全 文 ：书旗草内生真菌与旗草抗病性研究
黄东益１，黄小龙１，ＳＥＧＥＮＥＴＫｅｌｅｍｕ２
（１．海南大学农学院，海南 儋州５７１７３７；２．肯尼亚国际畜牧研究所，内罗毕００１００）
摘要：旗草内生真菌交织顶孢霉的７个不同分离物对旗草主要病源真菌德氏霉和立枯丝核菌在ＰＤＡ培养基上的
体外对峙试验表明，大多数内生真菌分离物对这２个病原菌都有不同程度的抑制作用，不同分离物对同一病原菌
的抑制作用不同，同一分离物对不同病原菌的抑制作用也不同，ＥＢ６７８０．５０１和ＥＨ３２ａ对德氏霉和立枯丝核菌的
抑制作用最强。旗草植株抗病试验表明，内生真菌感染的植株对叶枯病具有明显的抗性，但这种抗性随着病原菌
立枯丝核菌入侵时间的延长而减弱。在体外抑菌试验中，对病原菌生长抑制能力强的内生真菌分离物，在旗草体
内也表现出较强的抗病性，说明抗病内生真菌的体外抑菌筛选是有效的。
关键词：旗草；内生真菌；抗病性
中图分类号：Ｓ４３２．４＋４；Ｓ５４０．３４　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２００９）０２００３９０７
　 旗草（犅狉犪犮犺犻犪狉犻犪犫狉犻狕犪狀狋犺犪），又称臂形草，约有１００个种，我国产６个种，其中海南产２个种［１］。我国曾从斯
里兰卡、哥伦比亚、澳大利亚引进栽培［２，３］。在引进的基础上，已选育出了适宜我国热带、亚热带地区种植的“热
研”系列臂形草，譬如热研６号珊状臂形草、热研１５号刚果臂形草等［４，５］。随着旗草种植面积的不断扩大，叶斑病
（德氏霉犇狉犲犮犺狊犾犲狉犪ｓｐ．引起）和叶枯病（立枯丝核菌犚犺犻狕狅犮狋狅狀犻犪狊狅犾犪狀犻引起）的危害逐渐加重。为实现畜牧业的
可持续发展，必须加强旗草的抗性育种和病虫害的生物防治研究。
植物内生菌是指以寄生或非寄生的方式生长于植物体内的或植物体内所含有的生物体［６］。内生真菌通常与
寄主植物形成互利共生的关系，它们从寄主植物体内获得空间和养分，同时，它们能增强寄主植物的抗虫性、抗病
性、抗旱性以及生长竞争能力。因此，自２０世纪８０年代以来，内生真菌的研究和利用引起了广泛的重视［７～１２］。
许多体外试验表明，内生真菌枝顶孢（犃犮狉犲犿狅狀犻狌犿）、香柱菌（无性型ｎｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ，有性型ｅｐｉｃｈｌｏｅｔｙｐｈｉ
ｎａ）的培养物具有抑制真菌的活性［１３～１７］。但是有关内生真菌感染的植株抗病的报道却不多［１８，１９］。旗草植株能被
内生真菌交织顶孢霉（犃犮狉犲犿狅狀犻狌犿犻犿狆犾犻犮犪狋狌犿）感染，内生真菌感染的植株与无内生真菌的植株相比，叶斑病病
斑小而少，产生的孢子数少［２０］。但是，内生真菌对叶枯病是否也具有植保作用，以及不同内生真菌分离物与病原
菌德氏霉和立枯丝核菌在植株体内和体外的生长抑制关系是否一致等问题的进一步研究是能否利用这类内生真
菌防治病害的基础。
１　材料与方法
１．１　内生真菌对旗草病原真菌的体外抑制试验
所采用的内生真菌交织顶孢霉ＥＢ６７８０．５０１、ＥＨ３２ａ、Ｅｐｉｎｅｄｏ、ＥＢ６０６、ＥＢ６７８０．２０１、ＥＨ１９和ＥＢ１６８４５．９０９
（来源于哥伦比亚国际热带农业中心，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｃｅｎｔｅｒｆｏｒｔｒｏｐｉｃａｌａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｃｏｌｏｍｂｉａ，ＣＩＡＴ）７个不同的
分离物［２０］见表１。首先，将每个内生真菌分离物、病原菌德氏霉和立枯丝核菌分别接种在ＰＤＡ（ｐｏｔａｔｏｄｅｘｔｒｏｓｅ
ａｇａｒ，Ｄｉｆｃｏ）培养基上（１００ｍｍ×１５ｍｍ培养皿），２８℃，黑暗条件下预培养１周。用记号笔在１００ｍｍ×１５ｍｍ
培养皿背面的中心点处涂上１个黑点，以中心点为原点划２条垂直线，并在各条直线上距离中心点４０ｍｍ的位
置涂上１个黑点。然后在培养皿内倒入ＰＤＡ培养基４０ｍＬ，培养基固化后，将预培养的内生真菌菌丝块（１～３
