降解造成的损失［１５１］。此外有研究表明，少数内含子的存在对基因的表达量可以起
到正调节的作用。将玉米中ｓｈｒｕｎｋｅｎＩ基因的内含子１添加到报告基因的５′端，报告基因的活性提高了１００
倍［１５２］。
２．６ 翻译后水平
２．６．１ 蛋白的分拣和定位 重组蛋白合成后，利用不同定位信号可以定位于不同的亚细胞结构中，包括内质网、
叶绿体、线粒体、存储型液泡或直接分泌到细胞外。亚细胞结构的生理生化环境、存储空间等多种因素都影响着
蛋白的积累水平。为外源蛋白选择合适的分拣部位，有助于其高浓度富集。
内质网具有较大空间，并且外源蛋白在内质网中大量积累不会影响植物的生长发育。在重组蛋白Ｃ添加内
质网滞留信号序列ＫＤＥＬ，可以增加外源蛋白在内质网中的积累水平［１５３］。γ玉米蛋白的内质网滞留信号是近年
来新发现的一个比ＫＤＥＬ序列更有效的内质网滞留信号，以Ｎ端８９个氨基酸γ玉米蛋白的内质网滞留信号替
代Ｃ端ＫＤＥＬ序列，外源蛋白的积累水平提高了７倍［１５４］。通过将重组蛋白基因与油体中的油质蛋白基因融合
可以将外源蛋白定位于油体中，重组蛋白与油质蛋白形成融合蛋白后，稳定性显著增强，并且油脂蛋白的密度很
小，通过简单的浮选离心即可方便的纯化融合蛋白，再通过合适的酶切位点去除油质蛋白，就能获得所需药用蛋
白。将重组蛋白定位于液泡时应注意定位信号的选择，绿色组织中的液泡内含有大量的蛋白酶，无法积累蛋白，
只有种子中的存储型液泡才适合于蛋白的表达，如将溶菌酶定位于水稻种子中的存储型液泡中，溶菌酶积累浓度
明显提高［１１０］。而利用蛋白定位信号使重组蛋白直接分泌到胞外间隙或培养基中，可有效降低蛋白下游加工成
本。
２．６．２ 蛋白的纯化加工 目的蛋白的纯化加工主要包括以下几个步骤：植物组织的破碎，从复杂的植物组织成
分中提取目的蛋白，目的蛋白的纯化。植物组织破碎过程中，酚类物质、蛋白酶等其他污染成分同时释放出来，易
造成目的蛋白的污染甚至降解。而如果利用小立碗藓和衣藻２种水生植物表达系统可以将药用蛋白直接分泌到
液体培养基中［３０，１１２］，或者利用浮萍的根分泌系统将药用蛋白直接分泌至水相中［３３］，都可以避免这些问题。另一
种方法就是将重组蛋白定位于蛋白质体、油体等部位，通过差异浮选离心即可简便分离。蛋白的纯化则多采用亲
和层析的方法，常用的亲和标签有Ｎ端六聚组氨酸标签（Ｈｉｓ６）、ＳｔｒｅｐＩＩ标签及串联亲和标签（ＴＡＰ）。利用 Ｈｉｓ６
标签获得的目的蛋白纯度较低，ＳｔｒｅｐＩＩ标签获得目的蛋白的纯度和产量最高，而利用ＴＡＰ获得的目的蛋白的纯
度较为均一［１５５］。而弹性蛋白样多肽标签不仅可以用来纯化蛋白，研究表明它还可以提高目的蛋白的表达
量［１５６］。近年来人们还在不断地探索新的亲和标签，如色胺、苯胺［１５７］、蛋白自身内含肽［１５８］等等，相信在不久的将
来，更多方便、高效、安全的分离纯化方法将会应用到生产实践中来。
３ 免疫原性
植物源药用蛋白在动物实验过程中易出现免疫耐受、免疫原性较差等问题，限制了它的实际应用。当然提高
表达量是解决这一问题的最有效途径，但除此之外，还可以采用多种疫苗联用、添加免疫佐剂等方法加以解决。
Ｗｅｂｓｔｅｒ等［１５９］发现，在转基因烟草中表达的麻疹凝血素蛋白，小鼠试验仅能诱发低浓度的中和性抗体，但将
ＤＮＡ疫苗和转基因植物疫苗２种疫苗的联用时，能产生高浓度的抗体。使用粘膜免疫佐剂是提高植物源药用蛋
白免疫原性的重要方法。人用疫苗常用的免疫佐剂是铝盐，但其效率较低且机制复杂。新型免疫佐剂包括细菌
毒素（ＣＴＢ、ＬＴＢ）、病毒样颗粒、皂素衍生物、分子免疫佐剂、合成免疫佐剂等［１６０］。ＣＴＢ和ＬＴＢ是较强的粘膜免
疫佐剂，它们都能直接与小肠上皮 Ｍ 细胞上的ＧＭ１神经节苷脂受体结合，进而引起粘膜免疫与系统免疫。除
了使用合适的免疫佐剂，正确的给药方法也是十分重要的，可以采用口服给药、鼻腔给药、皮下注射给药等方法，
针对不同药用蛋白，可通过对比试验筛选出安全高效的给药途径。将上述方法联用，优化药用蛋白的生产、给药
配方及给药途径，一定可以有效提高植物源药用蛋白的免疫原性。
４ 讨论与展望
综上所述，利用转基因植物可以成功生产具有生物活性的抗体、抗原及其他多种药用蛋白，但实际推广应用
和实现商业化的还很少。笔者认为，建立高效完善的植物生产药用蛋白技术平台，要考虑４个方面的因素。首先
１９２第２２卷第４期 草业学报２０１３年
是目的基因筛选，获得能够自我组装并具有高度免疫活性的药用蛋白基因是利用植物生产药用蛋白的先决条件。
其次是受体植物的选择：受体植物本身要产量高，可溶性蛋白含量丰富；培养方法要简单；可进行精确的转化和遗
传；可以进行营养繁殖；生产畜禽类疫苗的植物受体最好本身为饲料牧草。植物受体的选择是提高药用蛋白产量
的基础，并最终决定了其利用方式。第三，构建含有多克隆位点的通用植物高效表达载体，实现不同药用蛋白基
因、不同病毒突变株抗原蛋白基因的快速替换。最后，安全遗传转化体系的建立，需选择生物安全和环境友好型
标记基因或者去除标记基因的植物表达体系，这是植物生产药用蛋白通过安全性评价的保障。
目前，全球人口总数已经超过６０亿，在人口密度高度集中的欠发达国家，医疗设施还很不完善，疾病———特
