全 文 ：书林业科学研究 ２０１６，２９（４）：４７１ ４７９
ＦｏｒｅｓｔＲｅｓｅａｒｃｈ
文章编号：１００１１４９８（２０１６）０４０４７１０９
杜鹃红山茶 ＣａＡＰＸ基因的克隆、表达及功能分析
王江英１，２，范正琪１，殷恒福１，李辛雷１，吴 斌１，李纪元１
（１．中国林业科学研究院亚热带林业研究所，浙江省林木育种技术研究重点实验室，浙江 杭州 ３１１４００；
２．江苏省连云港市农业科学院花卉研究中心，江苏 连云港 ２２２００６）
收稿日期：２０１５０５１２
基金项目：国家‘十二·五’科技支撑计划课题（２０１２ＢＡＤ０１Ｂ０７０３）；浙江省花卉新品种选育重大科技专项（２０１２Ｃ１２９０９６）；浙江省与
中国林业科学研究院省院合作林业科技项目（２０１２ＳＹ０２）；国家农业科技成果转化资金项目（ＧＢ２０１３ＧＢ２４３２０６０６）；国家林业局引进国际先
进林业科学技术项目（９４８项目）（２０１４４１６）
作者简介：王江英（１９８４—），女，江苏泰州人，博士研究生，主要从事花卉分子育种研究．
通讯作者：李纪元（１９６４—），男，研究员，博士生导师，主要从事园林植物与观赏园艺研究．Ｅｍａｉｌ：ｊｉｙｕａｎ＿ｌｉ＠１２６．ｃｏｍ
摘要：［目的］利用分子生物学技术探讨杜鹃红山茶ＣａＡＰＸ基因的表达模式及在模式植物烟草中所起的抗寒、耐热
作用，为今后山茶花抗逆育种奠定基础。［方法］根据山茶花同源序列设计特异性引物，利用同源克隆和３’，５’
ＲＡＣＥ技术，从杜鹃红山茶嫩叶组织中克隆出抗坏血酸过氧化物酶（ＡＰＸ），命名为 ＣａＡＰＸ，基因全长１０９７ｂｐ，开放
阅读框７５３ｂｐ，编码２５０个氨基酸。实时荧光定量ＰＣＲ对杜鹃红山茶７种组织和温度胁迫下该基因的表达模式进
行分析。［结果］表明：ＣａＡＰＸ基因在杜鹃红山茶７种组织中均得到表达，但表达水平不一，表达量由高到低依次
为：未成熟果实＞嫩叶＞花苞 ＞叶芽 ＞种胚 ＞花瓣 ＞花芽，其中，未成熟果实中的表达量是其它组织的２．６８
１１４４倍；温度胁迫处理８ｈ后该基因呈上调表达，ＣａＡＰＸ基因表达量分别是０ｈ的３．４９和２．６７倍。ＣａＡＰＸ基因转
化烟草分析表明，过量表达 ＣａＡＰＸ基因后，ＡＰＸ活性提高了２．５８ ４．０９倍，抗坏血酸（ＡｓＡ）含量提高了２．６７
３５６倍，并且转基因烟草植株的抗寒、耐热能力也获得提高。［结论］通过过量表达 ＣａＡＰＸ基因能够提高烟草植株
的抗寒、耐热性，为山茶花抗逆育种提供了科学依据。
关键词：杜鹃红山茶；基因克隆；温度胁迫；表达分析；转基因烟草
中图分类号：Ｓ７１８４６ 文献标识码：Ａ
Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＡｎａｌｙｓｉｓｏｆ
ＣａＡＰＸＧｅｎｅｆｒｏｍＣａｍｅｌｉａａｚａｌｅａ
ＷＡＮＧＪｉａｎｇｙｉｎｇ１，２，ＦＡＮＺｈｅｎｇｑｉ１，ＹＩＮＨｅｎｇｆｕ１，ＬＩＸｉｎｌｅｉ１，ＷＵＢｉｎ１，ＬＩＪｉｙｕａｎ１
（１．ＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＳｕｂｔｒｏｐｉｃａｌＦｏｒｅｓｔｒｙ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ，ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＴｒｅｅＢｒｅｅｄｉｎｇｏｆＺｈｅｊｉａｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ
３１１４００，Ｚｈｅｊｉａｎｇ，Ｃｈｉｎａ；２．ＦｌｏｗｅｒＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒｏｆＬｉａｎｙｕｎｇａｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｉａｎｙｕｎｇａｎｇ ２２２００６，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：［Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ］ＵｓｉｎｇｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｅｒｎｓｏｆＣａＡＰＸｇｅｎｅｉｎ
Ｃａｍｅｌｉａａｚａｌｅａ，ａｎｄｔｏｃａｒｙｏｕｔｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆＣａＡＰＸｉｎｔｏｂａｃｃｏｕｎｄｅｒｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｔｒｅｓｓ．［Ｍｅｔｈｏｄ］
ＯｎｔｈｅｂａｓｉｓｏｆｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＣ．ｊａｐｏｎｉｃａ，ａｎａｓｃｏｒｂａｔｅｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＡＰＸ）ｇｅｎｅｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅ
ｔｅｎｄｅｒｌｅａｆｉｎＣ．ａｚａｌｅａｂｙｔｈｅ３’，５’ＲＡＣＥｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｎａｍｅｄＣａＡＰＸ．ＴｈｅｆｕｌｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡｏｆＣａＡＰＸｉｓ１０９７
ｂｐ，ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇａ７５３ｂｐＯＲＦｗｈｉｃｈｅｎｃｏｄｅｓ２５０ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ．［Ｒｅｓｕｌｔ］ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲａｎａｌｙｓｉｓｉｎｄｉ
ｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅＣａＡＰＸｗａｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｄｉｆｅｒｅｎｔｌｙｉｎａｌｅｘａｍｉｎｅｄｃａｍｅｌｉａｔｉｓｓｕｅｓ，ａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｉｎｏｒｄｅｒ
ｗｅｒｅｉｍｍａｔｕｒｅｇｒｅｅｎｆｒｕｉｔ，ｔｅｎｄｅｒｌｅａｆ，ｆｌｏｗｅｒ，ｌｅａｆｂｕｄ，ｓｅｅｄｅｍｂｒｙｏ，ｐｅｔａｌａｎｄｆｌｏｗｅｒｂｕｄ．Ｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｅｘｐｒｅｓ
ｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＣａＡＰＸｗａｓｉｎｉｍｍａｔｕｒｅｇｒｅｅｎｆｒｕｉｔ，ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙｒａｎｇｉｎｇ２．６８ｔｏ１１．４４ｔｉｍｅｓａｓｈｉｇｈａｓｔｈａｔｏｆｔｈｅ
ｏｔｈｅｒｓｉｘｇｒｏｕｐｓ．Ｉｔｗａｓａｌｓｏｆｏｕｎｄｔｈａｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｗａｓｎｏｔａｂｌｙｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄｉｎｌｅａｖｅｓｏｆｃａｍｅｌｉａｐｌａｎｔｓ
ｓｕｂｊｅｃｔｅｄｔｏａｂｎｏｒｍａｌｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｔｈｅＡＰＸａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙ１５８％ －
林 业 科 学 研 究 第２９卷
３０９％，ａｎｄｔｈｅＡｓＡｃｏｎｔｅｎｔｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙ１６７％ －２５６％ ａｓｈｉｇｈｅｒａｓｗｉｌｄｔｙｐｅｐｌａｎｔｓ．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅｏｖｅｒｅｘ
ｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣａＡＰＸｅｎｈａｎｃｅｄｃｏｌｄａｎｄｈｅａｔｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｕｎｄｅｒｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｔｒｅｓｓｅｓ．
［Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ］ＴｈｅｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣａＡＰＸｆｒｏｍＣ．ａｚａｌｅａｃｏｕｌｄｅｎｈａｎｃｅｔｈｅｃｏｌｄａｎｄｈｅａｔｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎ
ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃｏ，ａｎｄｗｈｉｃｈａｌｓｏｐｒｏｖｉｄｅａｂａｓｉｓｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｒｅｅｄｉｎｇｏｆｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｄｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣａｍｅｌｉａｓｉｎｔｈｅ
ｆｕｔｕｒｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｃａｍｅｌｉａａｚａｌｅａ；ｇｅｎｅｃｌｏｎｅ；ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｔｒｅｓｓ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ；ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃｏ
山茶属（ＣａｍｅｌｉａＬｉｎｎ．）植物作为我国亚热
带常绿阔叶林固有的特征植物种类，在稳定的群
落结构中属于森林中下层小乔木或灌木，较喜欢
温暖湿润的气候，因此，其抗寒、耐热性较差［１］。
山茶花（Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａＬｉｎｎ．）绝大部分品种是在秋
冬及春季开花，０℃以下的长期低温或 ３５℃以上
的长期高温会对茶花造成冻害或灼伤，甚至导致
落花落蕾或花芽无法分化［２］。通过分子生物学
技术将具有抗寒、耐热功能的外源基因导入山茶
花中，成为山茶花抗逆育种的主要发展趋势
之一。
温度胁迫会引起植物细胞内活化氧（ＲＯＳ）等
有毒物质的积累，对植物的代谢、细胞稳态以及主
要的生理耦合过程产生不利影响，严重时甚至导致
细胞死亡［３－４］。植物为了抵御这种胁迫，自身会启
动抗氧化防御机制，抗坏血酸（ＡｓＡ）－谷胱甘肽
（ＧＳＨ）循环对于清除 ＲＯＳ具有极其重要的作
用［５－６］，而抗坏血酸过氧化物酶（ＡＰＸ）在此循环过
程中是清除 Ｈ２Ｏ２的主要酶系，能够利用 ＡｓＡ作为
电子供体将 Ｈ２Ｏ２转化为 Ｈ２Ｏ
［７－９］。目前，已从多
种植物如烟草（ＮｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍＬ．）、拟南芥（Ａｒ
ａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＬ．）、水稻（ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＬ．）、土豆
（ＳｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒｏｓｕｍＬ．）及茶树（Ｃ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｌ）．