块，每块４ｍｍ大小）接种于黑点（中心点除外）正上方的培养基上，２８℃，黑暗条件下培养，待到内生真菌菌落直
径长到约２０ｍｍ（需１～２周）时，将预培养的病原菌菌丝块（４ｍｍ大小）接种于中心黑点正上方的培养基上，同
第１８卷　第２期
Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．２
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ 　　
３９－４５
２００９年４月
 收稿日期：２００８０８０５；改回日期：２００８１１２６
基金项目：人事部留学回国人员科技活动择优资助项目（２００６１６４）资助。
作者简介：黄东益（１９６９），男，云南宣威人，教授，博士。Ｅｍａｉｌ：ｈｄｏｎｇｙｉ１２３＠ｔｏｍ．ｃｏｍ
时设置只接种病原菌菌丝块而无内生真菌菌丝块的培养皿作对照，然后在上述培养条件下培养。当对照中病原
菌菌落大小长到约培养皿面积的６０％时（对德氏霉，需７ｄ；对立枯丝核菌，需３ｄ），测量内生真菌菌落与病原菌
菌落间的最短距离，病原菌菌落的半径（沿内生真菌菌落方向）和对照中病原菌菌落的半径（图１和２）。基于这
些测量结果来评价不同内生真菌分离物对病原真菌的抑制效果，每个处理重复３次。试验数据采用Ｅｘｃｅｌ和
ＳＡＳ９．０统计分析软件进行处理及方差分析，新复极差测验法比较各处理间的显著性。
１．２　感染内生真菌的旗草植株对病原真菌的拮抗试验
将来自同一母株上的、生育期相似的、被内生真菌感染的（人工接种获得，用Ｅ＋表示）和无内生真菌的（用Ｅ
－表示）旗草ＣＩＡＴ６７８０和ＣＩＡＴ１６３２０小植株按单株分别移栽于５０ｍｍ×６０ｍｍ的培养杯中，成活后，选择分
别来自有内生真菌感染的旗草Ｅ＋Ｈ３２、Ｅ＋Ｐ６３、Ｅ＋Ｐ１１１和无内生真菌的旗草Ｅ－Ｈ３２、Ｅ－Ｐ６３、Ｅ－Ｐ１１１共６
组中的小植株各１５株，在每株的茎基部接种１块预培养的新鲜的立枯丝核菌ＣＩＡＴ６７８０菌丝块（４ｍｍ大小），
采用随机区组设计排列，将小植株放置在发病室中培养，于接种后７，１４和２１ｄ时分别测量叶枯病斑在植株上从
立枯丝核菌接种之处垂直向上扩展的距离，通过比较在内生真菌感染的植株上和无内生真菌感染的植株上的叶
枯病斑的扩展距离来评价内生真菌抗病性的强弱，若前者的扩展距离小于后者，则内生真菌感染的植株对该病原
菌引起的病害有抗性作用，差值愈大，抗性愈强，反之，则无抗性作用。
１．３　内生真菌原初提取物的制备与抗病原真菌活性的初步测试
取ＰＤＡ培养基上培养的内生菌分离物ＥＨ３２ａ的菌落（菌落直径约２０ｍｍ）２７个（连同培养基）在５０ｍＬ无
菌蒸馏水中匀浆，然后在１２０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｍｉｎ，取上清液冰冻干燥得原初提取物，在干燥后的原初提取物中
加入９ｍＬ无菌蒸馏水溶解，溶解液经无菌滤膜（０．２μｍ，ｆｉｓｈｂｒａｎｄ）过滤，滤液均分为３份（３ｍＬ／份），分别作３
种处理（图４），１）不做任何处理（作阳性对照）；２）在１２０℃高压灭菌２０ｍｉｎ；３）加入０．７５ｍＬ链霉蛋白酶（酶的终
浓度为２ｍｇ／ｍＬ），在３７℃温育４ｈ。然后，用记号笔在１００ｍｍ×１５ｍｍ培养皿背面的中心点处涂上一个黑点，
以中心点为原点划２条垂直线，在各条直线上距离中心点４０ｍｍ的位置涂上一个黑点，接着在培养皿内倒入
ＰＤＡ培养基４０ｍＬ，待培养基固化后，在每个黑点（中心点除外）正上方的培养基上放上一个圆形的无菌纸片，将
上述各种处理的内生菌原初提取物及无菌水各取４００μＬ分别滴加在无菌纸片上（第３种处理取５００μＬ，其原初
提取物总含量相当于未处理的原液４００μＬ），在中心黑点正上方的培养基上接种１块预培养的病原菌（德氏霉或
立枯丝核菌）菌丝块（４ｍｍ大小），然后在２８℃，黑暗条件下培养，３ｄ后观测各种处理对病原菌菌丝的生长抑制
反应。
２　结果与分析
２．１　内生真菌对旗草病原真菌的体外抑制作用
体外抑菌试验表明，大多数内生真菌分离物对病原菌德氏霉或立枯丝核菌都有不同程度的生长抑制作用，而
且多数内生真菌分离物的抑制作用都较弱，抑制距离为０～１３ｍｍ（表１，２，图１，２）。不同内生真菌分离物对同一
