全 文 ：书犪犉犌犉植物表达载体构建及转化
紫花苜蓿的初步研究
蒋世翠１，王义１，孙春玉１，王艳芳１，２，李校１，２，张美萍１
（１．吉林农业大学生命科学学院，吉林 长春１３０１１８；２．国家教育部生物反应器工程中心，吉林 长春１３０１１８）
摘要：主要将犪犉犌犉基因按照植物偏爱的密码子进行基因优化，同时加上信号肽、６组氨酸标签及凝血酶切割因子，
合成全基因，再将基因插入到改造的ＴΩ４ＡＢ质粒中，将犪犉犌犉基因和质粒上的增强子、启动子、Ω序列及ｐｌｏｙＡ加
尾序列双酶切，命名为ＴΩ４ＡＢａＦ，将ＴΩ４ＡＢａＦ插入到ｐＢＩ１２１载体中命名为ｐＢＩ１２１ＴΩ４ＡＢａＦ。利用三亲融合
法将ｐＢＩ１２１ＴΩ４ＡＢａＦ转入到农杆菌菌株ＬＢＡ４４０４中，转化苜蓿。转基因苗用卡那霉素进行筛选；并对抗性苗进
行ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ检测。结果表明，ａＦＧＦ在苜蓿中得到表达。为苜蓿作为植物生物反应器奠定理
论基础。
关键词：ａＦＧＦ；植物生物反应器；紫花苜蓿
中图分类号：Ｓ５４１＋．１；Ｑ９４３　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１１）０４０１８００７
　 植物作为天然药物的来源已有很长的历史。随着现代分子生物学的发展，许多外源蛋白在植物中得到了表
达，这些外源蛋白包括血浆蛋白、酶、生长因子、疫苗和重组抗体等［１３］。用植物表达外源蛋白有许多优势，例如能
够正确进行折叠和翻译后的修饰，无动物细胞的病毒和病原菌对人造成伤害的危险等，并且操作简单，成本低廉，
易于大规模生产［４］。
紫花苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）是多年生豆科苜蓿属，草本植物，三出复叶，总状花序腋生，荚果［５］。是世界公
认的优良牧草，在世界各国都大面积种植。苜蓿的茎、叶中含有包括矿物营养素在内的５０多种营养物质及未知
生长因子，其营养成分比其他植物丰富许多，被称为万能植物。苜蓿的主要成分是叶蛋白，其在苜蓿种中的含量
比较大［６，７］。苜蓿是一种世界范围广泛种植的饲料作物［８］，在实验室中又是研究植物发育的模式植物。对其进行
遗传转化，不论在理论上还是在应用上均具价值。苜蓿作为植物生物反应器具有安全、价廉；多数可直接饲用和
食用；易于收集、纯化等优点［９］。ＤｕｓＳａｎｔｏｓ等［１０］将口蹄疫病毒（ＦＭＤＶ）的ＶＰｌ蛋白的编码基因整合到苜蓿基
因组中并使其在苜蓿体内表达，老鼠试验结果表明，其体内产生了保护性抗体，从而获得对口蹄疫的免疫能力，这
是用转基因牧草作为口服疫苗使动物产生系统免疫反应的首次报道。
ａＦＧＦ是人的酸性成纤维细胞生长因子由１５４个氨基酸残基组成，分子量为１６ｋＤ。研究表明，ａＦＧＦ有着
广泛的生物学活性，它能促进神经再生，对神经元具有营养支持作用，在中枢神经系统创伤修复中起重要作用，
在血管生成、组织创伤修复等方面亦具有重要的作用［１１，１２］。
利用植物生物反应器表达外源蛋白虽然已取得了一定的进展，但外源基因在植物中的表达水平很低［１３］。采
用以下几种方法对目的基因犪犉犌犉及植物表达载体进行改造，以期构建高效的犪犉犌犉植物表达载体。首先，采
用植物偏好的密码子重新合成全长的犪犉犌犉，对于翻译的顺利起始和进行具有极为重要的意义［１４］。同时，基因
中加入６组氨酸标签以及凝血酶切割因子，利于ａＦＧＦ的提取纯化。将目的基因插入到改造后的ＴΩＡＢ中，加
入促进作用的表达调控元件：Ｋｏｚａ序列，Ω增强子序列，ｐｌｏｙＡ加尾信号等［１４１６］，将目的基因克隆到植物表达载
体，再转到农杆菌ＬＢＡ４４０４中。最后转化紫花苜蓿，对转基因紫花苜蓿进行抗性筛选及检测，得到含有目的基因
１８０－１８６
２０１１年８月
　　　草　业　学　报　　　
　　　ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ　　　
第２０卷　第４期
Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．４
 收稿日期：２０１００５３０；改回日期：２０１００７０５
基金项目：十一五“８６３”计划生物反应器重大专项（Ｎｏ．２００７ＡＡ１００５０３），吉林省科技发展重点计划（Ｎｏ．２００７０９２２）和高等学校科技创新工程
