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Cloning and Expression Analysis of ChWRKY28 from Corylus heterophylla Fisch

平榛ChWRKY28基因克隆及表达模式分析



全 文 :林业科学研究 2016,29(2):250 255
ForestResearch
  文章编号:10011498(2016)02025006
平榛 ChWRKY28基因克隆及表达模式分析
赵天田,梁丽松,马庆华,王贵禧
(中国林业科学研究院林业研究所,国家林业局林木培育重点实验室,林木遗传育种国家重点实验室,北京 100091)
收稿日期:20141203    修回日期:20151124
基金项目:国家自然基金(31500555);林业公益性行业科研专项(201304710);林业科学技术推广项目[2014]3号
作者简介:赵天田(1984—),男,博士,主要从事榛属植物抗逆遗传育种方面的研究.Email:zhaotian1984@163.com
 通讯作者:研究员.Email:wanggx0114@126.com
摘要:[目的]研究平榛ChWRKY28基因序列特征及其在不同非生物胁迫下的表达规律。[方法]以平榛为试材,采
用RACEPCR方法进行基因克隆;利用实时荧光定量PCR方法检测基因在不同组织及不同非生物胁迫下的表达模
式。[结果]表明:克隆得到的WRKY基因,全长1342bp,基因内部包含1个长963bp的完整开放阅读框,编码320
个氨基酸残基,命名为ChWRKY28。构建的系统发育树表明:该序列与拟南芥 AtWRKY28及杨树 PtrWRKY93的关
系最近,相似性分别为49%和60%。基因表达分析表明:ChWRKY28在雄花序、雌花芽及茎中均有表达,但在茎部
(皮)中的表达量高于雄花序和雌花芽中的表达量,具有组织表达特异性;低温、干旱及盐胁迫均能诱导 ChWRKY28
基因的表达,但受诱导程度存在差异。亚细胞定位分析结果表明:ChWRKY28蛋白分布在细胞核内,是一个核蛋
白。[结论]推测ChWRKY28基因可能参与植物响应非生物胁迫的信号转导过程。
关键词:平榛;转录因子;克隆;亚细胞定位;表达
中图分类号:S71846 文献标识码:A
CloningandExpressionAnalysisofChWRKY28from
CorylusheterophylaFisch
ZHAOTiantian,LIANGLisong,MAQinghua,WANGGuixi
(StateKeyLaboratoryofTreeGeneticsandBreeding,KeyLaboratoryofSilvicultureofStateForestryAdministration,
ResearchInstituteofForestry,ChineseAcademyofForestry,Beijing 100091,China)
Abstract:[Objective]ToanalyzethesequencefeaturesandexpressionrulesofWRKYgenefromCorylusheterophyl
laFisch.[Method]ThegenewasclonedbyRACEPCR.QuantitativerealtimePCRwasusedinanalyzinggene
expressioninvarioustissuesanddiferentabioticstresses,includingcold,highsalinityanddrought.[Result]The
cDNAofWRKYis1342bpinlength,includingacompleteopenreadingframe(ORF)of963bpencodingapro
teinof320aminoacids,designatedasChWRKY28.PhylogenytreeresultsshowedChWRKY28wasmuchcloserto
AtWRKY28fromArabidopsisthalianaandPtrWRKY93fromPopulustrichocarpa,generated49% and60% amino
acidssimilarity.SpatialexpressionanalysesdemonstratedthattheexpressionlevelofChWRKY28washigherinstem
thanthatinmaleanthotaxyandfloralbudswhichindicatingtissuespecificexpression.ChWRKY28wasclearlyin
ducedbycold,highsalinityanddrought,butthattheexpressiontendencywereevidentlydiferentofthisgene.The
subcelularlocalizationanalysisshowdthatChWRKY28proteinwastargetedtothenucleus.[Conclusion]Thisstud
yindicatedthatChWRKY28genemaybeinvolvedinresponsetoabioticstresssignaltransductionpathway.