病原菌的抑制作用不同，同一内生真菌分离物对不同病原菌的抑制作用也不同，ＥＢ６７８０．５０１和ＥＨ３２ａ对德氏霉
或立枯丝核菌的抑制作用都最强；Ｅｐｉｎｅｄｏ对德氏霉具有中等抑制作用，而对立枯丝核菌的抑制作用较弱；ＥＢ６０６
对德氏霉的抑制作用较弱，而对立枯丝核菌却具有中等抑制作用；ＥＢ６７８０．２０１、ＥＨ１９和ＥＢ１６８４５．９０９对２种病
原菌的抑制作用都很弱，甚至观测不到抑制作用。随着培养时间的延长，大多数内生真菌分离物对病原菌的抑制
作用越来越不明显。立枯丝核菌接种培养７ｄ后，只有ＥＢ６７８０．５０１和ＥＨ３２ａ仍然可观测到明显的抑制作用（图
２）；接种培养１５ｄ后，所有内生真菌分离物的抑制作用都几乎观测不出。对于德氏霉，结果却又不同，接种培养
１５ｄ后，仍有３个分离物（ＥＢ６７８０．５０１、ＥＨ３２ａ和Ｅｐｉｎｅｄｏ）具有明显的抑制作用；甚至接种３０ｄ后，ＥＢ６７８０．５０１
和ＥＨ３２ａ与德氏霉的菌落间仍有明显的抑制距离（图１）。
２．２　感染内生真菌的旗草植株的抗病性分析
与无内生真菌感染的植株相比，在立枯丝核菌接种后的早期（７～１０ｄ），感染内生真菌的植株（无论旗草
ＣＩＡＴ６７８０还是ＣＩＡＴ１６３２０）上的叶枯病斑的扩展距离相对较短；但是，随着时间的延长，叶枯病斑的扩展距离
在内生真菌感染的植株上与无内生真菌感染的植株上无明显差异（１４ｄ以后）（图３）。这说明，在本试验条件下，
０４ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．２
图１　不同内生真菌交织顶孢霉分离物对病原菌德氏霉在犘犇犃培养基上的生长抑制作用
犉犻犵．１　犐狀犺犻犫犻狋犻狅狀犲犳犳犲犮狋狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀狋犳狌狀犵犪犾犲狀犱狅狆犺狔狋犲犃．犻犿狆犾犻犮犪狋狌犿犻狊狅犾犪狋犲狊狋狅狆犪狋犺狅犵犲狀犇．狊狆．狅狀犘犇犃犿犲犱犻狌犿
　第１行的Ａ培养皿中的菌落、Ｂ～Ｈ培养皿中的下方菌落以及第２～４行各培养皿中的中央菌落为德氏霉，其余菌落为内生真菌交织顶孢霉，每行
Ｂ～Ｈ培养皿中的交织顶孢霉分离物分别为ＥＢ６７８０．５０１、ＥＨ３２ａ、Ｅｐｉｎｅｄｏ、ＥＢ６０６、ＥＢ６７８０．２０１、ＥＨ１９、ＥＢ１６８４５．９０９；培养条件为在ＰＤＡ培养基上，
２８℃黑暗培养；拍照时间分别为德氏霉接种后７ｄ（第１～３行）和３０ｄ（第４行）
　ＣｏｌｏｎｉｅｓｉｎｐｌａｔｅＡ，ｔｈｅｄｏｗｎｓｉｄｅｏｆｔｈｅｆｉｒｓｔｒｏｗ，ｔｈｅｃｅｎｔｅｒｏｆｔｈｅｓｅｃｏｎｄｔｏｔｈｅｆｏｕｒｔｈｒｏｗｏｆｐｌａｔｅｓＢｔｏＨｗｅｒｅ犇．ｓｐ．，ｏｔｈｅｒｃｏｌｏｎｉｅｓｉｎｐｌａｔｅｓ
ＢｔｏＨｏｆｅｖｅｒｙｒｏｗｗｅｒｅ犃．犻犿狆犾犻犮犪狋狌犿ｉｓｏｌａｔｅｓＥＢ６７８０．５０１，ＥＨ３２ａ，Ｅｐｉｎｅｄｏ，ＥＢ６０６，ＥＢ６７８０．２０１，ＥＨ１９，ＥＢ１６８４５．９０９，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ
ｐｉｃｔｕｒｅｗａｓｔａｋｅｎｏｎｔｈｅｓｅｖｅｎｔｈｄａｙｔｏｔｈｅ１ｓｔ－３ｒｄｒｏｗａｎｄｔｈｅｔｈｉｒｔｉｅｔｈｄａｙｔｏｔｈｅ４ｔｈｒｏｗａｆｔｅｒｉｎｏｃｕｌａｔｅｄｗｉｔｈ犇．ｓｐ．ａｎｄｃｕｌｔｕｒｅｄｏｎＰＤＡｍｅｄｉ
ｕｍｕｎｄｅｒｄａｒｋｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｔ２８℃
图２　不同内生真菌交织顶孢霉分离物对病原菌立枯丝核菌犆犐犃犜６７８０在犘犇犃培养基上的生长抑制作用
犉犻犵．２　犐狀犺犻犫犻狋犻狅狀犲犳犳犲犮狋狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀狋犳狌狀犵犪犾犲狀犱狅狆犺狔狋犲犃．犻犿狆犾犻犮犪狋狌犿犻狊狅犾犪狋犲狊
狋狅狆犪狋犺狅犵犲狀犚．狊狅犾犪狀犻犆犐犃犜６７８０狅狀犘犇犃犿犲犱犻狌犿
　第１行的Ａ培养皿中的菌落、Ｂ～Ｈ培养皿中的下方菌落以及第２～４行各培养皿中的中央菌落为立枯丝核菌ＣＩＡＴ６７８０，其余菌落为内生真菌交
