全 文 ：书祁连山不同海拔梯度山生柳遗传多样性的犛犛犚分析
郭敏，马彦军，李毅
（甘肃农业大学林学院，甘肃 兰州７３００７０）
摘要：本实验采用ＳＳＲ分子标记技术，对甘肃祁连山脉９个海拔梯度共１８０个单株的山生柳遗传多样性和遗传结
构进行了研究。利用杨属植物的４７对ＳＳＲ引物对山生柳进行了通用性分析，筛选出１５对重复性高、条带清晰的
引物，结果显示，１５条引物共检测到２１１条谱带，其中多态性条带有１７６条，平均每个引物检测到１１个等位变异，
多态位点比率（犘）为８５％。应用分析软件Ｐｏｐｇｅｎ３２进行分析得出：在物种水平上，Ｓｈａｎｎｏｎ多样性指数（犐）为
０．４１９２，Ｎｅｉ基因多样性指数（犎）为０．２７９６；基因分化系数Ｇｓｔ为０．０９３５，基因流Ｎｍ为４．８４８７，说明山生柳遗
传分化大部分存在于相同海拔梯度内。犘，犎，犐都反应出山生柳具有较高的遗传多样性。聚类分析显示，遗传距
离与空间地理距离有显著相关性。海拔及纬度因子显著影响山生柳种群的遗传多样性水平，海拔梯度越高，山生
柳的遗传多样性越丰富。
关键词：ＳＳＲ；山生柳；海拔；通用性；遗传多样性
中图分类号：Ｑ９４３；Ｑ９４９．７３３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１２）０５０１１４０８
简单重复序列（ＳＳＲ，ｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ）由 Ｍｏｏｒｅ等于１９９１年创立，是一类由几个碱基组成的基序串
联重复而成的ＤＮＡ序列，其长度一般较短，每单元长度在１～６ｂｐ，两边有保守的ＤＮＡ序列［１］。ＳＳＲ具有很多
优点，它具有高度的多态性，数量丰富、信息含量高和重复性好等特点，遵循孟德尔的遗传规律同时具有共显性的
模式，而且对ＤＮＡ的纯度要求不高，这就大大减少了工作的复杂度。并且ＳＳＲ标记覆盖整个基因组，呈现多基
因特点，表现为共显性遗传［２５］。
需要引起注意的是在ＳＳＲ引物的获得途径中，由于目前只建立了ＤＮＡ文库和ｃＤＮＡ文库，因此对于其中
大多数的物种获取ＳＳＲ引物是比较困难的，对于一些以往处于初步研究的树种可以借鉴其近缘种甚至其他物种
已开发的引物［６］，如柑橘属（犆犻狋狉狌狊）的不同种［７］以及猕猴桃属（犃犮狋犻狀犻犱犻犪）的不同种的引物开发［８］。本试验中首
先通过杨树（犘狅狆狌犾狌狊）引物在柳树（犛犪犾犻狓）上的通用性探究旨在加速杨柳树种遗传育种学的研究进程。
山生柳（犛犪犾犻狓狅狉犻狋狉犲狆犺犪）为杨柳科柳属多年生落叶直立小灌木，为我国特有种，主要分布于海拔３０００～
３７００ｍ的高山山脊、山坡、沟谷林缘，具有生长快，无病虫害等特点［９］，山生柳不仅具有以灌护草、以灌育草的作
用，还能有效控制水土流失、涵养水源、培育土壤，对于生态系统的稳定性有着重要作用［１０］。目前国内在分子方
面对祁连山不同海拔梯度高寒植物的遗传多样性分析未见报道。因此本课题组在已进行的研究中，对祁连山脉
的山生柳资源进行了较多研究，并对分布于祁连山西水生态站的山生柳进行了梯度式考察取样并作了细致的群
落调查［１１，１２］。本试验试图通过从杨树引物中筛选适合山生柳的引物并通过优化反应条件，建立山生柳ＳＳＲ标记
的反应体系和条件，分析山生柳的遗传多样性，为山生柳的进一步研究提供依据，并为保护和发展祁连山高寒植
被提出科学依据。
１ 材料与方法
１．１ 取样方法和ＳＳＲ引物来源
本研究选择山生柳分布较为广泛的祁连山自然保护区西水生态站作为实验点，该区极端最高气温４０℃，极
端最低气温－３５℃，年降水量４００．８ｍｍ，集中在６－９月，空气相对湿度５８％，年蒸发量３８７８ｍｍ，平均日照时
１１４－１２１
２０１２年１０月
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
