全 文 ：两种方法在二斑叶螨电压门控钠离子
通道基因突变检测中的应用
杨顺义１，岳秀利１，王进军２，沈慧敏１，郭金梅１，沈一凡１，周兴隆１
（１．甘肃农业大学草业学院 草业生态系统省部共建教育部重点实验室 中－美草地畜牧业可持续发展中心，
甘肃 兰州７３００７０；２．西南大学植物保护学院 昆虫学及害虫控制工程重点实验室，重庆４００７１６）
摘要：靶标突变是二斑叶螨对拟除虫菊酯类药剂产生高抗性的重要原因，而用于靶标突变检测的方法较多，有必要
寻找一种经济、灵敏且有效的方法进行突变检测。本研究根据二斑叶螨电压门控钠离子通道（ｖｏｌｔａｇｅ－ｇａｔｅｄｓｏｄｉ
ｕｍｃｈａｎｎｅｌｓ，ＶＧＳＣｓ）基因上已报道的３个点突变（Ｌ１０２２Ｖ、Ａ１２１５Ｄ和Ｆ１５３８Ｉ），采用ＰＣＲ产物直接测序和限制性
片段长度多态性聚合酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＰＣＲ－ＲＦＬＰ）
两种不同的方法对二斑叶螨田间种群（ＷＷＲ和ＬＺＲ）进行靶标ＶＧＳＣｓ基因突变检测。ＰＣＲ产物直接测序结果
显示，与ＳＳ种群相比，ＷＷＲ和ＬＺＲ种群ＶＧＳＣｓ基因均存在两种氨基酸突变Ａ１２１５Ｄ和Ｆ１５３８Ｉ，但没有发现存
在Ｆ１０２２Ｖ突变，其中Ａ１２１５Ｄ突变发生在结构域ⅡＳ６ⅢＳ１连接处，Ｆ１５３８Ｉ突变发生在结构域ⅢＳ６螺旋处，而采
用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ方法只检测出Ａ１２１５Ｄ突变。两种不同的方法对田间采集的二斑叶螨种群 ＶＧＳＣｓ基因突变位点
检测的比较，为抗菊酯类药剂二斑叶螨种群抗性分子监测技术的建立和抗性治理奠定了基础。
关键词：二斑叶螨；甲氰菊酯；靶标突变；直接测序法；ＰＣＲ－ＲＦＬＰ法
中图分类号：Ｓ４３３．７ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１４）０５０１５３０８
犇犗犐：１０．１１６８６／ｃｙｘｂ２０１４０５１７
二斑叶螨（犜犲狋狉犪狀狔犮犺狌狊狌狉狋犻犮犪犲）是一种世界性害螨，可危害１１００多种寄主植物，除了粮食作物、果树、花卉、
蔬菜等以外，还可以危害城市绿地植物和牧草，且随着全球变暖，该叶螨在部分寄主植物上的危害有逐渐加重的
趋势［１３］。二斑叶螨由于体型较小、世代周期短、抗逆性强等特点，抗性发展迅速［４］，对多种农药尤其是甲氰菊酯
已产生严重的抗药性。甲氰菊酯属拟除虫菊酯类杀虫杀螨剂，作用靶标为电压门控钠离子通道（ｖｏｌｔａｇｅｇａｔｅｄ
ｓｏｄｉｕｍｃｈａｎｎｅｌｓ，ＶＧＳＣｓ），ＶＧＳＣｓ是一种较大的跨膜蛋白，包括４个同源结构域（ＩＩＶ），每个结构域由６个跨膜
螺旋（Ｓ１Ｓ６）组成。ＶＧＳＣｓ的不敏感性主要由跨膜螺旋或连接处的点突变引起，主要发生在ⅡＳ４ⅡＳ６和ⅢＳ６
上［５］，并且有的突变与击倒抗性和超击倒抗性有着密切联系。至今，在蛛形纲蜱螨类以及其他昆虫抗拟除虫菊酯
种群靶标基因 ＶＧＳＣｓ的点突变已有很多报道。在二斑叶螨抗性种群 ＶＧＳＣｓ基因中只发现３个突变，即
Ｌ１０２２Ｖ、Ａ１２１５Ｄ和Ｆ１５３８Ｉ，并且Ｌ１０２２Ｖ和Ｆ１５３８Ｉ突变对击倒抗性起着主要作用［６７］。在朱砂叶螨（犜．犮犻狀狀犪
犫犪狉犻狀狌狊）抗甲氰菊酯种群中同样发现存在Ｆ１５３８Ｉ突变［８］；在蜂螨（犞犪狉狉狅犪犱犲狊狋狉狌犮狋狅狉）中，ＶＧＳＣｓ上也有４个突
变Ｆ７５８Ｌ，Ｌ８２６Ｐ，Ｉ９８２Ｖ和 Ｍ１０５５Ｉ［９］，而电生理的研究表明Ｌ８２６Ｐ突变对氯氟胺氰戊菊酯敏感性降低起着重要
的功能作用［１０］。在家蝇（犕狌狊犮犪犱狅犿犲狊狋犻犮犪）的ＶＧＳＣｓ中，最常见的Ｌ１０１４Ｆ／Ｈ／Ｓ突变在击倒抗性和超击倒抗性
种群中都存在，而 Ｍ９１８Ｔ突变只存在于超击倒抗性种群中［１１１３］。靶标ＶＧＳＣｓ基因突变是害螨及昆虫对拟除虫
菊酯类药剂产生抗性的主要机制。