织顶孢霉，每行Ｂ～Ｈ培养皿中的交织顶孢霉分离物分别为ＥＢ６７８０．５０１、ＥＨ３２ａ、ＥＢ６０６、ＥＢ６７８０．２０１、Ｅｐｉｎｅｄｏ、ＥＨ１９、ＥＢ１６８４５．９０９；培养条件为在
ＰＤＡ培养基上，２８℃黑暗培养；拍照时间分别为立枯丝核菌ＣＩＡＴ６７８０接种后３ｄ（第１～３行）和７ｄ（第４行）
　ＣｏｌｏｎｉｅｓｉｎｐｌａｔｅＡ，ｔｈｅｄｏｗｎｓｉｄｅｏｆｔｈｅｆｉｒｓｔｒｏｗ，ｔｈｅｃｅｎｔｅｒｏｆｔｈｅｓｅｃｏｎｄｔｏｔｈｅｆｏｕｒｔｈｒｏｗｏｆｐｌａｔｅｓＢｔｏＨｗｅｒｅ犚．狊狅犾犪狀犻ＣＩＡＴ６７８０，ｏｔｈｅｒ
ｃｏｌｏｎｉｅｓｉｎｐｌａｔｅｓＢｔｏＨｏｆｅｖｅｒｙｒｏｗｗｅｒｅ犃．犻犿狆犾犻犮犪狋狌犿ｉｓｏｌａｔｅｓＥＢ６７８０．５０１、ＥＨ３２ａ、ＥＢ６０６、ＥＢ６７８０．２０１、Ｅｐｉｎｅｄｏ、ＥＨ１９、ＥＢ１６８４５．９０９，ｒｅｓｐｅｃ
ｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｐｉｃｔｕｒｅｗａｓｔａｋｅｎｏｎｔｈｅｔｈｉｒｄｄａｙｔｏｔｈｅ１ｓｔ－３ｒｄｒｏｗａｎｄｔｈｅｓｅｖｅｎｔｈｄａｙｔｏｔｈｅ４ｔｈｒｏｗａｆｔｅｒｉｎｏｃｕｌａｔｅｄｗｉｔｈ犚．狊狅犾犪狀犻ＣＩＡＴ６７８０ａｎｄ
ｃｕｌｔｕｒｅｄｏｎＰＤＡｍｅｄｉｕｍｕｎｄｅｒｄａｒｋｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｔ２８℃
１４第１８卷第２期 草业学报２００９年
表１　不同内生真菌交织顶孢霉分离物对病原菌德氏霉在犘犇犃培养基上的生长抑制作用
犜犪犫犾犲１　犐狀犺犻犫犻狋犻狅狀犲犳犳犲犮狋狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀狋犳狌狀犵犪犾犲狀犱狅狆犺狔狋犲犃．犻犿狆犾犻犮犪狋狌犿犻狊狅犾犪狋犲狊狋狅狆犪狋犺狅犵犲狀犇．狊狆．狅狀犘犇犃犿犲犱犻狌犿
内生真菌
分离物
Ｉｓｏｌａｔｅｓｏｆ
ｅｎｄｏｐｈｙｔｅ
接种３个内生真菌菌落
Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｏｆ３ｃｏｌｏｎｉｅｓｏｆ
ｅａｃｈｅｎｄｏｐｈｙｔｅｉｓｏｌａｔｅ
ＩＤ（ｍｍ） ＳＲ（ｍｍ）
接种２个内生真菌菌落
Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｏｆ２ｃｏｌｏｎｉｅｓｏｆ
ｅａｃｈｅｎｄｏｐｈｙｔｅｉｓｏｌａｔｅ
ＩＤ（ｍｍ） ＳＲ（ｍｍ）
接种１个内生真菌菌落
Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｏｆ１ｃｏｌｏｎｉｅｓｏｆ
ｅａｃｈｅｎｄｏｐｈｙｔｅｉｓｏｌａｔｅ
ＩＤ（ｍｍ） ＳＲ（ｍｍ）
抑制作用
Ｅｆｆｅｃｔｏｆ
ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ
ＥＢ６７８０．５０１ ７．９ａ ９．０ｇ ６．３ａ ８．５ｆ １０．７ａ １７．３ｆ 最强Ｓｔｒｏｎｇｅｓｔ
ＥＨ３２ａ １．６ｃ １０．６ｆ ０．３ｂ １１．３ｅ ２．２ｂ １９．８ｅ 强Ｓｔｒｏｎｇｅｒ
Ｅｐｉｎｅｄｏ ２．４ｂ １４．６ｅ ０．３ｂ １７．７ｄ １．０ｃ ２６．０ｃ 中等 Ｍｅｄｉｕｍ
ＥＢ６０６ ０ｄ ２１．１ｂ ０ｃ ２１．２ｃ ０．７ｄ ２６．３ｃ 弱 Ｗｅａｋ
ＥＢ６７８０．２０１ ０ｄ １９．２ｄ ０ｃ ２１．０ｃ ０．２ｅ ２７．３ｂ 弱 Ｗｅａｋ
ＥＨ１９ ０ｄ ２０．９ｃ ０ｃ ２３．５ｂ ０．３ｅ ２５．０ｄ 微弱 Ｗｅａｋｅｒ
ＥＢ１６８４５．９０９ ０ｄ ２６．７ａ ０ｃ ２９．３ａ ０ｆ ３１．３ａ 无Ｎｏｎｅ
ＣＳＲ（ｍｍ） ２８．３
　注：表１和２中，ＩＤ指内生真菌菌落与病原菌菌落间距离的平均值。ＳＲ指病原菌菌落的最短半径（沿内生真菌菌落方向）。ＣＳＲ指对照培养基上
（无内生真菌）病原菌菌落的半径。同列不同小写字母表示０．０５水平上差异显著。抑制作用：根据ＩＤ值的大小、ＳＲ与ＣＳＲ比较结果来综合评价各