Ｏ．Ｋｔｚｅ．）中相继克隆出 ＡＰＸ基因，并且 ＡＰＸ基因
过量表达有助于提高植株抵抗冷冻及高温伤害的
能力［１０－１２］。
杜鹃红山茶（Ｃ．ａｚａｌｅａＷｅｉ）是山茶花的一个珍
稀品种，也是珍稀濒危植物，最早发现于中国广东省
阳春市鹅凰嶂自然保护区，其具有抗逆性强、四季开
花、花大色艳等特点，是培育茶花新品种非常珍贵的
种质资源［１３］。本研究以杜鹃红山茶为材料，分离获
得ＡＰＸ基因，通过实时荧光定量 ＰＣＲ技术，分析
ＡＰＸ基因在杜鹃红山茶不同组织及温度胁迫下的表
达模式，以及温度胁迫下过量表达 ＡＰＸ基因的模式
植物烟草的抗寒、耐热能力，为山茶花抗寒、耐热性
分子育种提供研究基础。
１ 材料与方法
１．１ 实验材料
杜鹃红山茶种植于中国林科院亚热带林业研
究所观赏园艺研究组苗圃，野生型烟草（Ｎ．ｔａｂａ
ｃｕｍＬ．ｃｖ．ＳＲ１）为本实验室培育。采集杜鹃红
山茶不同组织，包括嫩叶、叶芽、花芽、花、花瓣、
未成熟果实及种胚。杜鹃红山茶胁迫处理方法
为：将生长状态相似及状态良好的杜鹃红山茶植
株置于４℃或３８℃的光照培养箱中 １２００Ｌｘ（１６
ｈ光照／８ｈ黑暗）分别胁迫处理 ０、２、４、８、１２ｈ，
采集各时间段的第４功能叶。所有材料采集后锡
箔纸包裹立即投入液氮速冻，置于 －８０℃冰箱保
存备用。引物合成及测序由华大基因公司（上
海）完成。
１．２ ＣａＡＰＸ基因的克隆
按照 ＥＡＳＹＳｐｉｎＰｌｕｓ植物 ＲＮＡ快速提取试剂
盒说明书提取总 ＲＮＡ，经反转录获得 ｃＤＮＡ。根据
ＧｅｎＢａｎｋ公布的 ＣａＡＰＸ同源基因序列，设计一对
特异引物 Ｆ１、Ｒ１（表１），进行保守区片段扩增，再
按照 ＴａＫａＲａ３’ＦｕｌＲＡＣＥＫｉｔ、５’ＦｕｌＲＡＣＥＫｉｔ
说明书进行目的片段３’和５’末端的扩增，其中３’
末端扩增所用引物为 Ｆ２、Ｆ３（表１），５’末端扩增所
用引物为Ｒ２、Ｒ３（表１）。序列拼接后，设计全长引
物 Ｆ４、Ｒ４（表 １），进行目的基因 ＣＤＳ编码区的
扩增。
１．３ 生物信息学分析
ＤＮＡＭＡＮ软件序列拼接后在ＮＣＢＩ上进行Ｂｌａｓｔ
同源性比对，选择同源性较高的 ９种植物，运用
ＤＮＡＭＡＮ和 ＭＥＧＡ５．０５软件进行氨基酸多序列比
对分析和系统进化树分析。利用 ＰｒｏｔＰａｒａｍ软件
（ｈｔｐ：／／ｃｎ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）分析蛋白质的理化特性，
ＨＮＮ软件（ｈｔｐ：／／ｎｐｓａｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／）进行蛋白二级
结构分析，采用 ｈｔｐ：／／ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ提供
的Ｓｗｉｄｄｍｏｄｅｌ同源建模方法预测蛋白质相应的三
级结构。
２７４
第４期 王江英，等：杜鹃红山茶ＣａＡＰＸ基因的克隆、表达及功能分析
表１ 引物序列及用途
编号 序列（５’－３’） 引物用途
Ｆ１ ＧＣＡＴＧＧＣＡＣＴＣＴＧＣＴＧＧＴＡＣ
Ｒ１ ＣＡＴＣＣＧＣＡＧＣＡＴＡＴＴＴＣＴＣＡＡＣ
用于保守区片段扩增
Ｆ２ ＧＴＴＣＡＧＡＧＡＧＣＴＴＣＡＴＧＴＧ ３’ＲＡＣＥＯｕｔｅｒ
Ｆ３ ＣＡＴＣＣＧＣＡＧＣＡＴＡＴＴＴＣＴＣＡＡＣ ３’ＲＡＣＥＩｎｎｅｒ
Ｒ２ ＧＣＡＴＧＧＣＡＣＴＣＴＧＣＴＧＧＴＡＣ ５’ＲＡＣＥＯｕｔｅｒ
Ｒ３ ＡＣＴＧＧＡＧＧＡＣＣＴＧＡＴＧＴＴＣＣ ５’ＲＡＣＥＩｎｎｅｒ
Ｆ４ ＡＴＧＧＧＧＡＡＧＴＧＣＴＡＴＣＣＡＡＣＴＧ
Ｒ４ ＴＴＡＧＧＣＴＴＣＡＧＣＡＡＡＣＣＣＣＡＧ
ＣａＡＰＸ基因ＯＲＦ扩增
Ｆ５ ＴＡＧＧＡＡＣＡＧＧＡＣＣＴＣＡＴＴＧＣＧ
Ｒ５ ＡＡＧＧＴＧＴＣＧＣＣＴＡＴＧＴＴＧＡＣＧＡＣ
杜鹃红山茶实时荧光定量ＰＣＲ分析；转 ＣａＡＰＸ基因烟草植株实时荧
光定量ＰＣＲ
Ｆ６
ＧＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧＧＧＧＡＡＧＴＧＣＴＡＴＣ
ＸｂａＩ
Ｒ６
ＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＧＣＴＴＣＡＧＣＡＡＡＣ
ＢａｍＨＩ
植物表达载体构建；转ＣａＡＰＸ基因烟草阳性植株鉴定
１８ＳＦ ＧＡＣＴＣＡＡＣＡＣＧＧＧＧＡＡＡＣＴＴＡＣＣ
１８ＳＲ ＣＡＧＡＣＡＡＡＴＣＧＣＴＣＣＡＣＣＡＡＣ
山茶１８ＳＲＮＡ内参基因片段扩增
ＥＦ１ａＦ ＣＧＧＴＴＡＡＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＣＧＴ
ＥＦ１ａＲ ＧＡＡＣＴＧＧＡＧＣＡＴＡＴＣＣＡＴＴＧＣＣ
烟草ＥＦ１ａ内参基因片段扩增
注：表中下划线代表酶切位点。
１．４ ＣａＡＰＸ基因在不同组织及温度胁迫下的表达
分析
根据引物设计要点，在靠近目的基因 ｃＤＮＡ全
长序列３’端设计一对引物Ｆ５、Ｒ５（表１）。利用实时
荧光定量ＰＣＲ方法，检测ＣａＡＰＸ基因在杜鹃红山茶
叶、叶芽、花芽、花、花瓣、未成熟果实及种胚中的表
达情况及其在４、３８℃胁迫诱导不同时段后的表达
情况。以山茶１８Ｓ为内标基因，扩增引物为１８ＳＦ、
１８ＳＲ（表１），与目的基因同机分管扩增。生物学试
验重复３次。运用２－△△Ｃｔ计算方法求得不同组织及
温度胁迫下 ＣａＡＰＸ基因表达量，再用 Ｅｘｃｅｌ２００７、
ＳｉｇｍａＰｌｏｔ１１．０软件对数据进行统计分析并绘图。
１．５ 植物表达载体的构建
设计一对引物 Ｆ６、Ｒ６进行载体构建。对含有
目的基因ＣａＡＰＸ的 ｐＧＥＭＴ４重组质粒以及植物表
达载体ｐＢＩ１２１质粒用ＸｂａＩ和 ＢａｍＨＩ限制性内切
酶进行双酶切，将酶切回收纯化后的 ＣａＡＰＸ基因片
段分别和载体用Ｔ４连接酶１６℃过夜连接，转化大肠
杆菌感受态ＤＨ５α。
１．６ 农杆菌介导转化烟草及ＲＴＰＣＲ检测
采用农杆菌介导的‘叶盘法’［１４］进行烟草转化。
提取待测转基因烟草总 ＲＮＡ，反转录获得 ｃＤＮＡ，利
用引物Ｆ６、Ｒ６（表１）进行ＰＣＲ检测。
１．７ 转基因烟草不同株系间荧光定量 ＲＴＰＣＲ
分析
分别采集ＣａＡＰＸ基因转化烟草阳性株系 ＡＬ１、
