全 文 ：书转果聚糖合成关键酶基因多年生黑麦草
的获得及抗旱性的提高
张小芸１，何近刚１，２，孙学辉１，吴金霞１
（１．中国农业科学院生物技术研究所，北京１０００８１；２．河北省农林科学院遗传生理研究所，河北 石家庄０５００５１）
摘要：以多年生黑麦草（品种卡特）胚性愈伤组织为转化受体，利用农杆菌介导的遗传转化方法将冰草果聚糖：果聚
糖１果糖基转移酶基因（犃犮１犉犉犜）导入黑麦草中，对再生植株喷洒ｂａｓｔａ溶液和ＰＣＲ法检测，共获得１８个阳性株
系，ＲＴ－ＰＣＲ结果表明，该基因在转基因黑麦草中正常表达。转基因黑麦草株系中的可溶性总糖含量和果聚糖含
量明显高于对照植株，耐旱性提高，干旱胁迫６ｄ时其相对含水量和叶绿素含量明显高于对照植株，且下降速度慢，
但其电解质渗漏率和丙二醛含量显著低于对照植株，复水后很快复原，而对照植株无法恢复，说明转基因植株中由
于干旱处理发生的损伤是可逆的，而对照植株中的损伤是非可逆的。以上结果表明，转基因黑麦草中犃犮１犉犉犜 的
表达及果聚糖合成可能是其耐旱性提高的最重要原因。
关键词：多年生黑麦草；冰草；果聚糖：果聚糖１果糖基转移酶基因；果聚糖；抗旱性
中图分类号：Ｓ５４３＋．６０３；Ｑ９４３．２　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１１）０１０１１１０８
　 多年生黑麦草（犔狅犾犻狌犿狆犲狉犲狀狀犲）是在全世界温带地区种植最普遍的草类，是一种重要的冷季型禾草，由于其
易于消化，具有良好的耐放牧性和充足的种子产量，常被用做饲料和草坪草［１，２］。但由于其抗旱、抗寒能力较弱，
导致产量受到严重影响［３］，而植物产生的果聚糖等低分子量渗透调节物质可以增加植物对渗透胁迫的适应和耐
旱性［４］。黑麦草高度自交不育，传统育种技术改良成效甚微，随着生物技术的发展，转基因技术已成为牧草和作
物遗传改良的有效途径［５］，因此，通过转基因技术提高多年生黑麦草的抗旱性，减少逆境胁迫对多年生黑麦草的
损害，对于提高多年生黑麦草的产量具有重要意义。
果聚糖（ｆｒｕｃｔａｎ）是由果糖组成的线型或／和分支型的多聚体，是约１５％的被子植物的重要贮藏碳水化合
物［６］。到目前为止，发现高等植物有５种主要类型的果聚糖，分别是线型菊糖型果聚糖、菊糖型果聚糖新生系列、
线型梯牧草糖型果聚糖、混合型梯牧草糖型果聚糖和梯牧草糖型果聚糖新生系列［７］。果聚糖作为一种渗透调节
物质，在提高植物的抗逆性方面发挥了重要的作用。将果聚糖合成关键酶基因导入果聚糖缺乏的植物中时，会导
致多聚果聚糖的积累，而在积累果聚糖的植物中则产生新的果聚糖。而利用转基因的方法通过调节果聚糖的合
成进行抗逆改良的工作也有进展。Ｅｂｓｔａｍｐ等［８］和ＰｉｌｏｎＳｍｉｔｓ等［９］将枯草芽孢杆菌果聚糖合成酶基因导入烟
草（犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪犮狌犿）植株，发现转基因烟草中果聚糖的积累能明显提高植株的抗旱性。Ｋｎｉｐｐ和 Ｈｏｎｅｒ
ｍｅｉｅｒ［１０］对转基因马铃薯（犛狅犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿）的研究表明，果聚糖这类水溶性碳水化合物代谢途径的引入，可以
显著提高其抗旱性。２００７年，李慧娟等［１１，１２］将莴苣（犔犪犮狋狌犮犪狊犪狋犻狏犪）中克隆的１ＳＳＴ（蔗糖：蔗糖１果糖基转移
酶）基因转入烟草后，转基因烟草的耐寒性和耐旱性均明显提高。
牧草中果聚糖的合成至少涉及了３个重要的酶，蔗糖：蔗糖１果糖基转移酶（ｓｕｃｒｏｓｅ：ｓｕｃｒｏｓｅ１ｆｒｕｃｔｏｓｙｌ
ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，１ＳＳＴ）、果聚糖：果聚糖１果糖基转移酶（ｆｒｕｃｔａｎ：ｆｒｕｃｔａｎ１ｆｒｕｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，１ＦＦＴ）、蔗糖：果聚