个内生真菌分离物对病原真菌菌丝生长抑制作用的强弱。若ＩＤ值大于０、或ＳＲ比ＣＳＲ小，则该内生真菌分离物具有抑菌活性；反之则无抑菌活
性。ＩＤ值愈大、或ＳＲ比ＣＳＲ愈小，则该内生真菌分离物的抑菌活性愈强。
　Ｎｏｔｅ：Ｉｎｔａｂｌｅ１ａｎｄｔａｂｌｅ２，ＩＤ：Ｔｈｅｍｅａｎｏｆｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｄｉｓｔａｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｃｏｌｏｎｉｅｓｏｆｔｈｅｅｎｄｏｐｈｙｔｅａｎｄｐａｔｈｏｇｅｎ．ＳＲ：Ｔｈｅｓｈｏｒｔｅｓｔｒａｄｉｕｓｏｆｔｈｅ
ｐａｔｈｏｇｅｎｓｔｏｗａｒｄｔｈｅ犃．犻犿狆犾犻犮犪狋狌犿ｃｏｌｏｎｉｅｓ．ＣＳＲ：ＴｈｅｓｈｏｒｔｅｓｔｒａｄｉｕｓｏｆｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｓｏｎＰＤＡｍｅｄｉｕｍｗｉｔｈｏｕｔｅｎｄｏｐｈｙｔｅ．Ｉｎｓａｍｅｌｉｎｅ，ｔｈｅｄｉｆｆｅｒ
ｅｎｔｓｍａｌｌｅｔｔｅｒｍｅａｎｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔ犘＜０．０５．Ｅｆｆｅｃｔｏｆｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ：ＩｆＩＤｉｓｏｖｅｒ０，ｏｒＳＲｉｓｌｅｓｓｔｈａｎＣＳＲ，ｉｔｒｅｓｐｒｅｓｅｎｔｓｔｈａｔｔｈｅｅｎｄｏｐｈｙｔｅ
ｉｓｏｌａｔｅｓｈｏｗｅｄｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｔｏｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎ．ＴｈｅｂｉｇｇｅｒｏｆＩＤｏｒｔｈｅｖａｌｕｅｏｆＳＲｓｕｂｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍＣＳＲｉｓ，ｔｈｅｓｔｒｏｎｇｅｒｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｅｆｆｅｃｔｉｓ．
表２　不同内生真菌交织顶孢霉分离物对病原菌立枯丝核菌犆犐犃犜６７８０在犘犇犃培养基上的生长抑制作用
犜犪犫犾犲２　犐狀犺犻犫犻狋犻狅狀狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀狋犳狌狀犵犪犾犲狀犱狅狆犺狔狋犲犃．犻犿狆犾犻犮犪狋狌犿犻狊狅犾犪狋犲狊狋狅
狆犪狋犺狅犵犲狀犚．狊狅犾犪狀犻犆犐犃犜６７８０狅狀犘犇犃犿犲犱犻狌犿
内生真菌
分离物
Ｉｓｏｌａｔｅｓｏｆ
ｅｎｄｏｐｈｙｔｅ
接种３个内生真菌菌落
Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｏｆ３ｃｏｌｏｎｉｅｓｏｆ
ｅａｃｈｅｎｄｏｐｈｙｔｅｉｓｏｌａｔｅ
ＩＤ（ｍｍ） ＳＲ（ｍｍ）
接种２个内生真菌菌落
Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｏｆ２ｃｏｌｏｎｉｅｓｏｆ
ｅａｃｈｅｎｄｏｐｈｙｔｅｉｓｏｌａｔｅ
ＩＤ（ｍｍ） ＳＲ（ｍｍ）
接种１个内生真菌菌落
Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｏｆ１ｃｏｌｏｎｉｅｓｏｆ
ｅａｃｈｅｎｄｏｐｈｙｔｅｉｓｏｌａｔｅ
ＩＤ（ｍｍ） ＳＲ（ｍｍ）
抑制作用
Ｅｆｆｅｃｔｏｆ
ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ
ＥＢ６７８０．５０１ ７．８ａ ８．０ｇ ６．４ａ ６．０ｇ １３．３ａ １５．３ｇ 最强Ｓｔｒｏｎｇｅｓｔ
ＥＨ３２ａ ３．０ｂ ９．６ｆ ４．８ｂ ７．１ｆ ４．８ｂ １８．７ｆ 强Ｓｔｒｏｎｇ
ＥＢ６０６ ２．１ｃ １７．０ｅ ０．５ｃ １８．３ｅ ４．２ｃ ２０．０ｅ 中等 Ｍｅｄｉｕｍ