别是急性传染性疾病会带来灾难性的损失。在这些国家和地区推广种植可生产药用蛋白的转基因植物，可从根
本上解决医药缺口问题。许多传染性疾病随畜禽的迁徙而传遍全球，在迁徙地投放含药用蛋白的植物饲料，可以
切断疾病的传播途径。尽管利用转基因植物生产药用蛋白还存在着一些问题，但巨大的市场需求和发展前景将
推动其不断向前发展，相信通过广大科研工作者的共同努力，植物源药用蛋白的研究、生产和应用一定会为人类
的健康、经济的发展和社会的进步做出贡献。
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ａｎｄｃｈｏｌｅｒａｔｏｘｉｎＢｓｕｂｕｎｉｔｃｈｉｍｅｒａｉｎ犎犪狀狊犲狀狌犾犪狆狅犾狔犿狅狉狆犺犪［Ｊ］．ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，
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［１１９］ ＯｅｙＭ，ＬｏｈｓｅＭ，ＫｒｅｉｋｅｍｅｙｅｒＢ，犲狋犪犾．Ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｐｒｏｔｅｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓｃａｐａｃｉｔｙｂｙｍａｓｓｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ
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［１２０］ ＢｏｃｋＲ．Ｐｌａｓｔｉｄｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ｐｒｏｓｐｅｃｔｓｆｏｒｈｅｒｂｉｃｉｄｅａｎｄｉｎｓｅｃｔｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ｍｅｔａｂｏｌｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｆａｒｍｉｎｇ［Ｊ］．Ｃｕｒ
ｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，１８：１００１０６．
［１２１］ ＳｉｎｇｈＡＫ，ＶｅｒｍａＳＳ．Ｐｌａｓｔｉｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎｅｇｇｐｌａｎｔ（犛狅犾犪狀狌犿犿犲犾狅狀犵犲狀犪Ｌ．）［Ｊ］．ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＲｅｓｅａｒｃｈ，２０１０，１９：
１１３１１９．
［１２２］ ＢｒｅｙｅｒＤ，ＧｏｏｓｓｅｎｓＭ，ＨｅｒｍａｎＰ，犲狋犪犾．Ｂｉｏｓａｆｅｔｙｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｍｏｌｅｃｕｌａｒｆａｒｍｉｎｇｉｎｇｅｎｅｔｉｃａｌｙｍｏｄｉｆｉｅｄ
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［１２４］ ＷａｋａｓａＹ，ＯｚａｗａＫ，ＴａｋａｉｗａＦ．Ｈｉｇｈｅｒｌｅｖｅｌａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｆｏｒｅｉｇｎｇｅｎｅｐｒｏｄｕｃｔｓｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｒｉｃｅｓｅｅｄｓｂｙｔｈｅｃａｌｕｓ
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７９２第２２卷第４期 草业学报２０１３年
［１２５］ ＫｉｍＴＧ，ＢａｅｋＭＹ，ＬｅｅＥＫ，犲狋犪犾．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｇｒｏｗｔｈｈｏｒｍｏｎｅｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｒｉｃｅｃｅｌｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅ［Ｊ］．
ＰｌａｎｔＣｅｌＲｅｐｏｒｔｓ，２００８，２７：８８５８９１．
［１２６］ ＣｏｍａｉＬ，ＭｏｒａｎＰ，ＭａｓｌｙａｒＤ．ＮｏｖｅｌａｎｄｕｓｅｆｕｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆａｃｈｉｍｅｒｉｃｐｌａｎｔｐｒｏｍｏｔｅｒｃｏｍｂｉｎｉｎｇＣａＭＶ３５ＳａｎｄＭＡＳｅｌ
ｅｍｅｎｔｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，１９９０，１５：３７３３８１．