第２１卷 第５期
Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．５
收稿日期：２０１１０７２１；改回日期：２０１１０９３０
基金项目：教育部高等学校博士点基金（２００９６２０２１１０００２）资助。
作者简介：郭敏（１９８７），女，甘肃天水人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：ｇｕｏｍｉｎ．ｍｅｌｙｓｓａ＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｌｉｙｉ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
数２８７９．８ｈ，无霜期平均１８７ｄ。该区土壤和植被因气候差异而形成明显的垂直分布带，山地森林灰褐土和亚高
山灌丛草甸土是森林适宜生长的土壤，山地森林灰褐土分布在海拔２４００～３３００ｍ地带，是乔木林的主要分布
带，混杂有山生柳。亚高山灌丛草甸土分布在海拔３３００～３９００ｍ地带，是山生柳的主要分布带。
取样时，首先在海拔２８００～３５００ｍ范围内设样线，在各样线上沿海拔梯度平均每５０ｍ设置１６ｍ×１６ｍ
的样地１块，共９个样地。然后在各样地内，对山生柳进行取样。每个梯度随机采２０个无病害的叶片作样方，共
９个海拔梯度，１８０个单株（表１），随着海拔的升高，山生柳的形态也有显著变化。引物来源（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｒｎｌ
ｇｏｖ／ｓｃｉ／ｉｐｇｃ／ｓｓｒ＿ｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｈｔｍ，ＵＳＡ），随机抽取合成。采用改良后的ＣＴＡＢ法提取植物ＤＮＡ［１３］，－２０℃下保
存。于２００９年６月－２０１０年６月进行了研究。
表１ 材料来源及生境特点
犜犪犫犾犲１ 犜犺犲狅狉犻犵犻狀狅犳犲狓犪犿犻狀犲犱狆犾犪狀狋狊犪狀犱狋犺犲犻狉犺犪犫犻狋犪狋犮犺犪狉犪犮狋犲狉犻狊狋犻犮狊
样点
Ｓａｍｐｌｉｎｇ
ｐｏｉｎｔ
经度
Ｌｏｎｇｉｔｕｄｅ
（°）
纬度
Ｌａｔｉｔｕｄｅ
（°）
海拔
Ａｌｔｉｔｕｄｅ
（ｍ）
平均株高
Ａｖｅｒａｇｅ
ｈｅｉｇｈｔ
（ｍ）
平均冠幅
Ａｖｅｒａｇｅｃｒｏｗｎ
ｄｉａｍｅｔｅｒ
（ｍ）
年均气温
Ａｎｎｕａｌｍｅａｎ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
（℃）
坡向
Ｓｌｏｐｅ
ｇｒａｄｉｅｎｔ
坡度
Ｓｌｏｐｅ
ｄｅｇｒｅｅ
（°）
群落类型
Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙｔｙｐｅ
１ １０８．３３ ３１．７３ ２８８０ ２．５ １．３６ １０～１２ Ｎ ３２ 青海云杉林犘犻犮犲犪犮狉犪狊狊犻犳狅犾犻犪＋山生柳犛．
狅狉犻狋狉犲狆犺犪
２ １０１．１８ ２９．３５ ２９４４ ２．１ １．１７ １０～１１ Ｎ ２８ 苔藓云杉林犅狉狔狅狆犺狔狋犪犘．犮狉犪狊狊犻犳狅犾犻犪＋山
生柳犛．狅狉犻狋狉犲狆犺犪
３ １０８．９０ ３２．９２ ２９９０ １．６ １．１０ ９～１０ ＮＥ ３３ 苔藓云杉林犅狉狔狅狆犺狔狋犪犘．犮狉犪狊狊犻犳狅犾犻犪＋山
生柳犛．狅狉犻狋狉犲狆犺犪
４ １０４．９８ ３５．９８ ３１４４ １．６ １．４４ ９～１０ Ｎ ３４ 青海云杉林 犘．犮狉犪狊狊犻犳狅犾犻犪＋山生柳 犛．
狅狉犻狋狉犲狆犺犪
５ １０３．１８ ３３．１１ ３１９０ １．７ １．５０ ８～９ ＮＥ ３４ 灌丛青海云杉林ｓｈｒｕｂ犘．犮狉犪狊狊犻犳狅犾犻犪＋山
生柳犛．狅狉犻狋狉犲狆犺犪