ＥＢ６７８０．２０１ ０ｄ １７．９ｄ ０ｄ ２１．０ｄ ０ｄ ２８．３ｄ 弱 Ｗｅａｋ
Ｅｐｉｎｅｄｏ ０ｄ ３２．２ｃ ０ｄ ２９．０ｃ ０ｄ ３５．０ｂ 微弱 Ｗｅａｋｅｒ
ＥＨ１９ ０ｄ ３５．０ｂ ０ｄ ３３．０ｂ ０ｄ ３３．７ｃ 微弱 Ｗｅａｋｅｒ
ＥＢ１６８４５．９０９ ０ｄ ３９．６ａ ０ｄ ３９．５ａ ０ｄ ４２．０ａ 无Ｎｏｎｅ
ＣＳＲ（ｍｍ） ３７．３
内生真菌对病原菌立枯丝核菌侵入的早期具有明显的拮抗作用，但是这种拮抗作用随着病原菌侵入时间的延长
而减弱。
２．３　内生真菌原初提取物对病原真菌的抗性分析
内生真菌ＥＨ３２ａ的原初提取物对旗草病原真菌德氏霉和立枯丝核菌具有明显的生长抑制作用。当原初提
２４ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．２
取物经过热处理或蛋白水解酶处理后，抑菌作用明
图３　内生真菌交织顶孢霉感染的和无内生真菌的旗草植株接
种病原菌立枯丝核菌犆犐犃犜６７８０后病斑垂直向上扩展距离
犉犻犵．３　犇犻狊犲犪狊犲狆狉狅犵狉犲狊狊犻狅狀犿犲犪狊狌狉犲犱犻狀犲狀犱狅狆犺狔狋犲犻狀犳犲犮狋犲犱
犪狀犱犲狀犱狅狆犺狔狋犲犳狉犲犲狆犾犪狀狋狊狅犳犅．犫狉犻狕犪狀狋犺犪
犻狀狅犮狌犾犪狋犲犱狑犻狋犺犚．狊狅犾犪狀犻犆犐犃犜６７８０
　　　Ｅ＋Ｈ３２为内生真菌ＥＨ３２ａ感染的旗草ＣＩＡＴ１６３２０植株，Ｅ－Ｈ３２为
无内生真菌感染的旗草ＣＩＡＴ１６３２０植株，Ｅ＋Ｐ６３为内生真菌ＥＢ６７８０．２０１感
染的旗草ＣＩＡＴ６７８０植株，Ｅ＋Ｐ１１１为内生真菌ＥＢ６７８０．５０１感染的旗草
ＣＩＡＴ６７８０植株，Ｅ－Ｐ６３和Ｅ－Ｐ１１１为无内生真菌感染的旗草 ＣＩＡＴ
６７８０植株
　Ｅ＋Ｈ３２ｗｅｒｅｐｌａｎｔｓｆｒｏｍ犅．犫狉犻狕犪狀狋犺犪ＣＩＡＴ１６３２０ｉｎｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｅｎｄｏ
ｐｈｙｔｅＥＨ３２ａ，Ｅ－Ｈ３２ｗｅｒｅｐｌａｎｔｓｆｒｏｍ犅．犫狉犻狕犪狀狋犺犪ＣＩＡＴ１６３２０ｅｎｄｏ
ｐｈｙｔｅｆｒｅｅ，Ｅ＋Ｐ６３ｗｅｒｅｐｌａｎｔｓｆｒｏｍ犅．犫狉犻狕犪狀狋犺犪ＣＩＡＴ６７８０ｉｎｆｅｃｔｅｄ
ｗｉｔｈｅｎｄｏｐｈｙｔｅＥＢ６７８０．２０１，Ｅ＋Ｐ１１１ｗｅｒｅｐｌａｎｔｓｆｒｏｍ犅．犫狉犻狕犪狀狋犺犪
ＣＩＡＴ６７８０ｉｎｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｅｎｄｏｐｈｙｔｅＥＢ６７８０．５０１，Ｅ－Ｐ６３ａｎｄＥ－Ｐ１１１
ｗｅｒｅｐｌａｎｔｓｆｒｏｍ犅．犫狉犻狕犪狀狋犺犪ＣＩＡＴ６７８０ｅｎｄｏｐｈｙｔｅｆｒｅｅ
显减弱或消失（图４），说明内生真菌能分泌抗病原
真菌的活性物质，而且这些活性物质是热不稳定的、
能被蛋白酶水解。
３　讨论
不同内生真菌分离物对同一病原菌的体外抑制
能力不同，说明内生真菌分泌的抑菌物质的种类或
数量在分离物间存在差异，这一结论与Ｓｉｅｇｅｌ和
Ｌａｔｃｈ［１５］对温带牧草内生真菌的试验结果相符。同
一种内生真菌分离物对不同病原菌的抑制效果不
同，可能说明一种内生真菌分离物能分泌多种抑菌
活性物质、不同活性物质特异抑制某一特定病原菌
的生长，或者是每种内生真菌分离物只能分泌一种
抑菌活性物质、但是不同病原菌对它的反应不一致，
这有待进一步研究。
人工接种德氏霉的旗草植株上，内生真菌感染
的植株比无内生真菌的植株病斑小而少［２０］。这与
本试验的体外抑菌结果具有相关性，在培养基上，内
生真菌的某些分离物具有很强的抑菌作用（图１，表
１）。为什么感染内生真菌的旗草植株具有明显的抗
德氏霉引起的叶斑病现象，而对立枯丝核菌所引起
的叶枯病的抗性却只表现在病原菌接种后的早期，
这也许可从内生真菌的体外抑菌试验结果和不同病
原菌在植株体内的发病规律得到某些解释。在体外抑菌试验中，对内生真菌分离物ＥＢ６７８０．５０１和ＥＨ３２ａ来
说，在接种德氏霉３０ｄ后仍然有明显的抑菌圈（图１）；但是，当接种立枯丝核菌后，只有在早期（３ｄ内），这２种内