重大项目培育资金（Ｎｏ．７０Ｓ０１８）资助。
作者简介：蒋世翠（１９８２），女，吉林汪清人，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｙｕｚｈｕ８４８１７４４＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。
的转基因紫花苜蓿。为进一步利用适当的植物作生物反应器表达ａＦＧＦ打下基础［１７］。
１　材料与方法
１．１　材料
犪犉犌犉基因由吉林农业大学李校研究员提供，基因克隆到载体ＰＧＥＭＴ上由生物反应器与药物开发教育
部工程中心完成。苜蓿为保定紫花苜蓿。质粒ＰＧＥＭＴｅａｓｙ，ＴΩＡＢ，ｐＢＩ１２１，ｐＲＫ２０１３及大肠杆菌（犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪
犮狅犾犻）菌种ＤＨ５α，农杆菌（犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊）ＬＢＡ４４０４。
引物１（ＳＡ）：５′ＧＴＣＴＴＴＣＣＣＡＴＴＣＴＡＣＧＣＴＴ３′；引物２（ＡＡ）：５′ＡＡＴＣＡＧＡＡＣＡＡＡＣＴＧＧＣＡＡＴ３′
（上海生物工程技术有限公司合成的引物）。
大肠杆菌及农杆菌培养基ＬＢ（ＬｕｒｉａＢｅｒｔａｎｉ细菌培养基，ＬｕｒｉａＢｅｒｔａｎｉｂａｃｔｅｒｉａｌｍｅｄｉｕｎ）液体培养基（１Ｌ）：
１０ｇ胰蛋白胨，５ｇ酵母提取物，１０ｇＮａＣｌ，ｐＨ 值为７．０，高压灭菌。ＬＢ固体培养基：ＬＢ液体培养基中加入
１．５％的琼脂粉，高压灭菌。
侵染培养基：ＴＭ１液体培养基；共培养培养基：ＴＭ１＋２，４Ｄ（２，４二氯苯氧乙酸钠，２，４ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙ
ａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）＋６ＢＡ（６苄基嘌呤，６ｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｏｐｕｒｉｎｅ）＋ＮＡＡ（萘乙酸，αｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）；恢复培养：
ＴＭ１＋２，４Ｄ＋６ＢＡ＋ＮＡＡ培养基＋Ｔｉｍ（特美汀，ｔｉｍｅｎｔｉｎ）；筛选培养基：ＴＭ１＋２，４Ｄ＋６ＢＡ＋ＮＡＡ培养
基＋Ｔｉｍ＋Ｋａｎ（卡那霉素，ｋａｎａｍｙｃｉｎ）；分化培养基：ＭＳ（ＭｕｒａｓｈｉｇｅＳｋｏｏｇ培养基，ＭｕｒａｓｈｉｇｅＳｋｏｏｇｍｅｄｉｕｎ）培
养基＋Ｔｉｍ＋Ｋａｎ；生根培养基：Ｚ１２培养基＋Ｔｉｍ＋Ｋａｎ。
１．２　方法
１．２．１　ａＦＧＦ植物表达载体的构建　首先将ａＦＧＦ基因改造成植物偏好性密码子并加上６组氨酸标签及凝血
酶切割因子。合成基因并连接到ＰＧＥＭＴ质粒，载体构建如图１。
１．２．２　植物表达载体导入农杆菌　在协助质粒ｐＲＫ２０１３的大肠杆菌协助下将具有Ｋａｎ抗性的含有目的基因
犪犉犌犉的重组质粒ｐＢＩ１２１ＴΩ４ＡＢａＦ导入到具有Ｓｔｒ（链霉素Ｓｔｒｐｅｔｏｃｉｎ）抗性的农杆菌ＬＢＡ４４０４，使其融合体
在含有抗生素Ｓｔｒ５０μｇ／ｍＬ和Ｋａｎ５０μｇ／ｍＬ的ＬＢ固体培养基中生长。挑取单菌落进行ＰＣＲ检测，确定所得
到的菌落为含目的质粒的转化株。将检测结果正确的单菌落重新划板备用。
图１　植物表达载体狆犅犐１２１犜Ω４犃犅犪犉构建示意图
犉犻犵．１　犆狅狀狊狋狉狌犮狋犻狅狀犱犻犪犵狉犪犿狅犳狆犾犪狀狋犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狏犲犮狋狅狉狆犅犐１２１犜Ω４犃犅犪犉
　ａＦＧＦ：酸性成纤维细胞生长因子 Ａｃｉｄｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ；启动子Ｐｒｏｍｏｔｅｒ；信号肽Ｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ；６ＨｉｓＳｉｘｈｉｓｔｉｄｉｎｅｓｌａｂｅｌｓ；凝血酶切割
因子 Ｔｈｅｚｙｍｏｐｌａｓｍｃｕｔｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ；终止子Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ；植物密码子优化的ａＦＧＦＰｌａｎｔａｎｔｉｃｏｄｏｎｏｐｔｉｍｉｚｅｄａＦＧＦ；３５ｓ：３５ｓ启动子３５ｓｐｒｏｍｏｔｅｒ；Ｅ：