Keywords:CorylusheterophylaFisch;transcriptionfactors;clone;subcelularlocalization;expression
平榛(CorylusheterophylaFisch.)为榛科(Cory
laceae)榛属(CorylusL.)植物,广泛分布于我国的华
北、东北地区,其榛仁富含不饱和脂肪酸、蛋白质、维
生素 A、B、E等,具有较高的营养价值和经济价
第2期 赵天田,等:平榛ChWRKY28基因克隆及表达模式分析
值[1-2]。据世界粮农组织的统计数据,目前,我国带
壳榛子的年产量约2.3万t(htp://www.fao.org/do
crep/003/x4484E/x4484e03.htm),其中,平榛贡献
了超过70%的产量[3]。此外,平榛在水土保持和维
持生态平衡方面也发挥了重要的作用。平榛是我国
榛属植物资源中最有经济价值的一个种,它具有高
产、早熟、抗东方枯萎病及抗寒性强等优点[4]。目
前,在世界范围内(主要是黑海和地中海沿岸)广泛
种植的是欧洲榛(CorylusavelanaL.),但是欧洲榛
抗寒性较差,在我国的引种试验中发现:欧洲榛雌花
芽、雄花序等易受低温的伤害,造成枯死、抽干等现
象,从而影响坚果的产量,造成经济损失[5];而平榛
能够忍耐最低 -48℃的极端低温[6],抗寒能力远强
于欧洲榛。因此,对平榛响应逆境胁迫尤其是低温
胁迫的机制进行研究,将对今后培育抗寒性强的榛
子新品种具有重要意义。
目前,关于平榛响应逆境胁迫机制的研究才刚刚
开始[7],而植物中的转录因子家族在植物抵御外界逆
境胁迫上具有重要作用[8],转录因子可以通过激活或
抑制目标基因的表达,来感知或转导外部刺激[9]。
WRKY作为植物中最重要的转录因子家族之一,除参
与植物的生长发育、衰老、抗病等一系列生理活动外,
还参与植物对环境胁迫的应答反应,如低温、干旱、高
盐等非生物胁迫。WRKY蛋白典型的特征是含有保
守的WRKY结构域,该结构域一般由60个氨基酸残
基组成,在 N端含有高度保守的氨基酸序列
WRKYGQK,在 C端含有 C2H2 或 C2HC锌指结
构[10-12]。自从在甘薯(Ipomoeabatatas(L.)Lam.)中
首次克隆得到WRKY转录因子开始[13],陆续在其他
植物如拟南芥(Arabidopsisthaliana(L.)Heynh.)、水
稻(OryzasativaL.)、玉米(ZeamaysL.)、葡萄(Vitis
viniferaL.)中得到了WRKY转录因子。该转录因子
可以通过识别靶基因启动子上的特定序列Wbox(C/
TTGACC/T)来调控靶标基因的表达,进而调控植物
做出应对各种生物和非生物胁迫的变化[14-15]。
目前,在其他榛属植物中未见关于 WRKY转录
因子的报道,本研究根据平榛花芽转录组的测序结果
(NCBISRA数据库,登录号:SRX529300)[16],筛选
并克隆得到1个WRKY转录因子,通过构建WRKY
YFP表达载体,对其进行亚细胞定位分析,以确定获
得的WRKY是否为核定位转录因子。另外,进一步
对该转录因子在自然低温胁迫、不同逆境胁迫及不同
组织中的表达特性进行分析。通过上述研究来探讨
平榛WRKY转录因子响应逆境胁迫的机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料及处理
1.1.1 自然越冬平榛花芽中 WRKY基因表达分析
材料的处理 用于实验的平榛雌花芽取自河北木兰
围场国有林场(41°58’N,117°40’E),于2011年
11月至2012年4月每隔1个月取1次,材料用液氮
冻干后,存于-80℃冰箱。
1.1.2 非生物胁迫平榛 WRKY基因表达分析材料