生真菌分离物才表现出强抑菌作用，７ｄ后，抑菌作用明显减弱（图２），２周后，几乎观测不到抑菌作用。病原菌的
生长速度方面，在ＰＤＡ培养基上，２８℃，黑暗条件下培养时，德氏霉菌丝的生长明显慢于立枯丝核菌，当接种量
均为４ｍｍ菌丝块时，１００ｍｍ×１５ｍｍ的培养皿的培养基表面长满菌丝体对于立枯丝核菌只需３～４ｄ，而德氏
霉则需３０ｄ左右。就植株体内病害的扩展速度而言，德氏霉引起的叶斑病的发病速度和扩展速度比立枯丝核菌
所引起的叶枯病慢。这说明内生真菌分泌的抗真菌活性物质的数量和速度能有效地抑制德氏霉的生长；在接种
立枯丝核菌后的早期，内生真菌分泌的抗真菌活性物质也足以抑制立枯丝核菌的生长，但是随着时间的延长，由
于立枯丝核菌的生长和扩展较快，内生真菌分泌的抗真菌活性物质的速度和数量不能与抑制立枯丝核菌的生长
速度同步，使得抑菌现象和抗病现象愈来愈不明显。在自然条件下，不可能具备本试验的发病室中所提供的病害
发生的理想条件（高温、高湿、每个植株都有病原菌接触），内生真菌的抗病效果可能会更加明显。这也许就是感
染内生真菌的牧场内的植物往往具有较好的抗病能力的原因。
令人欣慰的是植株体外的内生真菌的抑菌试验结果与体内抗病试验结果相关，在体外抑菌能力强的菌株，譬
如ＥＨ３２ａ、ＥＢ６７８０．５０１，在体内也有较好的植物保护作用（表２，图２，３）。由于内生真菌的体外抗病试验环节较
多，操作麻烦，而离体抑菌试验操作简单，因此，在评价和筛选抗病内生真菌分离物的工作中，先对不同内生真菌
分离物进行离体抑菌试验，从中筛选出抑菌能力强的菌株后，再作进一步的体内抗病检测，效率会更高。
内生菌抑菌（抗病）活性物质的分离鉴定已有一些报道，从雷公藤（犜狉犻狆狋犲狉狔犵犻狌犿狑犻犾犳狅狉犱犻犻）的内生真菌中
分离到２种抗菌素———多肽类化合物和新酰胺生物碱，前者能抑制灰葡萄孢等多种植物病原真菌，后者对水稻
（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）稻瘟病菌等有抑制作用。从锡兰肉桂（犆犻狀狀犪犿狅犿狌犿狕犲狔犾犪狀犻犮狌犿）的内生真菌分离到５类挥发性
３４第１８卷第２期 草业学报２００９年
有机物———醇、酯、酮、酸和脂，对人和植物体的多种
图４　犈犎３２犪原初提取物不同处理对德氏霉（犪）和立枯丝核菌
犆犐犃犜６７８０（犫）在犘犇犃培养基上的生长抑制作用
犉犻犵．４　犐狀犺犻犫犻狋犻狅狀狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀狋狋狉犲犪狋犿犲狀狋狅犳犈犎３２犪狋狅犇．狊狆．犻狀
狆犾犪狋犲犪犪狀犱犚．狊狅犾犪狀犻犆犐犃犜６７８０犻狀狆犾犪狋犲犫狅狀犘犇犃犿犲犱犻狌犿
　　　中央菌落分别为病原菌德氏霉（ａ）和立枯丝核菌ＣＩＡＴ６７８０（ｂ）。纸片
１～３加有经过不同处理的交织顶孢霉菌株ＥＨ３２ａ的原初提取物，纸片１
的 原初提取物没有经过处理，纸片２的原初提取物经过热处理，纸片３
的原初提取物经过蛋白酶处理。纸片４加无菌蒸馏水
　Ｃｏｌｏｎｉｅｓｉｎｔｈｅｃｅｎｔｅｒｏｆｐｌａｔｅａａｎｄｂｗｅｒｅ犇．ｓｐ．ａｎｄ犚．狊狅犾犪狀犻ＣＩＡＴ
６７８０，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｐａｐｅｒｄｉｓｃｓｏｆ１－３ｗｅｒｅａｄｄｅｄｗｉｔｈｃｒｕｄｅｅｘｔｒａｃｔｓｏｆ
ＥＨ３２ａｔｒｅａｔｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｗａｙ．Ｔｏｄｉｓｃ１－３，ｅｘｔｒａｃｔｓｗｅｒｅｎｏｔｔｒｅａｔｅｄ，
ｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｈｅａｔｉｎｇａｎｄｐｒｏｎａｓｅ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｓｔｅｒｉｌｅｄｉｓｔｉｌｅｄｗａｔｅｒｗｅｒｅ
ａｄｄｅｄｏｎｔｏｄｉｓｃ４
病原真菌和细菌均有杀灭作用，表现出广谱抗
性［２１～２３］。Ｌｉｕ等［２４］从黄花蒿（犃狉狋犲犿犻狊犻犪犪狀狀狌犪）的
内生真菌中分离到多种抗真菌活性物质，如３β羟