糖６果糖基转移酶（ｓｕｃｒｏｓｅ：ｆｒｕｃｔａｎ６ｆｒｕｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，６ＳＦＴ），其中１ＳＳＴ和１ＦＦＴ是菊糖型果聚糖合成
的关键酶。１ＳＳＴ催化果聚糖合成起始，以蔗糖为底物催化生成蔗果三糖等低聚合度的果聚糖，１ＦＦＴ进一步催
化生成不同聚合度的果聚糖，两者协同作用导致不同链长果聚糖分子混合物的形成。而６ＳＦＴ在草和禾谷类植
第２０卷　第１期
Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ 　　
１１１－１１８
２０１１年２月
 收稿日期：２０１００１１８；改回日期：２０１００３０８
基金项目：国家９７３计划项目 （２００７ＣＢ１０８９００）和８６３（２００６ＡＡ１０Ｚ１２４）项目资助。
作者简介：张小芸（１９８５），女，山西吕梁人，硕士。Ｅｍａｉｌ：ｄａｉｓｙ＿ｚｈｘｙ＠１２６．ｃｏｍ
何近刚（１９８２），女，陕西户县人，实习研究员。Ｅｍａｉｌ：ｈｅｊｇ＿７９８２＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｊｉｎｘｉａ＠ｃａａｓ．ｎｅｔ．ｃｎ
物中参与更复杂的果聚糖合成［１３，１４］。
果聚糖合成关键酶基因导入黑麦草的研究也有报道，２００１年，Ｙｅ等［１５］用ＣａＭＶ３５Ｓ和Ｕｂｉ启动子分别调控
来自细菌的狊犪犮犅基因，转化一年生黑麦草，在转基因植株中检测到果聚糖代谢的变化。２００４年，Ｈｉｒｏｓｈｉ等［３］将
从耐寒型小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿）中克隆的１犛犛犜基因和６犛犉犜基因转入黑麦草中，转基因植株的抗寒性明显
提高，而果聚糖合成关键酶基因对黑麦草抗旱性提高的报道较为少见。
本研究通过农杆菌转化的方法将从冰草（犃犵狉狅狆狔狉狅狀犮狉犻狊狋犪狋狌犿）中克隆的１犉犉犜 基因（犃犮１犉犉犜）导入多年
生黑麦草中，同时进行耐旱性试验，探讨通过分子手段培育抗旱性多年生黑麦草新品种的可行性，为改良多年生
黑麦草品质，提高多年生黑麦草抗旱性和扩大其栽培范围奠定理论基础。
１　材料与方法
１．１　菌种与质粒
大肠杆菌（犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻）菌株ＤＨ５α和根癌农杆菌（犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊）菌种ＡＧＬ１均由中国农
业科学院生物技术研究所路铁刚实验室保存。
质粒１犉犉犜ｐＣａｍｂｉａ３３０１带有玉米 Ｕｂｉ启动子驱动的果聚糖：果聚糖１果糖基转移酶（犃犮１犉犉犜）基因，
以抗除草剂犫犪狉基因为筛选标记基因。
本研究中的果糖基转移酶基因１犉犉犜 来源于冰草，根据已报道的小麦、大麦（犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲）的果聚糖：
果聚糖１果糖基转移酶基因（１犉犉犜）保守区设计简并引物，采用５′和３′ｃＤＮＡ末端快速扩增（ｒａｐｉｄａｍｐｌｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡｅｎｄｓ，ＲＡＣＥ）技术扩增得到了包含编码区序列的果糖基转移酶基因犃犮１犉犉犜 全长ｃＤＮＡ，共
１９５０ｂｐ（未发表资料）。
将果糖基转移酶基因犃犮１犉犉犜 用ＢｇｌＩＩ和ＢｂｒｐＩ酶切，回收目的片段连入经过改造的连有Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ片段
的表达载体ｐＣａｍｂｉａ３３０１中，从而构建成具有犃犮１犉犉犜 基因的表达载体犃犮１犉犉犜ｐＣａｍｂｉａ３３０１。图１将
犃犮１犉犉犜ｐＣａｍｂｉａ３３０１用冻融法转入农杆菌菌株ＡＧＬ１。
图１　植物表达载体的犃犮１犉犉犜狆犆犪犿犫犻犪３３０１犜犇犖犃区结构简图
犉犻犵．１　犛犮犺犲犿犪狋犻犮犱犻犪犵狉犪犿狅犳狋犺犲犜犇犖犃狉犲犵犻狅狀狅犳狏犲犮狋狅狉犃犮１犉犉犜狆犆犪犿犫犻犪３３０１