目前，基因突变检测的方法很多，主要有焦磷酸直接测序（ｄｉｒｅｃｔｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＤＳ），单链构象多态性分析
（ｓｉｎｇｌｅｓｔｒａｎｄｅｄｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＳＣＰ），限制性片段长度多态性聚合酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎ
ｒｅａｃｔｉｏｎｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＰＣＲ－ＲＦＬＰ）以及实时荧光定量ＰＣＲ（ｒｅａｌｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔｉｖｅ
第２３卷 第５期
Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．５
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
１５３－１６０
２０１４年１０月
收稿日期：２０１４０５０９；改回日期：２０１４０５２２
基金项目：国家自然科学基金（３１２６０４４２）和公益性行业（农业）科研专项（２０１１０３０２０）资助。
作者简介：杨顺义（１９７２），男，甘肃礼县人，副教授，硕士。Ｅｍａｉｌ：ｙａｎｇｓｈｙ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｎｄｓｈｍ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
ＰＣＲ，ＲＴ－ｑＰＣＲ）和毛细管电泳法（ｃａｐｉｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＣＥ）［１４］等。高明等［１５］通过克隆测序发现甜菜夜
蛾（犛狆狅犱狅狆狋犲狉犪犲狓犻犵狌犪）抗性种群钠离子通道基因ⅡＳ６上存在Ｌ１０１４Ｆ突变。各种检测方法优缺点不一，有必要
寻找一种经济、灵敏且有效的突变检测方法。本研究采用ＰＣＲ产物直接测序法与ＰＣＲ－ＲＦＬＰ两种不同的方法
对田间采集的二斑叶螨种群ＶＧＳＣｓ基因进行突变位点的检测，旨在建立二斑叶螨对菊酯类农药抗性的分子检
测方法，为二斑叶螨的抗药性治理提供技术支持。
１ 材料与方法
１．１ 供试二斑叶螨
二斑叶螨相对敏感种群（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅｓｔｒａｉｎ，ＳＳ）：２００７年６月底采自甘肃省兰州市兴隆山国家级森林公园金
花忍冬（犔狅狀犻犮犲狉犪犮犺狉狔狊犪狀狋犺犪）上。在室内采用叶碟法（培养皿底部垫有浸水和表面铺一黑布的海绵，黑布上放
用脱脂棉包围的豇豆叶片）进行单对（挑一雌一雄在叶碟上饲养，不接触任何药剂）繁殖，待种群扩大后转移到盆
栽豇豆（犞犻犵狀犪狌狀犵狌犻犮狌犾犪狋犪）苗上扩繁。田间抗性种群：ＬＺＲ和 ＷＷＲ种群于２０１２年８月分别采集于甘肃省
兰州市和武威市田间种植的茄子（犛狅犾犪狀狌犿犿犲犾狅狀犵犲狀犪）和南瓜（犆狌犮狌狉犫犻狋犪犿狅狊犮犺犪狋犪）上，待种群在室内扩繁定殖
后，测定其对甲氰菊酯的抗性分别达到２７．４和２３．１倍。以上二斑叶螨ＳＳ、ＷＷＲ和ＬＺＲ种群饲养在养虫室
盆栽的豇豆苗上。控制条件：温度（２６±１）℃，相对湿度（７５±５）％，光照１４ｈ，黑暗１０ｈ。
１．２ 主要药剂及仪器
２０％甲氰菊酯乳油（红太阳农药集团有限公司），ＲＮＡ提取试剂盒ＲＮｅａｓｙ?ＰｌｕｓＭｉｃｒｏＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ公司），