的处理 参考 Wang等[17]的方法,将平榛苗植于花
盆中(沙子∶草炭 =1∶2(v/v)),放置温室培养2个
月(光照时间16h昼/8h夜,光照强度100μmol·
m-2·s-1,温度 25℃);然后分别进行 4℃低温、旱
(质量浓度为25%的PEG6000)及盐处理(400mmol
·L-1的NaCl),在处理2、8、24h后采集叶位相同的
叶片(完全展开的第4 5片叶),以未处理的做对
照,每个处理设3个重复。
1.1.3 平榛不同组织器官中 WRKY基因表达分析
材料的处理 在1月份分别取平榛的雌花芽、雄花
序及茎段,分析 WRKY基因在不同组织器官中的表
达特性。
1.2 方法
1.2.1 平榛WRKY基因的克隆与序列分析 利用
CTAB法进行总RNA提取[18],采用 SMARTTMRACE
(Clontech公司,美国)试剂盒进行反转录,得到第一
链作为RACE扩增的模板。根据平榛花芽转录组的
测序结果[16],获得1个 Unigene序列,通过 Blast比
对分析,推测其可能是1个 WRKY基因,利用 Prim
er5设计引物,引物见表1。以反转录得到的 cDNA
为模板,采用 TouchdownPCR程序进行扩增,扩增
产物进行凝胶回收,连接载体、转化、蓝白斑筛选及
菌落PCR鉴定后,送生物公司进行测序。将获得的
序列在NCBI数据库进行 Blast比对,确定所克隆的
基因为WRKY基因。用 DNAMAN6.0和 ProtParam
(htp://www.expasy.org)预测编码蛋白的分子量、
理论等电点。利用 MEGA5.20软件的最大似然法
(MaximumLikelihood)(Bootstrap值为1000)构建系
统进化树,用于比对的 PtrWRKY(杨树)和 AtWRKY
(拟南芥)蛋白序列分别从Phytozomev10.2和TAIR
9.0数据库获得。使用软件 EukmPLoc2.0(ht
tp://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/eukmulti2/)进
行亚细胞定位预测。
152
林 业 科 学 研 究 第29卷
1.2.2 WRKYYFP表达载体的构建 首先扩增出
WRKY基因的编码区序列,去除终止子后,连接
pEarlyGate101,利用 Gateway克隆系统构建好35S::
ChWRKY28YFP重组载体,转化农杆菌,农杆菌离
心后,用10mmol·L-1的 MgCl2溶液(含100μmol
·L-1的乙酰丁香酮)重悬,注射烟草下表皮,然后利
用LSM510共聚焦激光扫描显微镜观察荧光。烟草
植株在短日照条件下(8h昼/16h夜)培养。
1.2.3 平榛WRKY基因的表达分析 提取处理材
料的RNA,以反转录后的cDNA为模板,进行实时荧
光定量 PCR分析。用于实时荧光定量 PCR分析的
特异引物 WRKYF和 WRKYR及内参基因引物 Ac
tinF和ActinR见表1。参照SYBRPremixExTaqTM
(PerfectRealTime)说明书,扩增程序为:95℃预变
性3min;95℃变性20s,53℃退火20s,72℃延伸20
s,共39个循环;65℃到95℃30s结束。反应在Bio
RadCFX96PCR仪上进行,每个处理设3次重复。
   表1 平榛WRKY基因克隆及表达分析引物
引物名称 引物序列 引物作用
3′RACE 5′GGGAGCCACGGTTTGCCTTCATGACC3’ 3′末端扩增
5′RACE 5’GCATTTCCTCTGAGCGTTGCGGGAA3’ 5′末端扩增
WRKYF 5’GCTGGTTCATCAGCATACAAT3’ 检测WRKY