　ＬＢ：ＴＤＮＡ区的左边界；ＲＢ：ＴＤＮＡ区的右边界；犫犪狉基因：能使植物抵抗以ＬＰｈｏｓｐｈｉｏｔｈｒｉｃｉｎ（ＰＰＴ）为活性成分的除草剂，编码ＰＰＴ乙酰转移
酶（ＰＡＴ）；３５Ｓ：花椰菜花叶病毒３５Ｓ启动子；Ｕｂｉ１：玉米泛素基因１启动子；犃犮１犉犉犜：来自冰草的果聚糖：果聚糖１果糖基转移酶基因；ｎｏｓ：胭脂碱
合酶终止子ＬＢ：ＬｅｆｔｂｏｒｄｅｒｏｆＴＤＮＡｒｅｇｉｏｎ；ＲＢ：ＲｉｇｈｔｂｏｒｄｅｒｏｆＴＤＮＡｒｅｇｉｏｎ；犫犪狉：ＥｎａｂｌｅｔｈｅｐｌａｎｔｓｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｔｈｅｈｅｒｂｉｃｉｄｅｗｈｉｃｈｔａｋｅＬ
Ｐｈｏｓｐｈｉｏｔｈｒｉｃｉｎ（ＰＰＴ）ａｓｔｈｅａｃｔｉｖｅｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ，ｅｎｃｏｄｉｎｇＰＰＴａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＰＡＴ）；３５Ｓ：Ｔｈｅｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ（ＣａＭＶ）３５Ｓｐｒｏｍｏｔｅｒ；
Ｕｂｉ１：ＭａｉｚｅＵｂｉｌｐｒｏｍｏｔｅｒ；犃犮１犉犉犜：Ｆｒｕｃｔａｎ：ｆｒｕｃｔａｎ１ｆｒｕｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｆｒｏｍ犃．犮狉犻狊狋犪狋狌犿；ｎｏｓ：ｎｏｓｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｉｓａｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｆｒｏｍｔｈｅｎｏｐａｌｉｎｓｙｎｔｈａｓｅｇｅｎｅ
１．２　转基因多年生黑麦草植株的获得
试验于２００８－２００９年进行，农杆菌介导的多年生黑麦草遗传转化参考王奇丽等［１６］的方法。多年生黑麦草
卡特种子经１００％次氯酸钠（ＮａＣｌＯ）灭菌，取胚置于 ＭＳ（ＭｕｒａｓｈｉｇｅａｎｄＳｋｏｏｇ）培养基上诱导［１７］，形成的幼胚愈
伤组织作为转化受体材料。
将致密的乳黄色颗粒状的胚性愈伤组织在ＯＤ６０００．６～０．８菌液中浸染３０～３５ｍｉｎ，然后转移到共培养基
上，２２℃暗培养４～７ｄ，再转移到选择培养基上，２５℃暗培养，每２周继代１次；经２次继代培养后，将生长旺盛的
抗性愈伤组织转移到分化培养基上，２５℃、１６ｈ、３０００ｌｘ光照培养，２周后新鲜的愈伤组织上开始有抗性绿色芽
２１１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１
点出现，每１５ｄ继代１次，待绿色芽点长成小苗，转移至生根培养基进行生根培养。待长出粗壮的根后，开盖炼
苗１周，移栽至温室土壤中。
１．３　转基因植株的ｂａｓｔａ抗性与分子鉴定
移栽于温室的转基因再生植株长至１０ｃｍ高时，将浓度为５‰的ｂａｓｔａ溶液均匀地喷施于黑麦草植株的叶片
上，２周后观察叶片生长状态，叶片保持正常生长状态的植株为标记基因犫犪狉正常表达的转基因植株，而叶片枯
萎或死亡的植株则为非转基因植株。采用十六烷基三甲基溴化铵（ｃｅｔｙｌｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｎｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ，ＣＴＡＢ）法
小量提取犫犪狉基因正常表达的转基因植株基因组ＤＮＡ，根据犃犮１犉犉犜 基因序列设计引物Ｐ１：５′ＧＧＡＣＧＡＡＣ
ＣＴＣＡＴＣＣＡＡＴＧＧ３′和Ｐ２：５′ＧＡＡＣＡＧＧＴＡＧＡＣＣＣＣＡＧＣＣＧ３′用于聚合酶链式反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅ
ａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）检测。取ＰＣＲ阳性植株及野生型黑麦草植株叶片，采用Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ［１８］的Ｔｒｉｚｏｌ法提取总ＲＮＡ，