反转录试剂盒ＰｒｉｍｅｒＳｃｒｉｐｔ? ＲＴＲｅａｇｅｎｔＫｉｔ，ｒＴａｑ酶等ＰＣＲ相关试剂（ＴａＫａＲａ公司），限制性核酸内切酶
Ｓａｕ３ＡＩ和ＢｃｌＩ（Ｔｈｅｒｍｏ公司），Ｓ１０００ＴＭ ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｉｎｇＰＣＲ仪（ＢｉｏＲａｄ公司），ＰｏｗｅｒＰａｃＢａｓｉｃ电泳仪（Ｂｉｏ
Ｒａｄ公司），ＵｎｉｖｅｒｓａｌＨｏｏｄＩＩ凝胶成像仪（ＢｉｏＲａｄ公司），Ｎａｎｏｖｕｅ核酸浓度测定仪（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ公司）。
１．３ 二斑叶螨总ＲＮＡ提取
于２０１２年９月分别挑取ＳＳ、ＷＷＲ和ＬＺＲ种群的二斑叶螨雌成螨约５００头，按照Ｑｉａｇｅｎ公司ＲＮＡ提取
试剂盒ＲＮｅａｓｙ?ＰｌｕｓＭｉｃｒｏＫｉｔ使用说明书提取总ＲＮＡ，具体操作步骤如下：
１）预先将研钵用液氮进行多次冷冻，之后加入待研磨样品，反复研磨，再加入３５０μＬＢｕｆｆｅｒＲＬＴｐｌｕｓ继续
研磨均匀，转移至２ｍＬ离心管；
２）将离心管置离心机中１３０００ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ，吸取上清液，记住大致体积Ｖ，转移到ｇＤＮＡＥｌｉｍｉｎａｔｏｒ
ｓｐｉｎｃｏｌｕｍｎ离心管，１００００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｓ，丢掉柱子保存液体；
３）在上述液体中加入Ｖ体积的７０％酒精，混匀；
４）转移上述液体至ＲＮｅａｓｙＭｉｎＥｌｕｔｅｓｐｉｎｃｏｌｕｍｎ离心管中，盖严盖子，１００００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｓ；
５）在ＲＮｅａｓｙＭｉｎＥｌｕｔｅｓｐｉｎｃｏｌｕｍｎ离心管中加入７００μＬＢｕｆｆｅｒＷ１，盖严盖子，１００００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｓ；
６）在ＲＮｅａｓｙＭｉｎＥｌｕｔｅｓｐｉｎｃｏｌｕｍｎ离心管中加入５００μＬＢｕｆｆｅｒＲＰＥ，盖严盖子，１００００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｓ；
７）在ＲＮｅａｓｙＭｉｎＥｌｕｔｅｓｐｉｎｃｏｌｕｍｎ离心管中加入５００μＬ的８０％酒精，盖严盖子，１００００ｒ／ｍｉｎ离心２ｍｉｎ；
８）空离。将柱子放入一新的２ｍＬ离心管里，开盖，１３０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ。
９）洗脱ＲＮＡ。将柱子放入一新的１．５ｍＬ的收集管中。在柱子膜中央加入２０μＬＲＮａｓｅｆｒｅｅｗａｔｅｒ，轻轻
盖上盖子，１３０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ，弃柱子，得到的即所需ＲＮＡ。
对提取得到的总ＲＮＡ经Ｎａｎｏｖｕｅ核酸浓度测定仪测定其浓度时，依照Ａ２６０／２８０和Ａ２６０／２３０的值确定ＲＮＡ纯
度；ＲＮＡ纯度确定后进行琼脂糖电泳胶电泳，根据条带的数目及亮度检测ＲＮＡ的完整性。最终，选取Ａ２６０／２８０在
１．８～２．２之间，Ａ２６０／２３０在２．０～２．４之间的ＲＮＡ样品保存于－８０℃冰箱，备用。
１．４ 反转录合成第一链ｃＤＮＡ
将提取得到的二斑叶螨ＳＳ、ＷＷＲ和ＬＺＲ总ＲＮＡ分别反转录合成第一链ｃＤＮＡ，方法参照Ｔａｋａｒａ公司
反转录试剂盒ＰｒｉｍｅｒＳｃｒｉｐｔ?ＲＴＲｅａｇｅｎｔＫｉｔＰｅｒｆｅｃｔＲｅａｌｔｉｍｅ试剂盒说明书进行。反应体系１０μＬ：５×Ｐｒｉｍｅ