增强子Ｅｎｈａｎｃｅｒ；ＧＵＳ：βＤ葡糖醛酸酶 Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ
１８１第２０卷第４期 草业学报２０１１年
１．２．３　农杆菌介导法转化苜蓿　农杆菌培养：在含相应抗生素的ＬＢ平板上划线培养含有质粒ｐＢＩ１２１的农杆
菌，２８℃培养２～３ｄ，将处于对数生长期的菌体刮入离心管中，用 ＭＳ液体培养基洗涤，１００００ｒ／ｍｉｎ离心２ｍｉｎ，
再用 ＭＳ液体培养基将菌体重悬。
农杆菌侵染及共培养：吸取０．８～１．０ｍＬ菌液加入到２０ｍＬＭＳ液体培养基中混匀其溶液ＯＤ６００值为１．０
左右。用剪刀剪取无菌苗的叶子作为外植体，将每一片叶子剪成０．５ｃｍ２，侵染１０ｍｉｎ后，吸去菌液。２５℃黑暗
共培养３ｄ后；苜蓿转移至恢复培养基中再培养３ｄ后转移至筛选培养基中培养。
选择和再生培养：苜蓿在筛选培养基上每２周继代１次，到形成胚性愈伤直至出现体胚，将体胚转移至生根
培养基中，２～３周后长出根系。再转移至带有筛选压的 ＭＳ培养基中培养。
１．２．４　再生植株的检测　再生植株的ＰＣＲ（聚合酶链式反应，ｐｏｌｙｍｅｒａｃｓｅｃｈｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）检测：以苜蓿总ＤＮＡ
为模板，扩增犪犉犌犉基因。ＰＣＲ反应体系（５０μＬ）：Ｂｕｆｆｅｒ（１０×）５μＬ，ｄＮＴＰ４μＬ，引物１（ＳＡ）和引物２（ＡＡ）
各２μＬ，模板０．５μＬ，酶１μＬ，ｄｄＨ２Ｏ３４．５μＬ；９４℃预变性２ｍｉｎ，９４℃变性５０ｓ，５５℃退火５０ｓ，７２℃延伸５０
ｓ，３０个循环后７２℃延伸５ｍｉｎ，进行琼脂糖凝胶电泳分析。
转基因植物的ＲＴ－ＰＣＲ（逆转录聚合酶链式反应，ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）检测：按
照ＲＮＡ提取试剂盒提供的操作手册进行转基因植株总 ＲＮＡ的提取。根据 ＲＴ－ＰＣＲ试剂盒所提供的操作手
册进行反转录及ＰＣＲ反应。
转基因植物的 ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ检测：用ＰＢＳ缓冲液提取转基因苜蓿中的蛋白，进行６％的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＳＤＳ
－聚丙烯酰胺凝胶电泳，ＳＤＳ－ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｏｅｌｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）电泳，用转印仪将蛋白转移到ＰＶＤＦ（聚偏二氟
乙烯，ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅｆｌｕｏｒｉｄｅ）膜上（８０Ｖ，２．５ｈ）用封闭液４℃封闭过夜，漂洗后加入兔抗人酸性成纤维细胞生长
因子的多克隆抗体于３７℃温浴２ｈ。用ＴＢＳＴ（ＴｒｉｓＨＣｌ缓冲盐溶液＋Ｔｗｅｅｎ）漂洗后，加入羊抗兔二抗继续
３７℃温浴２ｈ。最后，用ＴＢＳＴ漂洗并加入显色液，直至条带出现。
转基因植株再生Ｋａｎ抗性的检测：切取具有Ｋａｎ抗性转基因苜蓿植株叶片，置于２０μｇ／ｍＬ的Ｋａｎ的ＴＭ１
培养基上培养，看是否有愈伤形成。若形成愈伤再转移至含有２０μｇ／ｍＬ的Ｋａｎ分化培养基中培养。
２　结果与分析
图２　植物表达载体狆犅犐１２１犜Ω４犃犅犪犉的酶切鉴定
犉犻犵．２　犚犲狊狋狉犻犮狋犻狅狀犲狀犱犱狅狀狌犮犮犾犲犪狊犲犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狆犾犪狀狋
犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狏犲犮狋狅狉狆犅犐１２１犜Ω４犃犅犪犉
Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ；１：酶切产物Ｅｎｄｄｏｎｕｃｃｌｅａｓｅ；２：质粒Ｐｌａｓｍｉｄ
２．１　植物表达载体的构建
分别用犓狆狀１和犡犫犪１进行双酶切，回收ＤＮＡ片