ＲＴ－ＰＣＲ检测外源基因在黑麦草中的表达，内参犃犮狋犻狀引物序列为Ｐ１：５′ＴＴＣＣＡＡＴＣＴＡＣＧＡＧＧＧＡＴＡＣＡ
ＣＡＣ３′，Ｐ２：５′ＧＧＣＡＴＣＴＣＡＴＡＧＣＴＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡ３′，犃犮１犉犉犜 引物序列仍为 Ｐ１：５′ＧＧＡＣＧＡＡＣＣＴ
ＣＡＴＣＣＡＡＴＧＧ３′和Ｐ２：５′ＧＡＡＣＡＧＧＴＡＧＡＣＣＣＣＡＧＣＣＧ３′。
１．４　转基因植株的抗旱性鉴定及生理生化的测定
采用分蘖拆分方法从转ｐＣａｍｂｉａ３３０１空载体（不含犃犮１犉犉犜 基因的骨架载体）的黑麦草植株与转犃犮１
犉犉犜ｐＣａｍｂｉａ３３０１黑麦草植株中分出长势一致的分蘖移栽到盛有等量土样（草炭土∶蛭石为３∶２）的花盆中于
日光温室内进行无性繁殖，培养１５ｄ后开始干旱处理，选取生长状态一致的转ｐＣａｍｂｉａ３３０１空载体的黑麦草植
株与表达量较高的转犃犮１犉犉犜ｐＣａｍｂｉａ３３０１黑麦草３个株系各３株，浇水至饱和后，停止浇水，约８ｄ后待盆中
土干视为干旱开始，分别在正常浇水、干旱胁迫３和６ｄ，以及复水７ｄ时取样测定生理指标。每株系测定３株。
试验于２００９年６－１０月在中国农业科学院生物技术研究所温室内进行，共重复３次。
饱和称重法测定叶片的相对含水量（ｒｅｌａｔｉｖｅｗａｔｅｒｃｏｎｔｅｎｔ，ＲＷＣ），电导率法测定电解质渗漏率，硫代巴比
妥酸比色法测定丙二醛含量，蒽酮比色法测定可溶性糖含量，茚三酮法测定脯氨酸含量，具体操作过程参照王晶
英等［１９］的方法，丙酮浸提法测定叶绿素含量，具体过程参照李得孝等［２０］的方法，间苯二酚法测定果聚糖含量，具
体过程参照刘燕琼和黄雪松［２１］的方法。
２　结果与分析
２．１　转Ａｃ１ＦＴＴ多年生黑麦草的获得
由胚诱导的多年生黑麦草愈伤（图２Ａ）经农杆菌侵染后置于选择培养基［ＭＳ基本培养基＋５ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ＋
３ｍｇ／Ｌ双丙氨磷（ｂｉａｌｏｐｈａｓ）］中，１２ｄ左右开始长出新鲜的抗性愈伤组织（图２Ｂ），继代１次后将其转入分化培
养基［ＭＳ＋０．５ｍｇ／Ｌ６苄氨基嘌呤（６ＢＡ）＋０．１ｍｇ／Ｌ１萘乙酸（ＮＡＡ）＋３ｍｇ／Ｌ双丙氨磷）］中，１０ｄ左右开
始长出抗性绿芽（图２Ｃ，Ｄ），继代１次，当绿芽长到１ｃｍ左右，将其置于生根培养基（１／２ＭＳ）上，１０ｄ左右抗性绿
芽分化出根（图２Ｅ，Ｆ），待根长粗壮以后，移植入温室育秧盘中（图２Ｇ）。再生植株表型与未转基因植株无明显差
异。
２．２　再生植株的筛选
待移栽至温室的转基因再生植株生长至１０ｃｍ高时，将浓度为５‰的ｂａｓｔａ溶液均匀喷洒于整株叶片上，２
周后观察，叶片萎蔫、枯黄的为非转基因植株，而叶片保持绿色，正常生长的为转基因植株（图３）。经过５‰的
ｂａｓｔａ溶液均匀喷洒后，从选择培养基上选出的再生的１２２个独立株系中只有１８个株系存活。
２．３　转基因植株的分子鉴定
利用ＣＴＡＢ法提取ｂａｓｔａ喷洒后正常生长的转基因再生植株叶片ＤＮＡ，以其为模板，根据１犉犉犜 基因的部
分序列设计引物，以犃犮１犉犉犜ｐＣａｍｂｉａ３３０１质粒为阳性对照，ｐＣａｍｂｉａ３３０１空载体植株的基因组ＤＮＡ为阴性
对照进行ＰＣＲ验证，结果见图４Ａ。ｐＣａｍｂｉａ３３０１空载体植株中没有扩增出产物，犃犮１犉犉犜ｐＣａｍｂｉａ３３０１转基
因植株得到５５７ｂｐ的条带。说明外源基因犃犮１犉犉犜 基因已整合到黑麦草基因组的 ＤＮＡ中。经过ｂａｓｔａ溶液
喷洒后存活的１８个株系全部表现为ＰＣＲ阳性。
３１１第２０卷第１期 草业学报２０１１年
图２　农杆菌介导犃犮１犉犉犜基因导入多年生黑麦草中获得再生植株
犉犻犵．２　犅犻犪犾犪狆犺狅狊狉犲狊犻狊狋犪狀狋狆犾犪狀狋狊犫狔犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿犿犲犱犻犪狋犲犱狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狋犻狅狀狅犳