Ｓｃｒｉｐｔ?Ｂｕｆｆｅｒ（ｆｏｒＲｅａｌＴｉｍｅ），２μＬ；ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ?ＲＴＥｎｚｙｍｅＭｉｘＩ，０．５μＬ；ＯｌｉｇｏｄＴＰｒｉｍｅｒ（５０μｍｏｌ／Ｌ），
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０．５μＬ；Ｒａｎｄｏｍ６ｍｅｒｓ（１００μｍｏｌ／Ｌ），０．５μＬ；总ＲＮＡ不超过０．５μｇ；最后补充ＲＮａｓｅＦｒｅｅｄＨ２Ｏ至１０μＬ。
待所有样品加完后，将其放入ＰＣＲ仪中３７℃反转录反应１５ｍｉｎ，８５℃反转录酶失活反应５ｓ。反应完毕后，测定
ｃＤＮＡ浓度，将反转录产物保存于－２０℃冰箱，备用。
１．５ 引物设计
根据二斑叶螨在线基因组数据库（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｐｓｂ．ｕｇｅｎｔ．ｂｅ／ｗｅｂｔｏｏｌｓ／ｂｏｇａｓ／ｏｖｅｒｖｉｅｗ／Ｔｅｔｕｒ）
中ＶＧＳＣｓ基因（基因登录号：Ｔｅｔｕｒ３４ｇ００９７０）全长序列以及该基因序列上报道存在的Ｆ１０２２Ｖ、Ａ１２１５Ｄ和
Ｆ１５３８Ｉ突变等信息，用Ｐｒｉｍｅｒ５．０软件分别设计用于靶标位点ＶＧＳＣｓ上Ｆ１０２２、Ａ１２１５和Ｆ１５３８基因片段扩增
的特异性引物以及ＰＣＲ－ＲＦＬＰ反应的引物，引物名称、片段长度及用途见表１。
表１ 用于犘犆犚扩增的特异性引物及其用途
犜犪犫犾犲１ 犛狆犲犮犻犳犻犮犪狀犱狇狌犪狀狋犻狋犪狋犻狏犲狆狉犻犿犲狉狊犪狀犱狋犺犲犻狉狌狊犲犻狀狋犺犲犲狓狆犲狉犻犿犲狀狋
引物名
Ｐｒｉｍｅｒｎａｍｅ
引物序列 （５′３′）
Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ
片段长度Ｌｅｎｇｔｈ
ｏｆｓｅｇｍｅｎｔ（ｂｐ）
用途
Ｐｕｒｐｏｓｅ
Ａ１ ＧＣＴＣＴＣＡＴＴＧＴＣＴＴＴＧＡＴＣＣＣＴＴ ７３３ 特异扩增Ｆ１０２２片段ＳｐｅｃｉｆｉｃａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒＦ１０２２ｆｒａｇｍｅｎｔ
Ａ２ ＣＣＧＡＴＴＣＣＧＡＧＧＴＴＧＧＴＧＡＧＧ
Ｂ１ ＡＴＣＧＧＴＣＡＡＣＴＴＣＧＣＴＣＡＡＣ ５５７ 特异扩增Ａ１２１５片段ＳｐｅｃｉｆｉｃａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒＡ１２１５ｆｒａｇｍｅｎｔ
Ｂ２ ＧＴＴＴＡＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＣＡＣ
Ｃ１ ＴＴＣＡＡＧＴＧＧＣＡＡＣＡＴＴＣＡＡＡＧＧ ４１６ 特异扩增Ｆ１５３８片段ＳｐｅｃｉｆｉｃａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒＦ１５３８ｆｒａｇｍｅｎｔ
Ｃ２ ＧＴＡＡＴＧＧＴＣＡＡＧＧＧＡＣＡＴＣＡＣＡ
Ｄ１ ＡＴＣＧＧＴＣＡＡＣＴＴＣＧＣＴＣＡＡＣ ５５７ 酶切鉴定Ａ１２１５Ｄ突变ＥｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒＡ１２１５Ｄｍｕｔａｔｉｏｎ
Ｄ２ ＧＴＴＴＡＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＣＡＣ
Ｅ１ ＴＴＣＡＴＣＡＴＴＴＴＴＧＧＣＴＣＴＴＴｇ ７１３ 酶切鉴定Ｆ１５３８Ｉ突变ＥｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒＦ１５３８Ｉｍｕｔａｔｉｏｎ
Ｅ２ ＴＣＧＡＧＡＣＣＡＴＡＡＣＧＴＴＧＣＴ
注：表中小写字母代表错配后的碱基。
Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅｌｏｗｅｒｃａｓｅｌｅｔｔｅｒｉｎｔａｂｌｅｒｅｐｒｅｓｅｎｔｍｉｓｍａｔｃｈｅｄｂａｓｅ．