６ １０１．１８ ３９．３２ ３２５０ １．２ １．１３ ６～７ ＮＥ ３０ 锦鸡儿犆犪狉犪犵犪狀犪狊犻狀犻犮犪＋山生柳（密植）
犛．狅狉犻狋狉犲狆犺犪（ｃｌｏｓｅｐｌａｎｔｉｎｇ）
７ １０４．１８ ３８．７２ ３３２０ １．０ ０．８９ ５～６ Ｎ ３５ 锦鸡儿犆．狊犻狀犻犮犪＋山生柳（密植）犛．狅狉犻狋
狉犲狆犺犪（ｃｌｏｓｅｐｌａｎｔｉｎｇ）
８ １０２．８８ ２８．３２ ３３８１ ０．７ ０．６７ ４～５ ＮＥ ４０ 山生柳（密植）犛．狅狉犻狋狉犲狆犺犪（ｃｌｏｓｅｐｌａｎｔｉｎｇ）
９ １００．１８ ３８．３２ ３４４１ ０．８ ０．７３ ２～３ Ｎ ３９ 山生柳（密植）犛．狅狉犻狋狉犲狆犺犪（ｃｌｏｓｅｐｌａｎｔｉｎｇ）
１．２ ＰＣＲ扩增和成果检测
ＰＣＲ程序采用优化后的山生柳２０μＬ体系，其中含有２．５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｍｇ
２＋ １μＬ，０．１０ｍｍｏｌ／Ｌ 浓度的
ｄＮＴＰｓ１．５μＬ，０．５ＵＴａｑ酶用量为１μＬ，２０ｎｇ／μＬＤＮＡ模板１μＬ，０．５μｍｏｌ／Ｌ的上下游引物各２μＬ，１０×
ＴａｑＢｕｆｆｅｒ２μＬ、ｄｄＨ２Ｏ加至２０μＬ。ＰＣＲ的预扩增程序经优化后，９４℃预变性５ｍｉｎ，９４℃变性３０ｓ，５４℃（不
同引物有不同的退火温度）退火４５ｓ，７２℃延伸３０ｓ，循环数３０个，最后再７２℃延伸１０ｍｉｎ，４℃保温。ＰＣＲ产物
经８％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（２００Ｖ稳压，２ｈ）分离，银染检测［１４］。
１．３ 数据统计和分析
根据电泳结果，本研究用ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ公司的ＩｍａｇｅＳｃａｎｎｅｒ电泳扫描分析对凝胶进行扫
描，根据共显性分子标记基因型分型的原则，对得到的图谱进行分析。有带记为１，无带记为０［１５］，采用Ｐｏｐｇｅｎ
３２软件进行数据处理，该软件的优点是处理的数据量大，适合于等位酶数据处理也适合于ＳＳＲ的数据处理，因
为它能给出所研究的各群体之间的一些资料，如：多态位点百分率，群体间的遗传距离及遗传一致度等。
５１１第２１卷第５期 草业学报２０１２年
２ 结果和分析
２．１ 山生柳ＳＳＲ扩增引物的筛选
通过对ＰＣＲ扩增的各个引物结果进行直观比较从而筛选出１５条带型稳定，重复性高的最佳引物。利用这
１５对引物对山生柳的遗传多样性进一步分析。１５个引物，共扩增出２１１条条带，分子量５０～２０００ｂｐ，不同引物
扩增的多态性带纹数目从８到２２不等，形成了带型丰富、片断大小及其组合不同的电泳图谱（图２和图３）。其
中多态性条带有１７６个，这说明了山生柳具有较高的遗传多样性。杨属引物的多态性比例达到７６．４１％。４７对
引物中，有４３对带型稳定清晰，通用性达９１．１％（图１），杨树引物的多态性比例较好（表２），引物 ＷＰＭＳ１５的多
态性比率达到了９０％，而引物ＳＨＵＫｌ２３、ＳＨＵＫｌ２４、ＳＨＵＫ０３４的多态性比率甚至达到了１００％。结果证明了杨
属植物的引物在山生柳ＳＳＲ－ＰＣＲ体系建设中通用性良好。
图１ 引物１～４７为待筛选杨树引物的扩增
犉犻犵．１ 犘狉犻犿犲狉１－４７犳狅狉狆狅狆狌犾狌狊狆狉犻犿犲狉狑犺犻犮犺狑犲狉犲狊犲犾犲犮狋犲犱
表２ 选用１５对引物扩增的谱带信息
犜犪犫犾犲２ 犜犺犲犻狀犳狅狉犿犪狋犻狅狀狅狀犫犪狀犱狊犵犲狀犲狉犪狋犲犱犫狔１５犛犛犚狊
引物
Ｐｒｉｍｅｒｓ
序列
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
退火温度
Ａｎｎｅａｌｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（℃）
总带数
Ｔｏｔａｌｂａｎｄｓ
多态性带数
Ｎｕｍｂｅｒｏｆｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｂａｎｄｓ
多态带百分比Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆ
ｐｏｌｙｍｅｒｐｈｉｃｂａｎｄｓ（ＰＰＢ，％）
ＷＰＭＳ１３ （ＧＴ）２２ ５７ １２ １０ ０．８３
ＷＰＭＳ１４ （ＣＧＴ）２８３ ６５ １１ ９ ０．８２
ＷＰＭＳ１５ （ＣＣＴ）１４３ ５０ １０ ９ ０．９０
ＷＰＭＳ１６ （ＧＴＣ）８（ＡＴＣＣＴＣ） ５８ １５ ９ ０．６０
ＷＰＭＳ１７ （ＣＡＣ）１５１６ ６３ １２ ８ ０．６７
ＯＲＰＭ０１６ （ＣＴＴ）１５ ５９ ８ ６ ０．７５
ＯＲＰＭ０２３ （ＡＴ）６ ５６ ２２ １９ ０．８６
０ＲＰＭ０２６ （ＣＡ）８ ５２ １４ １０ ０．８６
ＯＲＰＭ０２８ （ＡＴ）７ ５０ ２１ １６ ０．７１
ＯＲＰＭ０３０ （ＧＴ）ｎ ５０ １７ １６ ０．９４
Ｓｈｕｋ０５８ （ＣＡ）ｎ ５９ １４ １２ ０．８５
Ｓｈｕｋｌ２３ （ＧＡ）１９ ５５ １６ １６ １．００
Ｓｈｕｋｌ２４ （ＣＴ）１８ ５６ １３ １３ １．００
Ｓｈｕｋｌ９７ （ＣＴ）１６ ５５ １４ １３ ０．９３
ＳＨＵＫ０３４ （ＣＴ）１４ ５６ １２ １２ １．００
平均 Ｍｅａｎ ２１１ １７８ ０．８５
６１１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．５
２．２ 山生柳不同海拔梯度的遗传多样性分析
通过Ｐｏｐｇｅｎ３２计算得出的结果显示各海拔梯度的ｓｈａｎｎｏｎ指数（犐）的多态性在０．２３４２～０．５９８８，平均为
０．４１９２。Ｎｅｉ指数在０．１４６０～０．４３４２（表３），平均为０．２７９６，２种指标都表明山生柳种群具有较高的遗传多样
性［１６］，而且随着海拔梯度的升高遗传多样性呈现升高的趋势。不同海拔梯度间的Ｇｓｔ和Ｎｍ，总的遗传多样性
Ｈｔ＝０．２８２２，种群内遗传多样性Ｈｓ＝０．２５５８，Ｇｓｔ＝０．０９３５，即９．３５％的遗传变异存在在居群间，９０．５５％的遗
传变异存在居群内（表４）。不同引物其遗传分化系数所占的比例不同，其中ＯＲＰＭ０３０最高，占到２５．３９％，引
物ＳＨＵＫ０３４最低，为４．６４％（表４）。基于种群间遗传分化系数计算的基因流为Ｎｍ＝４．８４８７＞１，这说明居群
间有较高水平的基因流，足以防止遗传漂变所导致群居间的遗传分化。图２和图３显示了不同引物在山生柳扩
增中的多态性，不同引物形成了８～２２的带型丰富及重复性好的电泳图谱。同时观察到杨树引物能很好的显示
物种的遗传分化情况，可以方便的鉴定物种的遗传多样性。
表３ 甘肃祁连山不同海拔梯度山生柳的遗传多样性
犜犪犫犾犲３ 犌犲狀犲狋犻犮犱犻狏犲狉狊犻狋狔犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀狋犾犪狋犻狋狌犱犲狊狅犳犛．狅狉犻狋狉犲狆犺犪
海拔
Ｌａｔｉｔｕｄｅ
样本数
ＳａｍｐｌｅＮｏ．
总带数
Ｔｏｔａｌｂａｎｄｓｎｕｍｂｅｒ
多态性带数Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ
ｏｆｂａｎｄｓｎｕｍｂｅｒ
多态性比率Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆ
ｐｏｌｙｍｅｒｐｈｉｃｂａｎｄｓ（％）
Ｓｈａｎｎｏｎ指数
Ｓｈａｎｎｏｎ’ｓｉｎｄｅｘ（犐）
Ｎｅｉ指数
Ｎｅｉ’ｉｎｄｅｘ（犎）
Ｐ１ ２０ ２１１ １５６ ７３．９３ ０．２３４２ ０．１４６
Ｐ２ ２０ ２１１ １８１ ８５．７８ ０．３８４８ ０．２１６
Ｐ３ ２０ ２１１ １８２ ８６．２６ ０．４１３４ ０．２４１