犳狉狌犮狋犪狀：犳狉狌犮狋犪狀１犳狉狌犮狋狅狊狔犾狋狉犪狀狊犳犲狉犪狊犲犳狉狅犿犔．狆犲狉犲狀狀犲
　Ａ：胚性愈伤组织；Ｂ：选择培养基上的抗性愈伤组织；Ｃ－Ｄ：分化培养基上的抗性愈伤组织；Ｅ－Ｆ：生根培养基上的转基因苗；Ｇ：温室种植的转基因
黑麦草再生植株Ａ：Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｃａｌｕｓｕｓｅｄｆｏｒｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ；Ｂ：Ｃａｌｕｓｉｎｓｅｌｅｃｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍ；Ｃ，Ｄ：Ｒｅｓｉｓｔａｎｔｃａｌｕｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍ；Ｅ，
Ｆ：Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｉｎ１／２ＭＳｍｅｄｉｕｍ；Ｇ：Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｒｙｅｇｒａｓｓｐｌａｎｔｓｉｎｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ
提取ＰＣＲ阳性植株和对照植株的ＲＮＡ，通过ＲＴ
图３　喷施犫犪狊狋犪溶液２周后黑麦草植株的表现
犉犻犵．３　犜犺犲狉犲狊犻狊狋犪狀犪狀犮犲狆犲狉犳狅狉犿犪狀犮犲狅犳犔．狆犲狉犲狀狀犲狆犾犪狀狋狊
狋狑狅狑犲犲犽狊犪犳狋犲狉犫犪狊狋犪狊狆狉犪狔
　　　１：非转基因植株，２：转犃犮１犉犉犜ｐＣａｍｂｉａ３３０１植株１：Ｎｏｎｔｒａｎｓ
ｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ，２：犃犮１犉犉犜ｐＣａｍｂｉａ３３０１ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ
－ＰＣＲ检测犃犮１犉犉犜 基因在黑麦草中的表达情况，
结果显示，ｐＣａｍｂｉａ３３０１空载体对照植株没有扩增到
目标条带，犃犮１犉犉犜ｐＣａｍｂｉａ３３０１转基因植株均能
扩增到５５７ｂｐ的目的片段，表明犃犮１犉犉犜 基因在转
基因黑麦草植株中得到正常表达，且表达量在不同株
系间存在一定的差异（图４Ｂ）。
２．４　干旱处理对叶片相对含水量、叶绿素含量、电解
质渗漏率和丙二醛含量的影响
以长势一致的野生型植株和转ｐＣａｍｂｉａ３３０１空
载体转基因植株（不含犃犮１犉犉犜 基因的骨架载体）为
对照，对犃犮１犉犉犜 转基因植株进行干旱处理，持续不
浇水约８ｄ后，盆中土干，干旱胁迫开始。３ｄ后，对照
植株萎蔫，叶片皱缩，失水严重，而犃犮１犉犉犜 转基因
植株缺水状况不明显；干旱６ｄ时对照植株叶片枯黄，犃犮１犉犉犜 转基因植株叶片仍保持绿色，部分植株叶片开始
失水，有少量枯叶出现。复水１周后对照植株大部分死亡，而犃犮１犉犉犜 转基因苗恢复较快，长势良好（图５）。对
处理植株的生理指标检测表明：犃犮１犉犉犜 转基因多年生黑麦草和对照植株的叶片相对含水量与叶绿素含量随着
干旱胁迫程度的增加均呈下降趋势。干旱胁迫３ｄ后，犃犮１犉犉犜 转基因黑麦草和对照的叶片相对含水量均有下
降，但对照植株下降程度较明显；对照植株的叶绿素含量相比处理前下降了５０％，而犃犮１犉犉犜 转基因植株则略
有下降；干旱胁迫６ｄ后，犃犮１犉犉犜 转基因黑麦草叶片相对含水量与处理前相比下降了３１．７％～４１．４％，而对照
植株下降更为显著，达到６９．４％；叶绿素下降趋势与相对含水量相同，犃犮１犉犉犜 转基因植株下降了３３．１％～
３８．５％，而对照植株下降了６６．７％；复水７ｄ后，犃犮１犉犉犜 转基因植株的相对含水量与叶绿素含量均恢复到比处
理前略低的水平，而对照植株的２项指标继续下降，无法恢复（图６Ａ和Ｂ）。叶片的电解质渗漏率和丙二醛含量
随干旱胁迫程度的增加均呈上升趋势。干旱处理３ｄ后，犃犮１犉犉犜 转基因黑麦草的电解质渗漏率和丙二醛含量