１．６ ＰＣＲ反应及产物的测序
用于扩增二斑叶螨钠通道相关突变基因的ＰＣＲ反应体系为２５μＬ，其中１０×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ２．５μＬ，ＭｇＣｌ２（２５
ｍｍｏｌ／Ｌ）２．５μＬ，ｄＮＴＰｓ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）２μＬ，ｄｄＨ２Ｏ１４．８μＬ，ｒＴａｑ酶（５Ｕ／μＬ）０．２μＬ，上下游引物（１０
μｍｏｌ／Ｌ）各１μＬ，ｃＤＮＡ模板（二斑叶螨不同种群的ｃＤＮＡ）１μＬ。扩增条件：９５℃预变性３ｍｉｎ；９５℃变性３０ｓ，
５５℃复性３０ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，共３５个循环；最后７２℃延伸１０ｍｉｎ。ＰＣＲ反应产物经１％琼脂糖凝胶电泳，若
检测到目的条带，且条带单一、明亮，则可以直接进行测序。试验重复３次。
１．７ 突变位点的ＰＣＲ－ＲＦＬＰ法检测
Ａ１２１５Ｄ突变位点的检测：采用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ法扩增目的片段，扩增产物用限制性核酸内切酶消化成不同大
小的片段，直接在琼脂糖凝胶电泳上分辨。应用Ｐｒｉｍｅｒ５．０软件进行酶切位点的寻找，不同种群的ＰＣＲ扩增产
物经内切酶Ｓａｕ３ＡＩ酶切处理，识别位点为↓ＧＡＴＣ。ＷＷＲ和ＬＺＲ种群若发生ＧＣＴ→ＧＡＴ突变，就会产生一
个酶切位点↓ＧＡＴＣ，能被Ｓａｕ３ＡＩ酶切消化产生４９８和９９ｂｐ两条带，而ＳＳ种群由于是正常碱基，不存在相应的
识别位点，不能被内切酶消化，只有５９７ｂｐ的条带。酶切后产物在２％的琼脂糖凝胶上电泳，根据片段的位置、大
小即可鉴定出Ａ１２１５Ｄ突变存在与否。试验重复３次。
Ｆ１５３８Ｉ突变的检测：由于Ｆ１５３８Ｉ突变位点附近没有合适的酶切位点，根据创造酶切位点原理［１６１７］，将引物
３′端最后一个碱基错配引入一个酶切位点Ｔ↓ＧＡＴＣＡ，即将突变碱基前一个碱基Ｔ人为的更改为Ｇ，并在此处
设计引物（表１）。ＷＷＲ和ＬＺＲ种群若发生ＴＴＣ→ＡＴＣ突变，就会产生一个酶切位点Ｔ↓ＧＡＴＣＡ，能被ＢｃｌＩ
酶切消化产生２７７和２０ｂｐ两条带，而ＳＳ只有２９７ｂｐ一条带，酶切后在２％的琼脂糖凝胶上电泳，根据片段的大
５５１第２３卷第５期 草业学报２０１４年
小、位置即可鉴定出Ｆ１５３８Ｉ突变的存在与否。试验重复３次。
２ 结果与分析
２．１ 二斑叶螨ＶＧＳＣｓ基因片段扩增及测序
２．１．１ 突变位点区域片段扩增 二斑叶螨ＳＳ、ＷＷＲ和ＬＺＲ种群ＶＧＳＣｓ基因Ｌ１０２２、Ａ１２１５和Ｆ１５３８位点
片段扩增序列经琼脂糖凝胶电泳如图１，３种群扩增产物条带单一、明亮，均为目的片段，符合ＰＣＲ产物直接测序
的基本要求。
图１ 二斑叶螨不同种群突变位点扩增电泳图
犉犻犵．１ 犈犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狋狅犵狉犪犿狅犳犿狌狋犪狋犻狅狀狊犻狋犲狊犻狀犱犻犳犳犲狉犲狀狋狊狋狉犪犻狀狊狅犳犜．狌狉狋犻犮犪犲
Ｍ：ＤＮＡ标记；１～３：ＳＳ、ＷＷＲ和ＬＺＲ种群Ａ１２１５扩增片段；４～６：ＳＳ、ＷＷＲ和ＬＺＲ种群Ｆ１５３８扩增片段；７～９：ＳＳ、ＷＷＲ和ＬＺＲ种群
Ｆ０２２扩增片段。Ｍ：ＤＮＡｍａｋｅｒ；１－３：ＡｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｓｏｆＳＳ，ＷＷＲａｎｄＬＺＲｓｔｒａｉｎｓｎｅａｒＡ１２１５ｓｉｔｅ；４－６：ＡｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｓｏｆＳＳ，