WRKYR 5’GGCACTTGCCAATGAGTTGT3’ 的表达
ActinF 5’TGGTCAAGGCTGGGTTTGC3’
扩增内标
ActinR 5’CTGACCCATCCCAACCATGA3’
2 结果与分析
2.1 WRKY转录因子的克隆与氨基酸序列分析
通过分析平榛花芽转录组测序数据,获得1个
预测为 WRKY转录因子的 Unigene序列,根据序列
设计3’端特异引物,RACEPCR后,得到3’端序列,
长度为578bp;然后根据3’端序列设计引物获得5’
端序列,长度为846bp;最后通过扩增,获得1条编码
区为1342bp的全长序列(图1)。Blast比对发现:该
序列与WRKY转录因子同源,暂命名为ChWRKY28。
下划线表示起始密码子和终止密码子;虚线表示锌指结构;C表示锌指结构的半胱氨酸,
H表示锌指结构的组氨酸;斜体表示ChWRKY28保守域。
图1 ChWRKY28氨基酸序列分析
252
第2期 赵天田,等:平榛ChWRKY28基因克隆及表达模式分析
分析显示:该基因含有1个963bp的开放阅读框,
编码有320个氨基酸,其理论等电点(pI)和分子量
分别为7.30和35.06kDa。该基因的氨基酸序列包
含1个 WRKY保守域及1个 C2H2(CX4CX23H
X1H)锌指结构域(图1),属于 WRKY转录因子家
族中的第二类型。利用DNAMAN结合NCBI数据库
Blast比对发现:ChWRKY28分别与拟南芥和杨树
WRKY家族中的 AtWRKY28和 PtrWRKY93的相似
性较高,序列同源性分别达 49%和 60%,与 Ptr
WRKY28的相似性也达51%。利用 MEGA软件构
建包括 ChWRKY28及数据库中获得的杨树 Ptr
WRKY(I)和拟南芥 AtWRKY(I)氨基酸序列的系
统发育树。结果(图2)表明:ChWRKY28被分到第
I类型中的 Ic亚类,并与杨树的 PtrWRKY28、Ptr
WRKY71、PtrWRKY92和 PtrWRKY93以及拟南芥的
AtWRKY8、AtWRKY28和 AtWRKY71聚类到一个
分支。
2.2 WRKYYFP融合蛋白在烟草表皮细胞中的
表达分析
  利用 EukmPLoc2.0软件对 ChWRKY28进行
亚细胞定位预测,预测结果定位于细胞核。为了验
证上述预测结果的准确性,构建35S::ChWRKY28
YFP重组载体,注射烟草下表皮,然后利用共聚焦激
图2 ChWRKY28与杨树及拟南芥WRKY蛋白
序列的进化树分析
光扫 描 显 微 镜 观 察 荧 光。结 果 表 明:35S::
ChWRKY28YFP重组质粒侵染的细胞,只有在细胞
核上有荧光信号(图3),说明 ChWRKY28是核定位
蛋白,与通过软件预测的结果一致,也与ChWRKY28
作为一个转录因子的功能相符合。
图3 ChWRKY28的亚细胞定位分析(图中箭头所指为细胞核)
2.3 ChWRKY28基因在自然条件下与不同组织中
的表达分析
  平榛具有很强的抗寒特性,可耐冬季 -48℃的
极端低温。以平榛11月至次年4月每个月的雌花
芽为实验材料,检测 ChWRKY28基因的表达特性。
结果发现:在11月时 ChWRKY28高丰度表达,随后
从12月开始至次年3月,ChWRKY28的表达量呈逐
步下降的趋势,与3月相比,4月略有升高,变化不
明显(图4A)。对平榛雌花芽、雄花序及茎部(皮)
不同组织器官中的表达特性进行分析(图4B)发现:
虽然在检测的3个平榛组织中均有ChWRKY28的表
达,但在茎部(皮)中的表达量分别是雄花序和雌花
芽中表达量的2.7倍和3.9倍,存在较大差异。
2.4 ChWRKY28基因在非生物胁迫下的表达分析
对平榛进行低温(4℃)、旱(PEG)及盐(NaCl)