均上升，而对照植株的上升程度更加明显，其中电解质渗漏率比干旱前增加了７倍多；干旱处理６ｄ后，犃犮１犉犉犜
转基因叶片的电解质渗漏率与丙二醛含量比胁迫前均增加了２倍多，而对照植株的电解质渗漏率上升到干旱前
的９倍左右，丙二醛含量达到４倍；复水７ｄ后，犃犮１犉犉犜 转基因植株的电解质渗漏率和丙二醛含量比干旱６ｄ
时均明显下降，对照植株的电解质渗漏率与干旱６ｄ时接近，丙二醛含量略有下降（图６Ｃ和Ｄ）。
４１１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１
图４　转基因植株的犘犆犚检测（犃）和犚犜－犘犆犚检测犃犮１犉犉犜基因在多年生黑麦草中的表达（犅）
犉犻犵．４　犜犺犲犘犆犚犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳狋犺犲狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狆犾犪狀狋狊（犃）犪狀犱犚犜－犘犆犚犪狀犪犾狔狊犻狊犳狅狉
犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狅犳犃犮１犉犉犜犵犲狀犲犻狀狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮犔．狆犲狉犲狀狀犲（犅）
　图Ａ，Ｍ：１００ｂｐＤＮＡｍａｒｋｅｒ；１：质粒犃犮１犉犉犜ｐＣａｍｂｉａ３３０１（阳性对照）；２：水（阴性对照）；３：ｐＣａｍｂｉａ３３０１空载体转基因植株 （阴性对照）；４－
１１：犃犮１犉犉犜ｐＣａｍｂｉａ３３０１转基因再生植株。图Ｂ，１：ｐＣａｍｂｉａ３３０１空载体转基因植株；２－８：犃犮１犉犉犜ｐＣａｍｂｉａ３３０１转基因植株 Ｆｉｇ．Ａ，Ｍ：１００
ｂｐＤＮＡｍａｒｋｅｒ；１：犃犮１犉犉犜ｐＣａｍｂｉａ３３０１ｐｌａｓｍｉｄ（ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ）；２：Ｈ２Ｏ（ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ）；３：ｐＣａｍｂｉａ３３０１ｅｍｐｔｙｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ（ｎｅｇａ
ｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ）；４－１１：犃犮１犉犉犜ｐＣａｍｂｉａ３３０１ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ．Ｆｉｇ．Ｂ，１：ｐＣａｍｂｉａ３３０１ｅｍｐｔｙｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ；２－８：犃犮１犉犉犜ｐＣａｍｂｉａ３３０１
ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ
图５　转基因植株的干旱处理
犉犻犵．５　犜狉犪狀狊犵犲狀犻犮犔．狆犲狉犲狀狀犲狌狀犱犲狉犱狉狅狌犵犺狋狊狋狉犲狊狊
　１：野生型；２：转ｐＣａｍｂｉａ３３０１空载体黑麦草；３～５：不同株系的转犃犮１犉犉犜 基因黑麦草。Ａ：干旱处理前；Ｂ：干旱处理３ｄ；Ｃ：干旱处理６ｄ；Ｄ：复水
７ｄ１：Ｗｉｌｄｔｙｐｅ；２：ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃｒｙｅｇｒａｓｓｗｉｔｈｐＣａｍｂｉａ３３０１ｗｉｔｈｏｕｔ犃犮１犉犉犜；３－５：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｉｎｅｓｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ犃．犮狉犻狊狋犪狋狌犿 ｗｉｔｈ犃犮１犉犉犜