Ｐ４ ２０ ２１１ １７２ ８１．５２ ０．３４６７ ０．２０９
Ｐ５ ２０ ２１１ １８２ ８６．２６ ０．４４１８ ０．２７３
Ｐ６ ２０ ２１１ １８３ ８６．７３ ０．４２０４ ０．２６９
Ｐ７ ２０ ２１１ １８３ ８６．７３ ０．４２０５ ０．３８６
Ｐ８ ２０ ２１１ １９０ ９０．０５ ０．５９８８ ０．４３４
Ｐ９ ２０ ２１１ １８５ ８６．６８ ０．５１２６ ０．３２８
平均 Ｍｅａｎ ２０ ２１１ １７８ ８５．９９ ０．４１９２ ０．２７９
图２ 引物犗犚犘犕０３０在不同海拔山生柳中的扩增结果
犉犻犵．２ 犛犛犚犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狉犲狊狌犾狋狊狅犳犛．狅狉犻狋狉犲狆犺犪
狑犻狋犺狆狉犻犿犲狉犗犚犘犕０３０
图３ 引物 犠犘犕犛１４在不同海拔山生柳中的扩增结果
犉犻犵．３ 犛犛犚犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狉犲狊狌犾狋狊狅犳犛．狅狉犻狋狉犲狆犺犪
狑犻狋犺狆狉犻犿犲狉犠犘犕犛１４
２．３ 山生柳不同海拔梯度的遗传距离和遗传一致度
９个海拔梯度具有较高的遗传一致度平均为０．９４３７（表５），其中海拔梯度Ｐ９和Ｐ８相似系数最高，为
０．９９９７，海拔梯度越高，遗传多样性越高，具有较多相同的遗传物质。９个海拔梯度的遗传距离平均为０．０２９６，
海拔梯度Ｐ８和Ｐ９的遗传距离最小，同样说明高海拔的山生柳就有较高的遗传多样性。
７１１第２１卷第５期 草业学报２０１２年
表４ 甘肃省祁连山不同海拔梯度山生柳种群的遗传分化
犜犪犫犾犲４ 犌犲狀犲狋犻犮犱犻犳犳犲狉犲狀狋犻犪狋犻狅狀狊犪犿狅狀犵狀犻狀犲犪犾狋犻狋狌犱犲狊狅犳犛．狅狉犻狋狉犲狆犺犪
引物
Ｐｒｉｍｅｒｓ
总基因多样度
Ｔｏｔａｌｇｅｎｅｄｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｈｔ）
种群内基因多样度
Ｗｉｔｈｉｎｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｄｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｈｓ）
种群间遗传分化系数
Ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｍｏｎｇｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ（Ｇｓｔ）
基因流
Ｇｅｎｅｆｌｏｗ（Ｎｍ）
ＷＰＭＳ１３ ０．２９７４ ０．２７５０ ０．０７５１ ６．１５４
ＷＰＭＳ１４ ０．１９５１ ０．１６０２ ０．１７８８ ２．２９６
ＷＰＭＳ１５ ０．３６２８ ０．３３１５ ０．０８６２ ５．３００
ＷＰＭＳ１６ ０．５１８３ ０．４９０４ ０．０５３９ ８．７７０
ＷＰＭＳ１７ ０．５１５５ ０．４７１５ ０．０８５２ ５．３６７
ＯＲＰＭ０１６ ０．１６９４ ０．１５３４ ０．０９４６ ４．７８６
ＯＲＰＭ０２３ ０．１３３９ ０．１２０３ ０．１０１４ ４．４３２
０ＲＰＭ０２６ ０．４０８１ ０．３７８３ ０．０８５８ ７．７２５
ＯＲＰＭ０２８ ０．４９３８ ０．４５１８ ０．０８５１ ５．３７３
ＯＲＰＭ０３０ ０．０７７５ ０．０５７９ ０．２５３９ １．４６８
Ｓｈｕｋ０５８ ０．１１３９ ０．０９６４ ０．１５３２ ２．７６３
Ｓｈｕｋｌ２３ ０．２０８５ ０．１７８６ ０．１４３４ ２．９８７
Ｓｈｕｋｌ２４ ０．５４８５ ０．４９７７ ０．０９２５ ４．９０２
Ｓｈｕｋｌ９７ ０．２９７８ ０．２６５８ ０．１０７２ ４．１６２