ＡＬ２、ＡＬ３的第 ４功能叶，提取总 ＲＮＡ。利用引物
Ｆ５、Ｒ５进行实时荧光定量 ＰＣＲ，检测 ＣａＡＰＸ基因在
转基因烟草叶片中的表达情况，以烟草 ＥＦ１ａ基因
作为内标基因，扩增引物为ＥＦ１ａＦ、ＥＦ１ａＲ（表１）。
野生型烟草作对照，生物学试验重复３次。具体实
验步骤同１．４。
１．８ 转基因烟草ＡＰＸ活性及ＡｓＡ含量测定
以ＣａＡＰＸ转化烟草阳性株系 ＡＬ１、ＡＬ２、ＡＬ３为
材料，采集第４功能叶，参照 Ｎａｋａｎｏ等［１５］的方法测
定ＡＰＸ酶活性，参照 Ｋａｍｐｆｅｎｋｅｌ等［１６］的方法测定
ＡｓＡ含量。野生型烟草作对照，生物学试验重复
３次。
１．９ 转基因植株抗寒、耐热性检测
将转ＣａＡＰＸ基因烟草阳性株系 ＡＬ１、ＡＬ２、ＡＬ３
以及野生型植株各３株置于４℃或３８℃光照培养箱
中１２００Ｌｘ（１６ｈ光照／８ｈ黑暗）胁迫处理，期间每
隔１５ｍｉｎ观察１次植株状态及叶片萎焉情况。另
外，测定４℃或３８℃处理８ｈ后 ＡＬ１、ＡＬ２、ＡＬ３和野
生型植株中的 Ｈ２Ｏ２含量，方法参照 Ｓａｉｒａｍ等
［１７］所
用的ＫＩ法。生物学试验重复３次。
２ 结果与分析
２．１ 杜鹃红山茶ＣａＡＰＸ基因全长ｃＤＮＡ序列克隆
以杜鹃红山茶嫩叶 ＲＮＡ反转录的 ｃＤＮＡ为模
板，保守区片段扩增，经测序获得长为５６６ｂｐ的序
列（图１Ａ），ＮＣＢＩＢｌａｓｔ同源序列比对显示：与茶树
３７４
林 业 科 学 研 究 第２９卷
碱基同源性高达 ９５％，确认此序列为杜鹃红山茶
ＣａＡＰＸ基因一段序列。利用５’ＲＡＣＥ和３’ＲＡＣＥ
技术，从杜鹃红山茶嫩叶的总 ＲＮＡ中分别获得
ＣａＡＰＸ基因ｃＤＮＡ的５’和３’端的序列。测序结果
表明：５’ＲＡＣＥ产物长度为 ７６５ｂｐ（图 １Ｂ），３’
ＲＡＣＥ产物长度为７９７ｂｐ（图１Ｃ）。利用ＯＲＦＦｉｎｄ
ｅｒ分析ＣａＡＰＸ基因的ＣＤＳ区为７５３ｂｐ（图１Ｄ）。
Ｍ：ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；１：保守片段；２：５’ＲＡＣＥ产物；３：３’ＲＡＣＥ产物；４：ＣＤＳ产物
图１ 杜鹃红山茶ＣａＡＰＸ基因克隆
２．２ 杜鹃红山茶ＣａＡＰＸ基因生物信息学分析
２．２．１ ＣａＡＰＸ编码的氨基酸序列与其它物种的
同源性分析 利用 ＤＮＡＭＡＮ软件对杜鹃红山茶及
同源性较高的９个物种（如茶树、烟草等）的 ＡＰＸ
氨基酸序列进行多序列比对，结果表明：１０种植物
的氨基酸数均在 ２５０个左右，且具有很高的同源
性，大部分区域均比较保守，与茶树的同源性高达
９６．８０％，与其它物种的同源性也都超过９０％（图
２）。系统发育树分析也表明：杜鹃红山茶 ＣａＡＰＸ
基因所编码的蛋白序列与茶树亲缘关系十分紧密
（图３）。
２．２．２ ＣａＡＰＸ预测编码蛋白的理化特性及结构功
能分析 利用ＰｒｏｔＰａｒａｍ在线分析蛋白质理化特性，
发现杜鹃红山茶ＣａＡＰＸ基因编码２５０个氨基酸，等
电点 ｐＩ为５．６２，不稳定系数为３８．９３，属于稳定性
蛋白。
利用ＨＮＮ软件对杜鹃红山茶 ＣａＡＰＸ基因编码
的蛋白质二级结构分析发现，α螺旋占４０．８０％，β
转角占１０．００％，无规则卷曲占３７．２０％，延伸链占
１２．００％；与茶树等同源性较高的植物相比发现，蛋
白二级结构都以 α螺旋为主，其次为无规则卷曲，
延伸链及β转角等区域所占比例较少。
Ｃ．ａｚａｌｅａ：杜鹃红山茶（ＫＰ６３５２６７）；Ｃ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ：茶树（ＡＢＤ９７２５９．１）；Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ：烟草（ＡＡＡ８６６８９．１）；Ｍａｌｕｓｄｏｍｅｓｔｉｃａ：
苹果（ＡＢＰ８７７９２．１）；Ｔａｍａｒｉｘｈｉｓｐｉｄａ：刚毛柽柳（ＡＣＮ６０１５９．１）；Ｚｉｚｉｐｈｕｓｊｕｊｕｂａ：金丝小枣（ＡＡＺ７９３５７．１）；Ｇｏｓｙｐｉｕｍｈｉｒｓｕｔｕｍ：
棉花（ＡＡＣ０８５７６．１）；Ｖｉｔｉｓｐｓｅｕｄｏｒｅｔｉｃｕｌａｔａ：华东葡萄（ＡＢＲ１８６０７．１）；Ｚａｎｔｅｄｅｓｃｈｉａａｅｈｔｉｏｐｉｃ：马蹄莲（ＢＡＭ２８７５５．１）；Ｈｅｖｅａｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ：
橡胶树（ＡＡＯ１４１１８．１）。图３同。
图２ 杜鹃红山茶ＣａＡＰＸ与其它植物ＡＰＸ氨基酸序列的多系列比对
Ｓｗｉｄｄｍｏｄｅｌ同源建模预测杜鹃红山茶 ＣａＡＰＸ
基因编码的蛋白三级结构（图４）与其它植物比较发
现：蛋白三级结构均以 α螺旋和无规则卷曲作为主
要骨架，这与预测的二级结构分析结果基本一致。
利用 ＮＣＢＩＣｏｎｓｅｒｖｅｄＤｏｍａｉｎＳｅａｒｃｈ进行保守域在
线分析，结合其它物种中同源 ＡＰＸ基因分析结果，
发现ＣａＡＰＸ基因编码的蛋白存在植物 ＰＯＤ结构域
（图５），并且包括ＸＡＮＸ、ＬＰＤＡＸ及（Ｅ）ＲＳＧＦ／Ｗ等
保守片段（图 ２中方框区域），这些片段是与底物
ＡｓＡ反应的关键。
４７４
第４期 王江英，等：杜鹃红山茶ＣａＡＰＸ基因的克隆、表达及功能分析
图３ 杜鹃红山茶ＣａＡＰＸ与其它植物ＡＰＸ系统发育树分析
２．３ ＣａＡＰＸ基因在杜鹃红山茶不同组织器官中的
表达分析
ＣａＡＰＸ基因在杜鹃红山茶７种不同组织器官中
的表达情况见图６，ＣａＡＰＸ基因在７个组织器官中
均有转录表达，但所表达的 ＲＮＡ水平不同，表达量
由高到低依次为：未成熟果实 ＞嫩叶 ＞花苞 ＞叶芽
＞种胚＞花瓣 ＞花芽。差异显著性分析发现，未成
熟果实中的表达量是其它组织的２．６８ １１．４４倍，
其中，约为嫩叶的２．６８倍，花瓣的４．９６倍，花芽的
１１．４４倍（Ｐ＜０．０５）。 图４ 杜鹃红山茶ＣａＡＰＸ基因推导的蛋白三级结构
图５ 杜鹃红山茶ＣａＡＰＸ基因推导的蛋白保守域
２．４ ＣａＡＰＸ基因在低温、高温处理下的表达分析
生长状态良好及相似的杜鹃红山茶在４℃低温
胁迫２、４、８ｈ后，ＣａＡＰＸ基因基本呈上调表达，与
０ｈ的表达量差异显著（Ｐ＜０．０５），并且相互之间也
差异显著（Ｐ＜０．０５），表达量分别为 ０ｈ的３．１３、
２．８０、３．４９倍，但当４℃低温胁迫达１２ｈ，表达量又
下降至０ｈ表达量水平（图７Ａ）。３８℃高温胁迫下，