ｐＣａｍｂｉａ３３０１．Ａ：Ｂｅｆｏｒｅｄｒｏｕｇｈｔｓｔｒｅｓｓｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ；Ｂ：３ｄａｙｓａｆｔｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔ；Ｃ：６ｄａｙｓａｆｔｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔ；Ｄ：Ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎｆｏｒ７ｄ
２．５　干旱处理对叶片糖分含量的影响
转基因多年生黑麦草叶片中的可溶性总糖含量与果聚糖含量随胁迫程度增加均呈上升趋势。干旱胁迫前，
转基因植株的可溶性糖含量与果聚糖含量均高于对照植株，其中转基因多年生黑麦草的果聚糖含量是对照的１．５
～１．８倍，说明转犃犮１犉犉犜 基因提高了黑麦草的果聚糖含量。干旱胁迫３ｄ后，转基因植株的可溶性糖含量与
果聚糖含量均呈上升趋势，比对照植株上升程度更加明显；干旱胁迫６ｄ后，转基因多年生黑麦草的可溶性糖含
量比处理前增加了２倍左右，果聚糖含量增加了２．５～３．１倍，对照植株的２项指标明显低于转基因植株；复水７
ｄ后，转基因多年生黑麦草和对照植株的可溶性糖含量与果聚糖含量均比干旱６ｄ时明显下降，但仍高于处理
前。
３　讨论
大量研究表明，当植物处于干旱等逆境条件下时，原生质体结构受到伤害引起透性增大，细胞内含物将有不
５１１第２０卷第１期 草业学报２０１１年
图６　干旱胁迫下的多年生黑麦草叶片相对含水量（犃）、叶绿素含量（犅）、电解质渗漏率（犆）和丙二醛（犕犇犃）含量（犇）变化
犉犻犵．６　犜犺犲犮犺犪狀犵犲狅犳狉犲犾犪狋犻狏犲狑犪狋犲狉犮狅狀狋犲狀狋（犃），犮犺犾狅狉狅狆犺狔犾犮狅狀狋犲狀狋（犅），犲犾犲犮狋狉狅犾狔狋犲犾犲犪犽犪犵犲（犆）犪狀犱犿犪犾狅狀犱犻犪犾犱犲犺狔犱犲（犕犇犃，犇）
狅犳狆犆犪犿犫犻犪３３０１犲犿狆狋狔狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狆犾犪狀狋狊犪狀犱犃犮１犉犉犜狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮犔．狆犲狉犲狀狀犲狌狀犱犲狉犱狉狅狌犵犺狋狋狉犲犪狋犿犲狀狋
　ＣＫ：转ｐＣａｍｂｉａ３３０１多年生黑麦草；Ｌ１～Ｌ３：转犃犮１犉犉犜 基因多年生黑麦草 ＣＫ：Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ犔．狆犲狉犲狀狀犲ｗｉｔｈｐＣａｍｂｉａ３３０１ｗｉｔｈｏｕｔ犃犮１犉犉犜；
Ｌ１－Ｌ３：Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ犔．狆犲狉犲狀狀犲ｗｉｔｈ犃犮１犉犉犜
图７　干旱胁迫下多年生黑麦草叶片可溶性总糖（犃）、果聚糖（犅）含量的变化
犉犻犵．７　犜犺犲犮犺犪狀犵犲狅犳狑犪狋犲狉狊狅犾狌犫犾犲犮犪狉犫狅犺狔犱狉犪狋犲（犃），犳狉狌犮狋犪狀犮狅狀狋犲狀狋（犅）狌狀犱犲狉犱狉狅狌犵犺狋狊狋狉犲狊狊狋狉犲犪狋犿犲狀狋狊
　ＣＫ：转ｐＣａｍｂｉａ３３０１空载体多年生黑麦草；Ｌ１～Ｌ３：转犃犮１犉犉犜 基因多年生黑麦草ＣＫ：Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ犔．狆犲狉犲狀狀犲ｗｉｔｈｐＣａｍｂｉａ３３０１ｅｍｐｔｙｖｅｃｔｏｒ；
Ｌ１－Ｌ３：Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ犔．狆犲狉犲狀狀犲ｗｉｔｈ犃犮１犉犉犜
同程度的外渗，电解质渗透率即可反映膜损伤的程度。而逆境引起的植物细胞内活性氧的富集会引发细胞的膜
脂过氧化作用，丙二醛（ＭＤＡ）是膜脂过氧化作用的主要产物之一，具有很强的细胞毒性，对膜和细胞中的许多生
物功能分子如蛋白质、核酸和酶等均有很强的破坏作用，并参与破坏生物膜的结构与功能，其含量作为膜脂过氧
化指标表示植物对逆境条件反应的强弱［２２］，干旱胁迫使植物中叶绿体破坏［２３］，叶绿素合成受阻，叶绿素的降解加
６１１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１