ＷＷＲａｎｄＬＺＲｓｔｒａｉｎｓｎｅａｒＦ１５３８ｓｉｔｅ；７－９：ＡｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｓｏｆＳＳ，ＷＷＲａｎｄＬＺＲｓｔｒａｉｎｓｎｅａｒＦ１０２２ｓｉｔｅ．
２．１．２ ＶＧＳＣｓ基因ＰＣＲ产物测序结果 根据二斑叶螨ＳＳ、ＷＷＲ和ＬＺＲ种群Ａ１２１５和Ｆ１５３８位点部分基
因片段测序结果表明，与二斑叶螨ＳＳ种群ＶＧＳＣｓ基因核苷酸相比对，ＷＷＲ和ＬＺＲ种群均存在点突变，第一
个突变位点在结构域ⅡＳ６和ⅢＳ１连接处，ＧＣＴ（丙氨酸）被ＧＡＴ（天冬氨酸）取代，即存在Ａ１２１５Ｄ突变；第二个
突变发生在结构域ⅢＳ６处，ＴＴＣ（苯丙氨酸）被ＡＴＣ（异亮氨酸）取代，即存在Ｆ１５３８Ｉ突变，其中 ＷＷＲ种群中
Ｆ１５３８Ｉ为纯合突变，而ＬＺＲ中为杂合突变。然而，Ｌ１０２２Ｖ突变在二斑叶螨 ＷＷＲ和ＬＺＲ种群均未检测到。
２．２ 二斑叶螨ＶＧＳＣｓ基因突变ＰＣＲ－ＲＦＬＰ检测
２．２．１ Ａ１２１５Ｄ突变位点的ＰＣＲ－ＲＦＬＰ检测 采用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ的方法进行酶切鉴定二斑叶螨 ＷＷＲ和
ＬＺＲ种群Ａ１２１５Ｄ突变。通过Ｓａｕ３ＡＩ酶切处理ＳＳ、ＷＷＲ和ＬＺＲ种群后，发现 ＷＷＲ和ＬＺＲ种群均能被
内切酶切开，产生４９８和９９ｂｐ两条带，而ＳＳ种群只有一个５９７ｂｐ的条带（图２）。酶切前后根据条带的位置、数
目可以明显的区分突变种群，但由于９９ｂｐ的条带太暗凝胶成像显示不清晰，而４９８和５９７ｂｐ两条带区分明显，
并不影响突变位点的鉴定，说明二斑叶螨 ＷＷＲ和ＬＺＲ种群中都存在Ａ１２１５Ｄ氨基酸突变，而根据酶切结果
电泳图没有发现 ＷＷＲ和ＬＺＲ种群中存在杂合现象。
２．２．２ Ｆ１５３８Ｉ突变位点的检测 采用错配碱基引入酶切位点改进的ＰＣＲ－ＲＦＬＰ方法进行Ｆ１５３８Ｉ的突变检
测，结果表明酶切前后 ＷＷＲ和ＬＺＲ种群条带大小、位置没有发生变化，与ＳＳ种群没有明显差异（图３），即没
有被ＢｃｌＩ内切酶消化。为了排除是由于酶切前后电泳条带在２％浓度琼脂糖凝胶电泳条件下不易区分引起的，
通过增加琼脂糖凝胶电泳的浓度试验结果相同；最后通过ＰＣＲ产物测序发现，错配碱基的引入会导致下游片段
引物延伸时突变碱基处产生差异，从而不能形成ＢｃｌＩ识别的酶切位点，即ＰＣＲ－ＲＦＬＰ法不能有效地检测出
ＷＷＲ和ＬＺＲ种群的Ｆ１５３８Ｉ突变。
６５１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．５
图２ 二斑叶螨不同种群犃１２１５犇突变酶切电泳图
犉犻犵．２ 犈犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狋狅犵狉犪犿狉犲狊狌犾狋狊狅犳狋犺犲犃１２１５犇犿狌狋犪狋犻狅狀犻狀犱犻犳犳犲狉犲狀狋犜．狌狉狋犻犮犪犲狊狋狉犪犻狀狊狑犻狋犺犲狀狕狔犿犲犱犻犵犲狊狋犻狅狀
Ｍ：ＤＮＡ标记；１～３：ＳＳ、ＷＷＲ和ＬＺＲ种群酶切前片段；４～６：ＳＳ、ＷＷＲ和ＬＺＲ种群酶切后片段。Ｍ：ＤＮＡｍａｋｅｒ；１－３：ＢｒａｎｄｓｏｆＳＳ，
ＷＷＲａｎｄＬＺＲｓｔｒａｉｎｓｂｅｆｏｒｅｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎ；４－６：ＢｒａｎｄｓｏｆＳＳ，ＷＷＲａｎｄＬＺＲｓｔｒａｉｎｓａｆｔｅｒｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎ．
图３ 二斑叶螨不同种群犉１５３８犐突变酶切电泳图
犉犻犵．３ 犈犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狋狅犵狉犪犿狉犲狊狌犾狋狊狅犳狋犺犲犉１５３８犐犿狌狋犪狋犻狅狀犻狀犱犻犳犳犲狉犲狀狋犜．狌狉狋犻犮犪犲狊狋狉犪犻狀狊狑犻狋犺犲狀狕狔犿犲犱犻犵犲狊狋犻狅狀