ＣａＡＰＸ的表达趋势与４℃下的表达趋势基本相似，
差异显著性分析发现０、２、４、８、１２ｈ的表达量相互
之间也均差异显著（Ｐ＜０．０５）；在胁迫 ２、４、８ｈ
后，表达量不断上升，ＣａＡＰＸ基因表达量分别约为
０ｈ表达量的 １．７３、２．０５、２．６７倍，之后表达量迅
速下降，到１２ｈ时，表达量只有０ｈ表达量的１４６
倍（图７Ｂ）。由此推测，ＣａＡＰＸ基因在４℃低温及
３８℃高温胁迫下都达到较高的表达水平，说明
图６ ＣａＡＰＸ基因组织特异性表达分析
ＣａＡＰＸ基因能够被极端温度所诱导，以保护植株
不受伤害，但８ｈ之后，表达量急速下降，有可能与
植物组织细胞不断受到损伤有关。
５７４
林 业 科 学 研 究 第２９卷
图７ 杜鹃红山茶ＣａＡＰＸ基因在不同温度处理下的表达分析
２．５ 植物表达载体构建
ｐＢＩ１２１ＣａＡＰＸ的重组区域见图 ８，用 ＸｂａⅠ和
ＢａｍＨⅠ分别双酶切 ｐＢＩ１２１和 ｐＧＥＭＴＣａＡＰＸ，回
收ｐＢＩ１２１载体大片段和 ｐＧＥＭＴＣａＡＰＸ目的小片
段（图９Ａ），Ｔ４ＤＮＡ连接酶１６℃过夜连接大小片段。
ＸｂａⅠ和ＢａｍＨⅠ双酶切鉴定（图９Ｂ），ＣａＡＰＸ成功
插入表达载体 ｐＢＩ１２１，将重组质粒分别命名为
ｐＢＩ１２１ＣａＡＰＸ。
图８ ｐＢＩ１２１ＣａＡＰＸ重组区域结构示意图
Ｍ：ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；１：ｐＧＥＭＴＣａＡＰＸ双酶切产物；２：ｐＢＩ１２１ＣａＡＰＸ双酶切产物
图９ 植物表达载体ｐＢＩ１２１ＣａＡＰＸ的酶切验证
２．６ 转基因烟草阳性株系的鉴定
ＣａＡＰＸ基因转化烟草 ＲＴＰＣＲ检测结果显示：
转基因阳性植株 ＡＬ１、ＡＬ２、ＡＬ３能够扩增出与目的
基因大小一致的条带，对照则没有此条带（图１０Ａ）。
在转基因烟草 ＲＴＰＣＲ检测为阳性植株的基础上，
再次对相应的阳性植株进行了 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定，
结果见图１０Ｂ。转ＣａＡＰＸ基因 ＰＣＲ已鉴定为阳性
株系ＡＬ１、ＡＬ２、ＡＬ３，经 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交后都显示单一
条带，而非转基因植株杂交后无条带出现，结果证明
ＣａＡＰＸ基因成功转入烟草基因组中。
２．７ 转基因烟草植株 ＡＰＸ活性及 ＡｓＡ含量的
测定
由图１１Ａ可看出：过量表达ＣａＡＰＸ的转基因烟
草植株叶片中的 ＡＰＸ活性较野生型植株显著提高
（Ｐ＜０．０５），其中，ＡＬ２的 ＡＰＸ活性提高最多，约为
野生型植株的４０９倍，ＡＬ１和ＡＬ３分别约为野生型
植株的３．０５、２．５８倍，因此，过量表达 ＣａＡＰＸ可以
提高ＡＰＸ活性。
由图１１Ｂ可看出：过量表达ＣａＡＰＸ的转基因烟
草植株在提高ＡＰＸ活性的同时，体内ＡｓＡ含量也显
６７４
第４期 王江英，等：杜鹃红山茶ＣａＡＰＸ基因的克隆、表达及功能分析
Ｍ１：ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；Ｍ２：λＨｉｎｄⅢ 分子量标准；＋：ｐＢＩ１２１ＣａＡＰＸ质粒；：双蒸水。
ＡＬ１、ＡＬ２、ＡＬ３：３个转ＣａＡＰＸ基因阳性株系；ＷＴ：野生型植株。下同
图１０ 转ＣａＡＰＸ基因烟草植株ＲＴＰＣＲ及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ检测
图１１ 野生型（ＷＴ）和转ＣａＡＰＸ基因烟草植株ＡＰＸ活性和ＡｓＡ含量
著增加（Ｐ＜０．０５），转基因植株叶片中 ＡｓＡ含量约
为野生型植株的２．６７ ３．５６倍，其中，ＡＬ２的 ＡｓＡ
含量提高最多，达３．５６倍。
２．８ 过量表达ＣａＡＰＸ基因提高烟草植株的抗寒和
耐热性
４℃低温胁迫处理８ｈ后，野生型植株开始出现
萎焉，而转基因烟草植株基本生长良好，只有近地几
片叶子出现轻度萎焉状态（图１２Ａ）。Ｈ２Ｏ２含量测
定结果（图１３Ａ）显示：４℃低温胁迫处理８ｈ后，转
基因植株 ＡＬ１、ＡＬ２、ＡＬ３中的 Ｈ２Ｏ２含量显著低于
野生型植株（Ｐ＜０．０５），约为其０．５１ ０．６２倍，平
均０．５７倍。
３８℃高温胁迫处理８ｈ后，野生型植株出现严
重萎焉状态，转基因烟草植株状态良好，叶片几乎无
萎焉（图１２Ｂ）。Ｈ２Ｏ２含量测定结果（图１３Ｂ）显示：
３８℃高温胁迫处理 ８ｈ后，转基因植株 ＡＬ１、ＡＬ２、
ＡＬ３中的 Ｈ２Ｏ２含量也显著低于野生型植株（Ｐ＜
０．０５），约为其０．３５ ０．４１倍，平均０．３８倍。
由此说明，过量表达 ＣａＡＰＸ基因降低烟草植株
在温度胁迫下体内的 Ｈ２Ｏ２的含量，因此，在一定程
度上提高了植株的抗寒、耐热能力。
图１２ 野生型（ＷＴ）和转ＣａＡＰＸ基因烟草植株胁迫处理
３ 讨论
杜鹃红山茶不同组织中 ＣａＡＰＸ基因表达量差
异较大，表达量由高到低依次为：未成熟果实＞嫩叶
＞花苞＞叶芽 ＞种胚 ＞花瓣 ＞花芽，表现出与不同
组织材料具有相关性。韩立敏［１８］利用实时荧光定
量ＰＣＲ分析显示：ＳｍＡＰＸ基因在丹参（Ｓａｌｖｉａｍｉｌｔｉ
ｏｒｈｉｚａＢｇｅ．）根、茎、叶中均有表达，但根中的表达量
７７４
林 业 科 学 研 究 第２９卷
图１３ 野生型（ＷＴ）和转ＣａＡＰＸ基因烟草植株温度胁迫后Ｈ２Ｏ２含量
最低，茎次之，叶中的表达量则最高，为根中的 ２１
倍。孙云等［１９］对山茶属６个茶树品种中的 ＡＰＸ基
因的表达量分析发现，６个茶树品种中均有 ＡＰＸ基
因的表达，但基因的表达量大小不一致。由此推测，
ＡＰＸ基因的表达模式随着物种及组织的不同而存在
差异。ＣａＡＰＸ基因胁迫表达分析发现，４℃低温及
３８℃高温胁迫 ８ｈ后，ＣａＡＰＸ基因均呈上调表达。
邵巍等［２０］对龙眼（ＤｉｍｏｃａｒｐｕｓｌｏｎｇａｎＬｏｕｒ．）胚性愈
伤组织进行温度胁迫也发现温度胁迫可以诱导胞质
型ＡＰＸ基因表达量的增加。许传俊等［２１］成功分离
蝴蝶兰（ＰｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓａｐｈｒｏｄｉｔｅＲｃｈｂ．Ｆ．）ＡＰＸ基因，
胁迫处理可以诱导ＡＰＸ基因表达上调，表明ＡＰＸ基
因在蝴蝶兰胁迫防御中起作用。刘慧春等［２２］也成
功分离出红掌（Ａｎｔｈｕｒｉｕｍ ａｎｄｒａｅａｎｕｍ Ｌｉｎｄｅｎｅｘ