［１２７］ ＢａｒｏｎＵ，ＦｒｅｕｎｄｌｉｅｂＳ，ＧｏｓｓｅｎＭ，犲狋犪犾．Ｃｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｗｏｇｅｎｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｂｙｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｖｉａａｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｐｒｏｍｏｔｅｒ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅ
ｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９５，２３：３６０５３６０６．
［１２８］ ＳａｍｍａｒｃｏＭＣ，ＧｒａｂｃｚｙｋＥ．Ａｓｅｒｉｅｓｏｆｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｉｎｄｕｃｉｂｌｅｐｒｏｍｏｔｅｒｓｐｒｏｖｉｄｅｓｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓ
ｓｉｏｎ［Ｊ］．ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００５，３４６：２１０２１６．
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犘狉狅犵狉犲狊狊，犾犻犿犻狋犪狋犻狅狀犪狀犱狊狋狉犪狋犲犵犻犲狊犻狀狌狊犻狀犵狆犾犪狀狋狊狋狅狆狉狅犱狌犮犲犫犻狅狆犺犪狉犿犪犮犲狌狋犻犮犪犾狊
ＹＵＡＮＢｅｉ１，２，ＬＩＪｉｎｇｓｈｅｎｇ２，ＷＵＹａｎｍｉｎ１
（１．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００８１，Ｃｈｉｎａ；
２．ＳｈｅｎｚｈｅｎＮｏｎｇｋｅＧｒｏｕｐＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ５１８０４０，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｆａｒｍｉｎｇｉｎｐｌａｎｔｓｈａｓａｌｏｔｏｆａｄｖａｎｔａｇｅｓａｓｔｈｅｙａｒｅｉｎｅｘｐｅｎｓｉｖｅ，ｓａｆｅａｎｄｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ．Ｉｎ
ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ，ｓｅｖｅｒａｌｐｌａｎｔｄｅｒｉｖｅｄｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｓｕｃｈａｓａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖａｃｃｉｎｅａｎｔｉｇｅｎｓ，ａｎｄｃｙｔｏ
ｋｉｎｅｓｈａｖｅｂｅｅｎｆｏｕｎｄｔｏｉｎｄｕｃｅａｈｉｇｈｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｏｎｌｙａｆｅｗｓｍａｌｓｃａｌｅｐｒｏｄｕｃｔｓｈａｖｅｓｏｆａｒ
ｒｅａｃｈｅｄｔｏｔｈｅｍａｒｋｅｔ．Ｔｈｅｐｒｏｂｌｅｍｓｏｆｌｏｗｙｉｅｌｄａｎｄｐｏｏｒｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙａｒｅｔｈｅｔｗｏｍａｊｏｒｃｈａｌｅｎｇｅｓｔｈａｔ
ｍｉｌｉｔａｔｅａｇａｉｎｓｔｔｈｅｆｕｌｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎｏｆｐｌａｎｔ’ｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍ．Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｈａｖｅｂｅｅｎｄｅｖｅｌｏｐｅｄｔｏｂｒｅａｋ
ｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｓｅｂａｒｒｉｅｒｓｗｈｉｃｈｆｏｃｕｓｏｎｔｈｅｃｈｏｉｃｅｏｆｓｕｉｔａｂｌｅｈｏｓｔｐｌａｎｔ，ｖｅｃｔｏｒｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄｔｈｅｕｓｅｏｆｍｕ
ｃｏｓａｌａｄｊｕｖａｎｔｓ．Ｔｈｉｓａｒｔｉｃｌｅｒｅｖｉｅｗｓｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｎｏｖｅｌｐｌａｎｔｄｅｒｉｖｅｄｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｔｈｅｌｉｍｉｔｉｎｇｉｓ
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９９２第２２卷第４期 草业学报２０１３年