段，通过 Ｔ４ ＤＮＡ 连接酶将基因连接到改造质粒
ＴΩＡＢ中，再用犡犫犪１和犈犮狅狉１双酶切ＴΩＡＢａＦ回收
目的片段，在连接到ｐＢＩ１２１中，酶切鉴定ｐＢＩ１２１中是
否获得了含有目的基因的ａＦＧＦ的重组质粒。利用
犡犫犪１和犈犮狅狉１双酶切鉴定载体ｐＢＩ１２１ＴΩ４ＡＢａＦ正
确（图２）。
２．２　三亲融合法将ｐＢＩ１２１质粒导入农杆菌
利用三亲融合法将植物表达载体ＰＢＩ１２１导入农
杆菌ＬＢＡ４４０４中，转化子在含有２种抗生素（卡那霉
素５０ｍｇ／Ｌ，链霉素５０ｍｇ／Ｌ）的ＬＢ培养基上生长。
挑取三亲融合单克隆进行菌落ＰＣＲ扩增犪犉犌犉基因
（图３）。将阳性克隆保存，作为转化苜蓿的菌种。提
取质粒酶切鉴定，通过ＰＣＲ检测，证明ｐＢＩ１２１质粒转移至农杆菌中。再通过双酶切检测（图４），证明转化成功。
２．３　转基因苜蓿的组织培养
苜蓿对Ｋａｎ比较敏感，即使在很低的浓度下，它的生长过程延迟，抗性愈伤生长也很缓慢（图５）。多数外植
体最终都只产生少量的黄褐色愈伤，一些状态不好的外植体不能产生抗性愈伤，并逐渐白化死去。只有一部分黄
褐色抗性愈伤能产生绿色体胚。绿色体胚的发生至少需要６～８周的时间。
２８１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．４
图３　犘犆犚扩增结果　　　　　
犉犻犵．３　犜犺犲狉犲狊狌犾狋狅犳犘犆犚犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀　　　　　
Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ；１：ＰＣＲ扩增ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　　　　　
图４　植物表达载体的酶切鉴定
犉犻犵．４　犚犲狊狋狉犻犮狋犻狅狀犲狀犱犱狅狀狌犮犮犾犲犪狊犲犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狆犾犪狀狋犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狏犲犮狋狅狉
Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ；１：农杆菌质粒Ｐｌａｓｍｉｄｏｆ犃．狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊
图５　农杆菌介导法转化的苜蓿生长情况
犉犻犵．５　犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿犿犲犱犻犪狋犲犱狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狋犻狅狀狅犳狋犺犲犵狉狅狑狋犺狅犳犕．狊犪狋犻狏犪
　ａ：农杆菌侵染后在未加抗生素培养基中共培养 Ａｌｔｏｇｅｔｈｅｒｒａｉｓｅｓｉｎｍｅｄｉｕｍｗｉｔｈｏｕｔａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓａｆｔｅｒ犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿ｍｅｄｉａｔｅｄ；ｂ：在含有抗生素
（Ｔｉｍ）培养基中恢复培养Ｒｅｓｕｍｅｒｒａｉｓｅｓｉｎｍｅｄｉｕｍｏｆａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ（Ｔｉｍ）；ｃ：在含有抗生素（Ｋａｎ和Ｔｉｍ）培养基中筛选培养Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｒａｉｓｅｓｉｎｍｅｄｉｕｍ
ｏｆａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ（ＫａｎａｎｄＴｉｍ）；ｄ：在含有抗生素（Ｋａｎ和Ｔｉｍ）培养基中形成愈伤Ｆｏｒｍｉｎｇｃａｌｕｓｉｎｍｅｄｉｕｍｏｆａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ（ＫａｎａｎｄＴｉｍ）；ｅ：抗性苜蓿胚