Ａｎｄｒé）ＡＰＸ基因，低温胁迫也可以诱导 ＡＰＸ基因上
调表达。由此表明，ＡＰＸ基因会随着温度胁迫而呈
上调表达。
抗坏血酸－谷胱甘肽合成途径，是一个存在于
叶绿体和细胞液中的抗氧化防御系统，其中，ＡｓＡ能
清除细胞内由不同环境胁迫所生成的Ｈ２Ｏ２，而ＡＰＸ
是ＡｓＡ合成途径中的关键酶之一［５－６］。ＡＰＸ以ＡｓＡ
为电子受体将Ｈ２Ｏ２转化为 Ｈ２Ｏ，从而导致 ＭＤＡ的
积累。同时，ＭＤＡ较不稳定，易被重新还原成不均
等的２种物质ＡｓＡ和ＤＨＡ，而ＭＤＡ和ＤＨＡ又可通
过还原酶还原成 ＡｓＡ［７－９］。因此，在 ＡＰＸ活性提高
的同时，作为反应底物及产物的 ＡｓＡ含量也需要同
时增加，这样整个催化反应才得以继续，以完成清除
Ｈ２Ｏ２的任务。本研究中，过量表达 ＣａＡＰＸ的转基
因烟草植株中ＡＰＸ活性和ＡｓＡ含量均显著提高，分
别为野生型烟草的２．５８ ４．０９倍和２．６７ ３．５６
倍。陈莉等［２３］在拟南芥中过量表达百合（Ｌｉｌｉｕｍ
ｌｏｎｇｉｆｏｒｕｍＴｈｕｎｂ．）ＬｌＡＰＸ基因后，相对于野生型拟
南芥，转基因植株中ＡＰＸ活性及ＡｓＡ含量也获得了
提高，这一结果与本试验相符合。Ｋｏｒｎｙｅｙｅｖ等［２４］
将ｔＡＰＸ基因转化棉花（Ｇｏｓｙｐｉｕｍｓｐｐ．），获得的转
基因棉花叶片中的 ＡＰＸ活性高达野生型的 ６倍。
由此看出，过量表达ＡＰＸ基因可以提高植株的 ＡＰＸ
活性及ＡｓＡ含量，从而提高清除Ｈ２Ｏ２的能力。
野生型烟草在４℃低温或３８℃高温胁迫８ｈ后，
叶片出现严重萎焉，而过量表达 ＣａＡＰＸ基因的烟草
生长状态良好，只有少数几片叶子出现轻微萎焉现
象。将ＣａＡＰＸ整合到烟草基因组中，在 ＣａＭＶ３５Ｓ
启动子的作用下能够高效表达［２５］。因此，过量表达
后，ＡＰＸ活性提高，植物体内 ＡｓＡ的含量也随之增
加；另外，温度胁迫下，转基因烟草体内Ｈ２Ｏ２的含量
也显著低于野生型植株。由此可见，ＣａＡＰＸ基因具
有增加烟草植株抗寒、耐热性的重要功能。研究发
现，过量表达 ＡＰＸ基因有助于水稻秧苗抵抗冷冻伤
害［１０］，且提高ＡＰＸ转基因甜土豆的抗冻能力［２６］；王
雨水等［２７］低温胁迫油茶（Ｃ．ｏｌｅｉｆｅｒａＡｂｅｌ．）幼苗，检
测发现体内的 ＡＰＸ活性明显高于未经低温诱导的
油茶幼苗，说明ＡＰＸ等保护酶活性的增强在提高油
茶幼苗的抗寒性上发挥着重要作用。安辽原等［２８］
在水稻中过量表达 ＡＰＸ基因后，在热激胁迫后，转
基因植株生长状态较好，而野生型植株叶片则几乎
死亡，表明 ＡＰＸ基因在水稻耐热方面发挥的作用较
为明显；马箐等［２９］将过量表达毛白杨（Ｐｏｐｕｌｕｓｔｏ
ｍｅｎｔｏｓａＣａｒ．）ＡＰＸ基因的烟草与野生型相比，ＡｓＡ
含量也得到提高，Ｈ２Ｏ２积累量则较低；过量表达
ＡＰＸ同样可以显著提高土豆植株的耐高温能
力［１１－１２］。本研究中，转 ＣａＡＰＸ基因的烟草植株具
有较高的抗寒、耐热性，为山茶花的抗逆育种提供了
有力依据。
４ 结论
本研究中，从杜鹃红山茶嫩叶中首次分离获得
ＣａＡＰＸ基因，组织特异性及胁迫表达分析表明：
ＣａＡＰＸ基因在杜鹃红山茶７种不同组织器官中均有
８７４
第４期 王江英，等：杜鹃红山茶ＣａＡＰＸ基因的克隆、表达及功能分析
表达，但表达模式不一；在温度胁迫下能够诱导表
达，且表达量显著提高，因此 ＣａＡＰＸ基因与低温、高
温胁迫具有一定相关性。另外，烟草中过量表达
ＣａＡＰＸ基因后，植株体内的ＡＰＸ活性及ＡｓＡ含量显
著高于野生型烟草植株，低温及高温处理下植株表
型良好，体内Ｈ２Ｏ２含量也明显低于野生型植株。由
此说明，ＣａＡＰＸ基因的编码蛋白在转基因烟草植株
遭遇温度胁迫时具有重要的防御作用，也为山茶花
抗逆育种提供了科学依据。
参考文献：
［１］闵天禄．世界山茶属的研究［Ｍ］．昆明：云南科学技术出版社，
２０００：３５－４４．
［２］庄瑞林．中国山茶［Ｍ］．海口：海南人民出版社，１９８９．
［３］ＳｏｆｏＡ，ＴｕｚｉｏＡＣ，ＤｉｃｈｉｏＢ，ｅｔａｌ．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｗａｔｅｒｄｅｆｉｃｉｔａｎｄ
ｒｅｗａｔｅｒｉｎｇｏｎｔｈｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆｔｈｅａｓｃｃｏｒｂａｔｅｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｃｙｃｌｅｉｎ
ｆｏｕｒｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃＰｒｕｎｕｓｈｙｂｒｉｄｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ，２００５，１６９
（２）：４０３－４１２．
［４］ＳｕｚｕｋｉＮ，ＭｉｔｌｅｒＲ．Ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓａｎｄｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
ｓｔｒｅｓｓ：Ａｄｅｌｉｃａｔｅｂａｌａｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｓｉｇｎａｌｉｎｇａｎｄｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］．
ＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉａＰｌａｎｔａｒｕｍ，２００６，１２６（１）：４５－５１．
［５］ＬｕＺ，ＬｉｕＤ，ＬｉｕＳ．Ｔｗｏｒｉｃｅｃｙｔｏｓｏｌｉｃａｓｃｏｒｂａｔｅｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｓｄｉｆｅｒ
ｅｎｔｉａｌｙｉｍｐｒｏｖｅｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ
ＣｅｌＲｅｐｏｒｔｓ，２００７，２６（１０）：１９０９－１９１７．
［６］ＧｉｌＳＳ，ＴｕｔｅｊａＮ．Ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓａｎｄａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｍａｃｈｉｎ
ｅｒｙｉｎａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎｃｒｏｐｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌＢｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１０，４８（１２）：９０９－９３０．
［７］ＦｏｙｅｒＣＨ，ＨａｌｉｗｅｌＢ．Ｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅａｎｄｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ
ｒｅｄｕｃｔａｓｅｉｎｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ：ａｐｒｏｐｏｓｅｄｒｏｌｅｉｎａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄｍｅｔａｂｏ
ｌｉｓｍ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔａ，１９７６，１３３（１）：２１－２５．
［８］ＪａｂｌｏｎｓｋｉＰＰ，ＡｎｄｅｒｓｏｎＪＷ．Ｌｉｇｈｔｄｅｐｅｎｄｅｎｔｒｅｄｕｃｔｉｏｎｏｆｈｙｄｒｏ
ｇｅｎｐｅｒｏｘｉｄｅｂｙｒｕｐｔｕｒｅｄｐｅａｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，
１９８１，６７（６）：１２３９－１２４４．
［９］ＨｏｓｓａｉｎＭＡ，ＡｓａｄａＫ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｄｅｈｙｄｒｏａｓｃｏｒｂａｔｅｒｅｄｕｃｔａｓｅ
ｆｒｏｍｓｐｉｎａｃｈａｎｄｉｔｓｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｓａｔｈｉｏｌｅｎｚｙｍｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ
ａｎｄＣｅｌＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９８４，２５（１）：８５－９２．
［１０］ＹｕｔａｋａＳ，ＴｏｙｏｔａｋａＭ，ＨｉｄｅｙｕｋｉＦ，ｅｔａｌ．Ｈｅａｔｓｈｏｃｋｍｅｄｉａｔｅｄ
ＡＰＸｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎａｇａｉｎｓｔｃｈｉｌｉｎｇｉｎｊｕｒｙｉｎｒｉｃｅ
ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＢｏｔａｎｙ，２００１，５２（３５４）：
１４５－１５１．
［１１］ＴａｎｇＬ，ＫｗｏｎＳＹ，ＫｉｍＳＨ，ｅｔａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｄｔｏｌｅｒａｎｃｅｏｆｔｒａｎｓ
ｇｅｎｉｃｐｏｔａｔｏｐｌａｎｔｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｂｏｔｈｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅａｎｄａｓｃｏｒ
ｂａｔｅｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｉｎｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓａｇａｉｎｓｔｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓａｎｄｈｉｇｈｔｅｍ
ｐｅｒａｔｕｒｅ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌＲｅｐｏｒｔｓ，２００６，２５（１２）：１３８０－１３８６．
［１２］ＫｉｍＭＤ，ＫｉｍＹＨ，ＫｗｏｎＳＹ，ｅｔａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｄｔｏｌｅｒａｎｃｅｔｏｍｅｔｈ
ｙｌｖｉｏｌｏｇｅｎｉｎｄｕｃｅｄｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓａｎｄｈｉｇｈｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｉｎｔｒａｎｓｇｅｎ
ｉｃｐｏｔａｔｏｐｌａｎｔｓｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｔｈｅＣｕＺｎＳＯＤ，ＡＰＸａｎｄＮＤＰＫ２
ｇｅｎｅｓ［Ｊ］．ＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉａＰｌａｎｔａｒｕｍ，２０１０，１４０（２）：１５３－１６２．
［１３］朱高浦，李纪元．珍稀濒危植物张氏红山茶研究进展（综述）
［Ｊ］．亚热带植物科学，２００９，３８（３）：８３－８９．
［１４］ＨｏｒｓｃｈＲＢ，ＦｒｙＪＥ，ＨｏｆｍａｎｎＮＬ，ｅｔａｌ．Ａｓｉｍｐｌｅａｎｄｇｅｎｅｒａｌ
ｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｒａｎｓｆｅｒｉｎｇｇｅｎｅｓｉｎｔｏｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７
（４６９１）：１２２９－１２３１．
［１５］ＮａｋａｎｏＹ，ＡｓａｄａＫ．Ｈｙｄｒｏｇｅｎｐｅｒｏｘｉｄｅｉｓｓｃａｖｅｎｇｅｄｂｙａｓｃｏｒｂａｔｅ
ｓｐｅｃｉｆｉｃｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｉｎｓｐｉｎａｃｈｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔａｎｄＣｅｌ
Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９８１，２２（５）：８６７－８８０．
［１６］ＫａｍｐｆｅｎｋｅｌＫ，ｖａｎＭｏｎｔａｇｕＭ，ＩｎｚｅＤ．Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄｄｅｔｅｒｍｉｎａ
ｔｉｏｎｏｆａｓｃｏｒｂａｔｅａｎｄｄｅｈｙｄｒｏａｓｃｏｒｂａｔｅｆｒｏｍｐｌａｎｔｔｉｓｓｕｅ［Ｊ］．Ａｎａ
ｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９５，２２５（１）：１６５－１６７．
［１７］ＳａｉｒａｍＲＫ，ＳｒｉｖａｓｔａｖａＧＣ．Ｃｈａｎｇｅｓｉｎａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｓｕｂ
ｃｅｌｕｌａｒｆｒａｃｔｉｏｎｓｏｆｔｏｌｅｒａｎｔａｎｄｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅｗｈｅａｔｇｅｎｏｔｙｐｅｓｉｎｒｅ
ｓｐｏｎｓｅｔｏｌｏｎｇｔｅｒｍｓａｌｔｓｔｒｅｓｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ，２００２，１６２（６）：
８９７－９０４．
［１８］韩立敏．丹参ＡＰＸ和ＧＰＸ基因克隆及其表达分析［Ｄ］．西安：
陕西师范大学，２００７：２２－４４．
［１９］孙 云，林玉玲，赖钟雄，等．茶树品种及萎凋过程中叶片
ＡＰＸ基因表达的ｑＰＣＲ分析［Ｊ］．福建农林大学学报：自然科
学版，２０１２，４１（４）：４７６－４８１．
［２０］邵 巍．龙眼胚性培养物胞质型 ａｐｘ基因克隆及其表达研究
［Ｄ］．福州：福建农林大学，２００８：８４－９５．
［２１］许传俊，孙叙卓，李 玲，等．蝴蝶兰抗坏血酸过氧化物酶基
因克隆及其表达研究［Ｊ］．园艺学报，２０１２，３９（４）：７６９
－７７６．
［２２］刘慧春．红掌‘阿技巴马’低温相关基因ＡＯＸ、ＣＡＴ和ＡＰＸ的表
达分析、功能验证及遗传转化体系的构建［Ｄ］．杭州：浙江大
学，２０１２：１００－１２９．
［２３］陈 莉，辛海波，孙向荣，等．百合 ＡＰＸ基因的克隆及转
ＬｌＡＰＸ提高拟南芥耐盐性［Ｊ］．园艺学报，２０１０，３７（１２）：１９８３
－１９９０．
［２４］ＫｏｒｎｙｅｙｅｖＤ，ＤｍｙｔｒｏＫ，ＢａｒｙＡ，ｅｔａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｄｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ｌｉｇｈｔｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎａｎｄｄｅｃｒｅａｓｅｄｃｈｉｌｉｎｇｉｎｄｕｃｅｄｐｈｏｔｏｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆ
ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍＩｉｎｃｏｔｏｎｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｉｏｎｇｅｎｅｓｅｎｃｏｄｉｎｇｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ
ｔａｒｇｅｔｅｄａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｅｎｚｙｍｅｓ［Ｊ］．ＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉａＰｌａｎｔａｒｕｍ，２００１，
１３３（１）：３２３－３３１．
［２５］ＢａｔｒａｗＭＪ，ＨａｌＴＣ．ＨｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆＣａＭＶ３５ＳＰｒｏ
ｍｏｔｅｒβｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｒｉｃｅｐｌａｎｔｓ
［Ｊ］．ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，１９９０，１５（４）：５２７－５３８．
［２６］ＬｉｍＳ，ＫｉｍＹＨ，ＫｉｍＳＨ，ｅｔａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｄｔｏｌｅｒａｎｃｅｏｆｔｒａｎｓｇｅｎ
ｉｃｓｗｅｅｔｐｏｔａｔｏｐｌａｎｔｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｂｏｔｈｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅａｎｄａ
ｓｃｏｒｂａｔｅｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｉｎｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓａｇａｉｎｓｔｍｅｔｈｙｌｖｉｏｌｏｇｅｎｍｅｄｉａｔｅｄ
ｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓ［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｒｅｅｄｉｎｇ，２００７，１９（３）：２２７
－２３９．
［２７］王雨水．低温锻炼对冷胁迫下油茶幼苗光合速率与抗氧化酶
活性的影响［Ｊ］．福建林业科技，２０１１，３８（１）：４１－４６．
［２８］安辽原，牛向丽，黄龙翔，等．过量表达ＯｓＡＰＸ１基因增强水稻
的抗热和抗氧化能力［Ｊ］．中国农业科技导报，２０１２，１４（５）：
２８－３２．
［２９］马 箐．过量表达毛白杨 ＡＰＸ基因增强植物对非生物胁迫的
抗性［Ｄ］．济南：山东师范大学，２０１２：３７－５９．
（责任编辑：金立新）
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