Ｍ：ＤＮＡ标记；１～３：ＳＳ、ＷＷＲ和ＬＺＲ种群酶切前片段；４～６：ＳＳ、ＷＷＲ和ＬＺＲ种群酶切后片段。Ｍ：ＤＮＡ Ｍａｋｅｒ；１－３：ＢｒａｎｄｓｏｆＳＳ，
ＷＷＲａｎｄＬＺＲｓｔｒａｉｎｓｂｅｆｏｒｅｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎ；４－６：ＢｒａｎｄｓｏｆＳＳ，ＷＷＲａｎｄＬＺＲｓｔｒａｉｎｓａｆｔｅｒｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎ．
３ 讨论
目前，在二斑叶螨抗性种群ＶＧＳＣｓ基因上发现存在Ｌ１０２２Ｖ、Ａ１２１５Ｄ和Ｆ１５３８Ｉ共３个氨基酸突变。通过
功能分析表明Ｌ１０２２Ｖ和Ｆ１５３８Ｉ突变在二斑叶螨对拟除虫菊酯类农药的不敏感性起重要作用［６，１８］，并且Ｆ１５３８Ｉ
突变被认为是对拟除虫菊酯具有最高效的抗性位点之一［１９２０］，是家蝇钠通道ⅢＳ６螺旋处的芳香族氨基酸残基，
同时也是拟除虫菊酯的疏水性结合位点［２１２２］；而Ａ１２１５Ｄ突变的功能尚不明确，还需要进一步的研究。本研究发
现，田间采集的二斑叶螨 ＷＷＲ和ＬＺＲ种群对甲氰菊酯抗药性的产生与Ｆ１５３８Ｉ突变有关，Ｆ１５３８Ｉ突变是二斑
叶螨对甲氰菊酯产生高抗性的重要原因；这与前期本实验室研究室内饲养的二斑叶螨经甲氰菊酯抗性培育４５代
后，同样会产生Ｆ１５３８Ｉ突变的结果一致［２３］。说明田间和室内的二斑叶螨在甲氰菊酯药剂的胁迫作用下，其靶标
ＶＧＳＣｓ基因均会产生同样的突变，从而对其高抗性的产生起着重要作用。随着二斑叶螨全基因组的发布，突变
的检测将更有利于对其抗性分子机理以及抗药性检测的研究［２４］，其中与代谢相关的二斑叶螨水平基因转移［２５］
以及二斑叶螨对寄主植物的适应性与抗药性的关系［２６］最近已有报道。因此，从分子水平上检测拟除虫菊酯类农
药靶标ＶＧＳＣｓ突变，对相关的抗性机理研究具有重要意义。
通过比较两种突变检测方法，ＰＣＲ－ＲＦＬＰ法虽然较快速方便，不需要测序，但是由于酶切位点以及内切酶
７５１第２３卷第５期 草业学报２０１４年
价格的限制，并且只能在已知突变的情况下才能采用，这在一定程度上限制了该技术的使用，并且错配碱基创造
酶切位点的方法在碱基错配后，有时可能会导致下游１～２个碱基不能正常扩增配对，降低了酶切鉴定的敏感度，
本研究采用此方法则不能有效地检测出Ｆ１５３８Ｉ突变。相对于ＰＣＲ－ＲＦＬＰ法，通过ＰＣＲ产物正反双向直接测
序，可以检测出二斑叶螨突变位点Ａ１２１５Ｄ和Ｆ１５３８Ｉ，并能明确突变碱基类型，重复性更好，结果更准确，但操作
相对繁琐，测序较耗时；而其他方法如高通量融解曲线法［２７］等由于仪器昂贵，成本较高，也不适合一般实验室采
用。熊亮等［２８］通过比较ＰＣＲ产物直接测序法和高通量溶解曲线分析技术检测胶质瘤表皮生长因子受体（ｅｐｉ
ｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＥＧＦＲ）基因突变类型发现，这两种方法在检测ＥＧＦＲ外显子１９突变率具有较高
的一致性。因此，伴随着新一代高通量分子测序技术的不断进步和发展，测序周期将大大缩短，ＰＣＲ产物直接测
序法将更有利于害螨及昆虫抗药性的突变检测。
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ＹＡＮＧＳｈｕｎｙｉ１，ＹＵＥＸｉｕｌｉ１，ＷＡＮＧＪｉｎｊｕｎ２，ＳＨＥＮＨｕｉｍｉｎ１，ＧＵＯＪｉｎｍｅｉ１，
ＳＨＥＮＹｉｆａｎ１，ＺＨＯＵＸｉｎｇｌｏｎｇ１