性愈伤 Ｔｈｅｅｍｂｒｙｏｃａｌｕｓｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｅ犕．狊犪狋犻狏犪；ｆ：抗性体胚成苗Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ犕．狊犪狋犻狏犪ｂｏｄｙｅｍｂｒｙｏ；ｇ：抗性苜蓿苗Ｔｈｅｓｅｅｄｌｉｎｇｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｅ犕．
狊犪狋犻狏犪；ｈ：抗性苜蓿苗 Ｔｈｅｓｅｅｄｌｉｎｇｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｅ犕．狊犪狋犻狏犪；ｉ：抗性苜蓿根Ｔｈｅｒｏｏｔｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｅ犕．狊犪狋犻狏犪
３８１第２０卷第４期 草业学报２０１１年
不同转化批次，结果也不尽相同，有的转化率达到４％，而有的批次转化率可达到２５％。分析发现，转化率的
高低与外植体的状态，农杆菌的活力，共培养的时间等因素有关系。考虑各种因素后，转化率也趋于稳定。统计
发现利用农杆菌ＬＢＡ４４０４侵染转化得到的抗性体胚的效率平均为１１％。
将体胚转移至无生长素的Ｚ１２生根培养基中。待体胚进一步生长，团性体胚逐渐分开，及时分离各个独立
的体胚，否则长成的小苗易玻璃化，而且再分离时易造成幼苗的损伤。从体胚发育成小苗约需要１～２个月，待长
出根系后，再转移至带有Ｋａｎ筛选压的 ＭＳ培养基中继续培养。
２．４　抗性再生植株的ＰＣＲ检测
利用ＣＴＡＢ法提取转基因苜蓿ＤＮＡ，以ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增检测再生苗是否为转化植株。经检测，
筛选培养后获得的再生苗中一部分为转基因植株。以ＳＡ和ＡＡ为引物检测转基因苜蓿中的ＤＮＡ时，形成少量
的引物二聚体（图６）。
图６　转基因苜蓿犇犖犃的犘犆犚检测电泳图
犉犻犵．６　犜狉犪狀狊犵犲狀犲犕．狊犪狋犻狏犪犇犖犃犘犆犚犲狓犪犿犻狀犪狋犻狅狀犲犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狋狅犵狉犪犿狊
Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ；１：阳性对照Ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；２～１３：转基因苜蓿ＤＮＡＴｒａｎｓｇｅｎｅ犕．狊犪狋犻狏犪ＤＮＡ
２．５　ａＦＧＦ在转基因植物中表达的 ＲＴ－ＰＣＲ检测
图７　转基因犪犉犌犉表达的 犚犜－犘犆犚检测
犉犻犵．７　犜犺犲狋犲狊狋狉犲狊狌犾狋狅犳狋狉犪狀狊犵犲狀犲犪犉犌犉犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀犚犜－犘犆犚
Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ；１～４：转基因植物Ｔｒａｎｓｇｅｎｅｐｌａｎｔ；
５：阳性对照Ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ
为了检测ａＦＧＦ在转基因植物中ｍＲＮＡ水平上
的表达情况，进行了ＲＴ－ＰＣＲ。利用ＴＲｉｏｚｌ试剂提
取在ＤＮＡ 水平上检测呈阳性的转基因植物的总
ＲＮＡ，结果显示，在所检测ＤＮＡ的ＰＣＲ结果呈阳性
的转基因植株中，ＲＴ－ＰＣＲ一部分呈阳性，也有部分
呈阴性，说明转基因ａＦＧＦ在这些植株中成功转录，但
是有假阳性的存在。转基因ａＦＧＦ表达的ＲＴ－ＰＣＲ
检测结果见图７。
２．６　转基因ａＦＧＦ在植物中表达的 ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ检测
利用ＰＢＳ提取ＲＴ－ＰＣＲ检测呈阳性的转基因苜蓿的蛋白，将转基因苜蓿的蛋白进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳，
通过６０Ｖ电压，将分离后的蛋白条带转移至ＰＶＤＦ膜上，用兔抗血清以１∶２００稀释，采用 ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ检测基
因犪犉犌犉在转基因苜蓿中蛋白质水平上的表达情况。结果表明，在ＲＴ－ＰＣＲ检测呈阳性的植株 ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ
检测也呈阳性；在ＲＴ－ＰＣＲ检测呈阴性的植株 ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ检测也呈阴性。说明ａＦＧＦ已经在转基因苜蓿中
表达（图８）。
２．７　转基因植株再生Ｋａｎ抗性的检测
切取苜蓿具有Ｋａｎ抗性的植株叶片，置于２０μｇ／ｍＬ的Ｋａｎ的ＴＭ１培养基上生长，培养２０～２５ｄ发现，转
基因苜蓿的叶片在含有２０μｇ／ｍＬ的Ｋａｎ的ＴＭ１培养基上生长状态良好，能长出正常的黄绿色愈伤，而非转基
因的苜蓿叶片几乎无愈伤发生，叶片虽稍微膨大，但是后来逐渐发黄，再变白死亡。转基因植株愈伤再生的抗性
试验结果表明犪犉犌犉基因在苜蓿中得到了表达，使转基因植株获得了Ｋａｎ抗性，能在含有Ｋａｎ的培养基中正常
生长（图９）。
４８１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．４
图８　转基因苜蓿 犠犲狊狋犲狉狀犅犾狅狋结果
犉犻犵．８　犜犺犲狉犲狊狌犾狋狅犳狋狉犪狀狊犵犲狀犲犕．狊犪狋犻狏犪犠犲狊狋犲狉狀犅犾狅狋
Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ；１～６：转基因苜蓿 Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ犕．狊犪狋犻狏犪；７：阳性对照Ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ
图９　转基因苜蓿犓犪狀抗性检测
犉犻犵．９　犜狉犪狀狊犵犲狀犲犕．狊犪狋犻狏犪犓犪狀狉犲狊犻狊狋犪狀犮犲犲狓犪犿犻狀犪狋犻狅狀
　ａ：在含有抗生素（Ｋａｎ）的培养基上诱导体胚Ｉｎｍｅｄｉｕｍｃｏｎｔａｉｎｉｎｇａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ（Ｋａｎ）ｉｎｄｕｃｅｓｔｈｅｂｏｄｙ；ｂ：在含有抗生素（Ｋａｎ）的培养基上形成成熟
胚Ｉｎｍｅｄｉｕｍｃｏｎｔａｉｎｉｎｇａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ（Ｋａｎ）ｆｏｒｍｅｄｍａｔｕｒｅｅｍｂｒｙｏｓ；ｃ：在含有抗生素（Ｋａｎ）的培养基上形成子叶型胚Ｉｎｍｅｄｉｕｍｃｏｎｔａｉｎｉｎｇａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ
（Ｋａｎ）ｆｏｒｍｅｄｃｏｔｙｌｅｄｏｍｓｔｙｐｅｅｍｂｒｙｏｓ；ｄ：分离子叶型胚Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇｃｏｔｙｌｅｄｏｍｓｔｙｐｅｅｍｂｒｙｏｓ
３　讨论
ＡＦＧＦ的活性及药理作用较为广泛，应用价值大，但是生产却受到一定限制。结合植物生物反应器的优点，
学者们一直在探讨利用植物生物反应器生产ａＦＧＦ。目前已有报道在烟草（犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪犮狌犿）［１７］、番茄（犛狅犾犪
狀狌犿犾狔犮狅狆犲狉狊犻犮狌犿）［１８］、黄瓜（犆狌犮狌犿犻狊狊犪狋犻狏狌狊）［１９］中表达ａＦＧＦ，烟草的缺点是含有生物碱等有害物质；转基因番
茄及黄瓜表达的ａＦＧＦ不易提取，食用蛋白易降解。利用转基因苜蓿生产ａＦＧＦ的突出优点是，苜蓿蛋白含量比
较高，种植广泛，可以高效表达蛋白，苜蓿没有毒性物质，不需进一步加工可直接用于外敷，这就避免加工过程对
ａＦＧＦ活性的影响。并且已经在苜蓿中成功表达了碱性成纤维细胞生长因子［２０］。
本试验以苜蓿作为植物生物反应器，根据植物偏爱密码子改造犪犉犌犉基因，在连接到改造后的ＴΩＡＢ中，加
入促进作用的表达调控元件：Ｋｏｚａ序列，Ω增强子序列，ｐｌｏｙＡ加尾信号，利用农杆菌ＬＢＡ４４０４介导方法将目的
基因导入到受体植物苜蓿中。经分子生物学鉴定（ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＷｅｒｓｔｅｒｎＢｌｏｔ），已经获得了带有人类酸性
成纤维细胞生长因子（ａＦＧＦ）的转基因苜蓿植株。本试验为建立以苜蓿为生物反应器生产药用蛋白奠定了基础。
与直接从动物组织中提取或利用微生物发酵法生产ａＦＧＦ相比，利用转基因苜蓿植物生产ａＦＧＦ既安全又将大