速，使叶绿素含量降低［２４］。
本试验中，干旱胁迫前转基因多年生黑麦草与对照植株相对含水量、叶绿素含量、电解质渗透率和丙二醛含
量差异并不明显，随着干旱程度的加深，对照植株的相对含水量与叶绿素含量显著下降，且复水后不能恢复，而电
解质渗透率上升到干旱前的９倍左右，丙二醛含量达到４倍（图６Ｃ和Ｄ）。这表明干旱胁迫引起植物细胞的膜脂
过氧化作用，生物膜结构遭到破坏，细胞电解质外渗。相比对照植株，干旱胁迫后转基因多年生黑麦草的相对含
水量与叶绿素含量下降趋势较缓，电解质渗透率和丙二醛含量也显著低于对照植株，而且复水后各项指标又接近
处理前的水平，说明转基因植株中由于干旱处理发生的损伤是可逆的，而在对照植株中的损伤是非可逆的。
研究表明，面对干旱胁迫时，植物会有自身的防御机制，糖和糖醇类等渗透调节物质的积累可以减轻细胞对
缺水的敏感性，增强植物对胁迫的耐受力。有研究表明，在胁迫处理条件下，果聚糖能维持脂质体在低温和干旱
条件下相态的改变，脂类相态的改变可提高膜的通透性，修复胁迫对膜的损害，有效地稳定膜结构［２５］。而本试验
中犃犮１犉犉犜 转基因多年生黑麦草的可溶性总糖含量和果聚糖含量在干旱胁迫时显著上升，且明显高于对照植
株，复水后两者含量又有所回落。由此推出犃犮１犉犉犜 转基因多年生黑麦草耐旱性提高的原因可能与犃犮１犉犉犜
基因表达及果聚糖合成与积累有关。
果聚糖是许多牧草植物产生并储存可溶性碳水化合物的主要形式。可溶性碳水化合物水平的升高将抑制由
于木质化引起的可消化性的降低，而且牧草中非结构性碳水化合物浓度的增加，将导致反刍动物对牧草的吸收，
在瘤胃中对蛋白质的获取和活体重增加。此外，果聚糖还有许多重要生理功能如调节植物适应低温光合作用、调
控植物蔗糖分配等。本研究从抗旱性和抗寒性较强的冰草中克隆果聚糖合成酶相关基因犃犮１犉犉犜，导入多年生
黑麦草中，进一步改良了多年生黑麦草的品质，提高了其抗旱性，为增强多年生黑麦草的营养价值、扩大其栽培范
围打下了良好的基础，有着重要的应用前景。
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犃犵狉狅狆狔狉狅狀犮狉犻狊狋犪狋狌犿犪狀犱犲狀犺犪狀犮犲犿犲狀狋狅犳犱狉狅狌犵犺狋狋狅犾犲狉犪狀犮犲犻狀狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狆犾犪狀狋狊
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犃犫狊狋狉犪犮狋：犃犮１犉犉犜 （ｆｒｕｃｔａｎ：ｆｒｕｃｔａｎ１ｆｒｕｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）ｃｌｏｎｅｄｆｒｏｍ 犃犵狉狅狆狔狉狅狀犮狉犻狊狋犪狋狌犿 ｗａｓｔｒａｎｓ
ｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｃａｌｕｓｌｉｎｅｓｏｆ犔狅犾犻狌犿狆犲狉犲狀狀犲ｕｓｉｎｇａｎ犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿 ｍｅｄｉａｔｅｄｍｅｔｈｏｄ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｐｌａｎｔｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｂｙｂａｓｔａｓｐｒａｙｉｎｇａｎｄＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｉｎｔｏｔａｌ，１８ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｌｉｎｅｓｗｅｒｅ
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ｔｏｌｅｒａｎｃｅ
８１１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１