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Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＣｏｌｅｇｅｏｆＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，ＳｏｕｔｈｗｅｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
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ｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ （ＰＣＲ－ＲＦＬＰ），ｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｓｅＶＧＳＣｇｅｎｅｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎｔｗｏｆｉｅｌｄｓｔｒａｉｎｓ（ＷＷＲ
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ｍｕｔａｔｉｏｎｓｅｘｉｓｔｅｄｉｎｔｈｅＶＧＳＣｇｅｎｅｓｏｆｂｏｔｈｔｈｅＷＷＲａｎｄＬＺＲｓｔｒａｉｎｓ，ｂｕｔｔｈａｔｔｈｅＦ１０２２Ｖｍｕｔａｔｉｏｎｗａｓ
ｎｏｔｄｅｔｅｃｔｅｄ．ＴｈｅＡ１２１５ＤｍｕｔａｔｉｏｎｗａｓｌｏｃａｔｅｄｂｅｔｗｅｅｎｄｏｍａｉｎｓＩＩＳ６ａｎｄＩＩＩＳ１ｏｆｔｈｅＶＧＳＣｓ，ｗｈｉｌｅｔｈｅ
Ｆ１５３８ＩｍｕｔａｔｉｏｎｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｉｎｄｏｍａｉｎＩＩＩＳ６．ＴｈｅＰＣＲ－ＲＦＬＰｍｅｔｈｏｄ，ｈｏｗｅｖｅｒ，ｐｒｏｖｅｄａｂｌｅｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙ
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ＰＣＲ－ＲＦＬＰ
欢迎订阅２０１５年《中国草地学报》
《中国草地学报》是由中国农业科学院草原研究所和中国草学会共同主办的国家级草学学术期刊，其宗旨是：
立足全国，面向世界，积极宣传和报道中国草学研究领域的新理论与重要成果，介绍新进展与发展动态，内容以草
学基础理论研究和应用理论研究为主，兼纳高新技术研究和直接产生生态效益、经济效益的开发性研究，主要包
括草原学、牧草学、草地学和草坪学等学科领域内有关草地与牧草资源、草地经营管理与改良利用、牧草遗传育种
与引种栽培、牧草生理生化、草地建设与生态保护、草地生产与饲草料加工调制、草坪绿地、草业经济与可持续发
展战略等。
本刊为中国草业领域创办最早的科技期刊，自１９７９年创刊以来先后荣获内蒙古优秀期刊或优秀科技期刊奖
３次，获全国优秀农业期刊奖３次，获中国农业科学院优秀科技期刊奖和华北地区优秀期刊奖各１次，获《ＣＡＪ－
ＣＤ规范》执行优秀奖１次。现为中国草学界影响较大的期刊之一，是全国中文核心期刊、中国科技核心期刊。
２００８年影响因子已达１．０００以上，在２０１１年公布的１９９８种中国科技核心期刊中综合排名为３７０位，其中影响因
子排第９４位；在２０１３年１１月公布的中国科技期刊ＣＳＣＤ影响因子３００名排行表中，本刊居于第１００位。双月
刊，大１６开Ａ４版本，１２０页，国内外公开发行，每册定价１５．００元，全年共９０．００元。国内统一刊号ＣＮ１５１３４４／
Ｓ，国内邮发代号１６３２，全国各地邮局（所）均可订阅，错过订期可直接向本刊编辑部补订。
地址：呼和浩特市乌兰察布东街１２０号草原所内；邮编：０１００１０；电子信箱：ｚｇｃｄｘｂ＠１２６．ｃｏｍ；
电话：０４７１４９２８３６１（办公室） ０４７１４９２６８８０（总编室）
０６１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．５