基麦角甾５烯、６异戊二烯吲哚３羧酸和３β，５α二
羟甲基６β乙酸基麦角甾７，２２二烯等，经试验证
明这些物质对禾顶囊壳小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿）变
种、小麦纹枯病菌和疫霉等多种农作物病原真菌的
生长有抑制作用。Ｚｏｕ等［２５］从蒙古蒿（犃．犿狅狀犵狅犾
犻犮犪）内生真菌的液体发酵产物中分离到炭疽菌酸，
能有效抑制小麦病原真菌根腐病菌。从热带雨林植
物中分离到的拟盘多毛孢属内生真菌能产生有机
酸，对植物病原真菌有强烈抑制作用［２６］。Ｗｅｂｅｒ
等［２７］从 内 生 真 菌 株 Ｅ９９２０４，Ｅ９９２９１，Ｅ９９２９７，
Ｅ９９４０１和Ｅ００１７５分离得到对白色念珠菌具有抗
性的５类活性物质：浅蓝菌素、球番石榴素Ａ、５（１，
３丁二烯１基）３（丙烯１基）２（５Ｈ）呋喃酮以及
２种萜类化合物ａｒｕｎｄｉｆｕｎｇｉｎ和ａｓｃｏｓｔｅｒｏｓｉｄｅ）。本
试验中，内生真菌ＥＨ３２ａ的原初提取物对德氏霉和
立枯丝核菌具有明显的生长抑制作用，由于这种抗
真菌活性物质是热不稳定的、能被蛋白酶水解，加之，已经从内生真菌中可以分离获得抗菌蛋白肽类物质，因此，
初步推断这类抗真菌活性物质可能属于蛋白质（肽）或酶类。活性物质的分离和鉴定还在进一步的研究中。
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狀犪ａｇａｉｎｓｔｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｆｕｎｇｕｓ犆犾犪犱狅狊狆狅狉犻狌犿狆犺犾犲犻ｏｎｔｉｍｏｔｈｙｌｅａｖｅｓ［Ｊ］．ＡｎｎａｌｓｏｆｔｈｅＰｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙＳｏｃｉｅｔｙｏｆＪａｐａｎ，
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ａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇｔｈｅｆｕｎｇｕｓ，ａｎｄｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｉｔｓａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ［Ｊ］．ＣａｎａｄｉａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００１，４７：５５
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ｌｏｔｉｏｐｓｉｓｓｐｐ．ａｎｄ犕狅狀狅犮犺犪犲狋犻犪ｓｐ．［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００１，５６：４６３４６８．
［２７］　ＷｅｂｅｒＲＷＳ，ＲｅｉｎｈａｒｄＫ，ＴｈｏｍａｓＰ，犲狋犪犾．ＡｎｔｉＣａｎｄｉｄａｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｆｒｏｍｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｉ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００７，６８：
８８６８９２．
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（１．ＡｇｒｏｎｏｍｙＣｏｌｅｇｅ，ＨａｉｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｄａｎｚｈｏｕ５７１７３７，Ｃｈｉｎａ；２．ＢｅｃＡＩＬＲＩ
ｐｌａｔｆｏｒｍ，Ｎａｉｒｏｂｉ００１００，Ｋｅｎｙａ）
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５４第１８卷第２期 草业学报２００９年