Ｓｈｕｋ０３４ ０．３００４ ０．２８６５ ０．０４６４ １０．２８５
平均值 Ｍｅａｎ ０．２８２２ ０．２５５８ ０．０９３５ ４．８４８
标准误差Ｓｔ．ｄｅｖ ０．０３０８ ０．０２７１
表５ 不同海拔梯度山生柳遗传一致度和遗传距离
犜犪犫犾犲５ 犌犲狀犲狋犻犮犻犱犲狀狋犻狋狔犪狀犱犱犻狊狋犪狀犮犲犫犲狋狑犲犲狀犱犻犳犳犲狉犲狀狋犪犾狋犻狋狌犱犲狅犳犛．狅狉犻狋狉犲狆犺犪
海拔Ａｌｔｉｔｕｄｅ Ｐ１ Ｐ２ Ｐ３ Ｐ４ Ｐ５ Ｐ６ Ｐ７ Ｐ８ Ｐ９
Ｐ１ ０．９８５２ ０．９８０３ ０．９５８７ ０．９８０７ ０．９６７５ ０．９６８５ ０．９４７２ ０．９４１２
Ｐ２ ０．０１５０ ０．９９４５ ０．９７０８ ０．９７８９ ０．９７８４ ０．９８４９ ０．９５１１ ０．９５８１
Ｐ３ ０．０１９９ ０．００５５ ０．９６３０ ０．９８２６ ０．９７４９ ０．９８１１ ０．９５０４ ０．９５７６
Ｐ４ ０．０４２２ ０．０２９７ ０．０３７７ ０．９６６３ ０．９５９６ ０．９７３９ ０．９５１１ ０．９６１９
Ｐ５ ０．０１９５ ０．０２１３ ０．０１７５ ０．０３４３ ０．９７６２ ０．９７６７ ０．９８５２ ０．９８３０
Ｐ６ ０．０３３０ ０．０２１９ ０．０２５４ ０．０４１２ ０．０２４１ ０．９９１５ ０．９５３０ ０．９５８０
Ｐ７ ０．０３２０ ０．０１５２ ０．０１９０ ０．０２６４ ０．０２３６ ０．００８５ ０．９５９６ ０．９６８６
Ｐ８ ０．０５４３ ０．０５０１ ０．０５０８ ０．０５０１ ０．０１４９ ０．０４８１ ０．０４１２ ０．９９９７
Ｐ９ ０．０６０６ ０．０４２８ ０．０４３３ ０．０３８９ ０．０１７１ ０．０４２９ ０．０３１９ ０．０００３
注：上三角为遗传一致度，下三角为遗传距离，Ｐ１～Ｐ９为表１所示。
Ｎｏｔｅ：Ｎｅｉ’ｓｇｅｎｅｔｉｃｉｄｅｎｔｉｔｙ（ａｂｏｖｅｄｉａｇｏｎａｌ），ａｎｄｇｅｎｅｔｉｃｄｉｓｔａｎｃｅ（ｂｅｌｏｗｄｉａｇｏｎａｌ），Ｐ１－Ｐ９ａｓｓｈｏｗｅｄｉｎＴａｂｌｅ１．
２．４ 山生柳９个不同海拔的聚类分析
根据种群间的遗传距离，采用类平均法（ＵＰＧＭＡ）对９个种群进行聚类绘图（图４），大体分为３类群，Ｐ２首
先和Ｐ３相聚，再与Ｐ１，Ｐ５相聚为一类。Ｐ６和Ｐ７相聚再与Ｐ４聚为第２类群，最后Ｐ８与Ｐ９聚为第３类群。
Ｍａｎｔｅｌ检验结果表明，遗传距离与空间地理距离有显著相关性。
３ 结论与讨论
３．１ 杨柳引物扩增的通用性
在ＳＳＲ标记中多态性非常高，信息量丰富，而引物的变异度大，只要开发出合适的特异引物，检测分析就变
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得简单易行，因而ＳＳＲ标记在遗传多样性分析中有很高的应用价值［１７，１８］。但ＳＳＲ标记两端序列保守，所以设计
的引物必须考虑与两端保守序列互补［１９］，这使ＳＳＲ标记的进行有一定的困难［２０］。现有的ＳＳＲ标记数量有限，
所以不能标记所有的功能基因，为了对某种植物进行ＳＳＲ标记，就必须设立与该植物或相近物种的特定引
物［２１］。杨树作为林木中的优势树种，成为第３个完成基因组测序的物种，所以其ＳＳＲ引物应充分被利用。本实
验中通过杨柳引物通用性的探究，不仅可以有效弥补柳树分子标记不足的现状，替代在柳树中重新开发标记，节
约引物开发成本，而且丰富其标记的数量。今后可在柳树ＳＳＲ实验上采用杨属引物，从而节省时间和成本。尤
其本实验中引物ＳＨＵＫｌ２３、ＳＨＵＫｌ２４、ＳＨＵＫ０３４的多态性比率达到了１００％，充分证明了杨柳引物的通用性很
好。
图４ 甘肃祁连山９个海拔梯度山生柳种群的遗传聚类图
犉犻犵．４ 犇犲狀犱狉狅犵狉犪犿狅犳狀犻狀犲犾犪狋犻狋狌犱犲狊狅犳犌犪狀狊狌犛．狅狉犻狋狉犲狆犺犪
３．２ 山生柳不同海拔居群的遗传分化