大降低生产成本，提高生产能力，这将有助于大规模生产ａＦＧＦ，降低其市场价格，满足科研及医疗对ａＦＧＦ的大
量需求。并且ａＦＧＦ转基因植物的种植为“分子农业”的发展提供了理论基础和实践经验。外源蛋白表达量低普
遍存在于转基因植物的研究中。虽然外源蛋白质在植物中的表达水平现在还比较低，但是随着生物技术的发展
和相关学科及技术的发展使其存在可以改进的可能性［２１］。苜蓿这种传统牧草，在生物技术的新时代作为植物生
物反应器将具有广阔的应用前景。
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犃狉狌犱犻犿犲狀狋犪狉狔狊狋狌犱狔狅犳狋犺犲犪犮犻犱犳犻犫狉狅犫犾犪狊狋犵狉狅狑狋犺犳犪犮狋狅狉’狊狆犾犪狀狋犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀
狏犲犮狋狅狉犮狅狀狊狋狉狌犮狋犻狅狀犪狀犱狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狋犻狅狀犻狀狋狅犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪
ＪＩＡＮＧＳｈｉｃｕｉ１，ＷＡＮＧＹｉ１，ＳＵＮＣｈｕｎｙｕ１，ＷＡＮＧＹａｎｆａｎｇ１，２，
ＬＩＸｉａｏｋｕｎ１，２，ＺＨＡＮＧＭｅｉｐｉｎｇ１
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犃犫狊狋狉犪犮狋：Ａｆｔｅｒｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅ犪犉犌犉ｇｅｎｅｆｏｒｔｈｅｃｈｏｓｅｎｐｌａｎｔ，ｔｈｅｃｏｄｏｎ，ｔｈｅｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ，ｓｉｘｈｉｓｔｏｎｅ
ｔａｇａｎｄｚｙｍｏｐｌａｓｍｃｕｔｔｉｎｇｆａｃｔｏｒｗｅｒｅａｄｄｅｄｔｏｔｈｅｍｏｄｉｆｉｅｄＴΩＡＢｐｌａｓｍｉｄ，ｗｈｉｃｈｗａｓｎａｍｅｄＴΩＡＢａＦａｆｔｅｒ
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ｄｏｕｂｌｅｄｉｇｅｓｔｓ．ＴｈｅｂｉｎａｒｙｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＢＩ１２１ＴΩＡＢａＦｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｕｓｉｎｇＴΩＡＢａＦａｎｄｐＢＩ１２１．
ＢｙｔｒｉｐａｒｅｎｔａｌｍａｔｉｎｇｔｈｅｖｅｃｔｏｒｐＢＩ１２１ＴΩＡＢａＦｗａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＬＢＡ４４０４．犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪ｗａｓｔｒａｎｓ
ｆｏｒｍｅｄｕｓｉｎｇ犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊，ｆｏｌｏｗｅｄｂｙｓｅｌｅｃｔｉｖｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇａｎｄＰＣＲ，ＲＴ－ＰＣＲａｎｄＷｅｓｔｅｒｎ
Ｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓ．ＴｈｅａＦＧＦｗａｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎ犕．狊犪狋犻狏犪．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ａｃｉｄｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ（犪犉犌犉）；ｐｌａｎｔｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ；犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪
６８１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．４