通过ＳＳＲ实验结果显示山生柳具有较高的遗传多样性，多态性条带比率在５０％以上被认为遗传多样性是丰
富的［２２］。表明该物种还未产生自交衰退现象。当种群Ｎｍ＞１时，存在一定的基因漂流，它能足以抵制遗传漂变
导致群居间的遗传分化。在本试验中，Ｗｒｉｇｈｔ［２３］认为当Ｎｍ＝４．８４８７＞１，属于较高水平，说明不同居群间存在
一定的基因流动，可以防止由遗传漂变引起的亚种群之间的遗传分化，其可能为：１）山生柳具有有性繁殖与无性
繁殖的双重性，北方风沙大，花粉与种子可以随处传播。２）其种群有着一定的克隆生长，一定年龄的基株（个体）
可形成多个克隆分株，进而构成高寒灌丛平。根据结果显示随着海拔梯度的升高，山生柳的遗传多样性有所增
大，这可能与一定的气候，温度相关联。
在群落中，由于生境梯度与物种的生物学特征的不同，经常会出现：１）群落中物种交错重叠，呈现极为复杂的
关系。２）群落中物种相互不发生交错关系，呈现明显的分布界限。３）群落中某一个或几个物种生态适应性较宽
一些，但是其他物种（或类型）由于生境梯度的急剧变化，而被严格限制在某种生境中［２４］。在聚类图４中出现了
一定情况的交错现象，说明在一定海拔处呈现出明显的生态交错区。保护现存自然种群以保存尽可能多的遗传
多样性是适宜的保护措施［２５］，生境适宜促进物种进化，有利于物种长期生存发展，从另一方面证明山生柳对高寒
气候的适应性很强，这也是本试验在不同海拔对山生柳遗传多样性进行探究的目的所在。根据计算得到的不同
海拔梯度Ｈｔ＝０．２８２２，Ｈｓ＝０．２５５８，Ｇｓｔ在０．０４６４～０．２５３９，平均为０．０９３５，即４．６４％～２５．３９％的遗传变异
存在于居群间，７４．７６％～９５．２６％的遗传变异存在于居群内。山生柳以有性繁殖为主，但是，由于山生柳分布于
寒带气候如：高山、亚高山、山地寒温针叶林带和冰雪带之间，具有长期积雪、风大、低温、干燥等气候特点。因此，
在恶劣的环境下，山生柳有性繁殖受到极大限制，因而主要依靠无性繁殖来维持其稳定。
山生柳聚类分析结果与形态学观察特征基本一致，即说明了遗传本质差异对外部形态特征的对应反应［２６］。
从另一方面证实ＳＳＲ标记稳定可靠，可以利用标记进行物种的遗传多样性的分析。在祁连山脉随着海拔的升高
９１１第２１卷第５期 草业学报２０１２年
呈现出锦鸡儿和山生柳丛生的情况，个体数较多也有利于传粉和繁殖，干扰少从而资源保护很好，山生柳自身在
恶劣的环境下积累了较多的遗传变异，以适应各种环境变异，例如随着海拔的升高山生柳叶片蜡质增多，叶片变
小而厚等。上述结果均表明，群体分布的海拔和纬度差异，一定程度上造成了天然山生柳的分化。同时在本次研
究中，也存在一定的限制性因素，由于取样范围有限，今后的研究中应扩大采集样地，如甘肃省的山丹、苏南、榆
中、青海和四川［２７］，力求进一步揭示山生柳种群生态学特征及其遗传多样性。
结合本研究的结果建议从以下几方面对山生柳资源进行保护：１）就地保护好现有资源，禁止破坏生境，防止
过度的放牧导致山生柳锐减，维护好小环境，建立自然保护区，对山生柳进行监护。２）今后扩大采样范围，从分子
方面探讨山生柳遗传漂变对其分布的影响。进一步揭示山生柳的遗传多样性。３）利用组织培养和扦插繁殖扩大
其栽培面积，最大效益的实现其经济，生态价值。
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犌犪狀狊狌犙犻犾犻犪狀犕狅狌狀狋犪犻狀狊狌狊犻狀犵犛犛犚犿犪狉犽犲狉狊
ＧＵＯＭｉｎ，ＭＡＹａｎｊｕｎ，ＬＩＹｉ
（ＦｏｒｅｓｔｒｙＣｏｌｅｇｅｏｆＧａｎｓｕＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｎｄｇｅｎｅｔｉｃｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆ犛犪犾犻狓狅狉犻狋狉犲狆犺犪 （ａｂｏｕｔ１８０ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓｉｎｔｏｔａｌ）ｆｒｏｍｎｉｎｅ
ａｌｔｉｔｕｄｅｓｏｎｔｈｅＱｉｌｉａｎｍｏｕｎｔａｉｎｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｂｙＳＳＲ（ｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ）ｍａｒｋｅｒｓ．Ｆｉｆｔｅｅｎｈｉｇｈｌｙｓｔａ
ｂｌｅａｎｄｒｅｐｅａｔａｂｌｅＳＳＲｓ（ｓｅｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍ４７ＳＳＲｓｏｆＰｏｐｕｌｕｓ）ｄｅｔｅｃｔｅｄａｔｏｔａｌｏｆ２１１ａｌｅｌｅｓｏｆｗｈｉｃｈ１７６（８５％）
ｗｅｒｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ．Ａｔｔｈｅｓｐｅｃｉｅｓｌｅｖｅｌ，ｔｈｅＳｈａｎｎｏｎｉｎｄｅｘ（犐）ｗａｓ０．４１９２，Ｎｅｉ’ｓｇｅｎｅｄｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎｄｅｘ（犎）
ｗａｓ０．２７９６，ｔｈｅｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｏｆｇｅｎｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（犌狊狋）ｗａｓ０．０９３５，ａｎｄｔｈｅｇｅｎｅｆｌｏｗ（犖犿）ｗａｓ４．８４８７．
Ｔｈｅｒｅｗａｓｍｏｒｅｇｅｎｅｔｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｗｉｔｈｉｎａｌｔｉｔｕｄｅｓｔｈａｎｂｅｔｗｅｅｎａｌｔｉｔｕｄｅｓ．ＡｌｏｆｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｃｌｕｄｅＰ，Ｈ，
ａｎｄＩｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ犛．狅狉犻狋狉犲狆犺犪ｈａｓａｈｉｇｈｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎｔｈｅＧａｎｓｕＱｉｌｉａｎｍｏｕｎｔａｉｎ．Ｃｌｕｓｔｅｒａｎａｌｙｓｉｓ
ｓｈｏｗｅｄａｄｉｒｅｃｔｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｇｅｎｅｔｉｃｄｉｓｔａｎｃｅａｎｄｇｅｏｇｒａｐｈｉｃｄｉｓｔａｎｃｅ．Ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ犛．狅狉犻狋狉犲狆犺犪
ｗａｓｎｏｔａｂｌｙａｆｆｅｃｔｅｄｂｙｔｈｅｌａｔｉｔｕｄｅａｎｄａｌｔｉｔｕｄｅ：ｔｈｅｈｉｇｈｅｒｔｈｅａｌｔｉｔｕｄｅｇｒａｄｉｅｎｔ，ｔｈｅｍｏｒｅａｂｕｎｄａｎｔｔｈｅｇｅｎｅｔ
ｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ犛．狅狉犻狋狉犲狆犺犪．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ＳＳＲ；犛犪犾犻狓狅狉犻狋狉犲狆犺犪；ａｌｔｉｔｕｄｅ；ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｉｌｉｔｙ；ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
１２１第２１卷第５期 草业学报２０１２年