胁迫处理,分析 ChWRKY28基因在上述逆境胁迫下
的表达模式。图 5A表明:在低温胁迫下,平榛
ChWRKY28基因的表达量呈先升高后下降的变化趋
352
林 业 科 学 研 究 第29卷
图4 ChWRKY28基因在自然越冬雌花芽中
及不同组织中(1月)的表达
势。在低温处理2h后,ChWRKY28基因开始迅速上
调表达,表达量是对照(0h)的6.7倍;在处理8h后,
ChWRKY28基因表达量降低;在处理 24h后,
ChWRKY28基因表达量明显下降。图5B表明:平榛
ChWRKY28基因响应旱胁迫诱导强烈,在 PEG处理
2h后,ChWRKY28基因表达量迅速升高,是对照(0
h)的36.4倍。图5C表明:平榛 ChWRKY28基因在
盐胁迫下的表达情况与低温和旱胁迫的不同,达到
最大表达量的时间比前二者晚;在盐胁迫下,
ChWRKY28基因表达量总体呈上升趋势,并在盐胁
迫24h时达到最高表达量,是对照(0h)的12.3倍。
以上结果表明:平榛ChWRKY28基因受低温、旱及盐
3种胁迫的诱导而上调表达。
图5 在低温、旱及盐胁迫处理下ChWRKY28基因叶片中的表达情况
3 结论与讨论
WRKY转录因子参与植物的一系列生长发育过
程并响应多种外界胁迫[15,19];然而,与响应生物胁
迫的研究相比,WRKY转录因子在响应非生物胁迫
方面的研究进展缓慢[20]。本研究从平榛的转录组
数据中筛选到1个unigene序列,经过RACE克隆得
到 ChWRKY28基因。根据 Eulgem等[12]的研究,
WRKY转录因子家族通常可分为3个类型:第 I类
型含2个WRKY结构域,锌指结构为 C2H2;第 I类
型只含1个WRKY结构域,锌指结构与第 I类型相
同;第II类型也只含1个 WRKY结构域,锌指结构
为C2HC,其中,第 I类型可以进一步分为5个亚类
(Iae)。Jiang等[21]在利用杨树100个WRKY氨基
酸序列构建系统进化树的分析中,发现 PtrWRKY99
在系统进化树中被分到第 II类型,但 PtrWRKY99
的锌指结构却不是C2HC,而是C2H2型,应属于第I
类型。在本研究中,ChWRKY28只含1个 WRKY结
构域,锌 指 结 构 为 C2H2 型,按 照 结 构 分 类,
ChWRKY28应属于第 I类型。为了进一步确认
ChWRKY28的分类情况,笔者构建了包括杨树和拟
南芥WRKY所有第 I类型在内的系统进化树。通
过系统进化树发现,ChWRKY28与杨树的 Ptr
WRKY28、PtrWRKY71及拟南芥的 AtWRKY8、At
WRKY28等聚类到一个分支,属于 Ic亚类,与其按
照结构分类相一致。
本研究中,平榛ChWRKY28基因均受低温、盐及
旱胁迫的诱导而上调表达,但响应胁迫的速度及诱
导表达的强度存在差异。罗昌国等[22]对 Mh
WRKY40b基因在几种胁迫下的表达情况进行分析
后发现,在低温和旱处理后,MhWRKY40b基因的表
达量呈先上升后下降的趋势。张娜等[23]对 Gh
WRKY5基因在非生物胁迫下的表达分析后发现,
GhWRKY5受PEG的诱导强于盐胁迫诱导,并在2h
时表达量急剧升高,但在 8h时表达量开始降低。
本研究中,ChWRKY28基因对低温和旱胁迫的响应
与上述研究相似,在低温和旱胁迫处理后,
ChWRKY28的表达量呈现先上升后下降的趋势;但
在盐胁迫处理后,ChWRKY28表达量总体呈逐步上
升趋势,并在处理24h后达到最大表达丰度。这表
明ChWRKY28基因对低温及旱胁迫的响应比盐胁迫
敏感,推测ChWRKY28可能是早期应答低温与旱胁
迫信号的转录因子。另外,检测 ChWRKY28基因在
平榛3个不同组织器官中的表达情况,发现其在茎
452
第2期 赵天田,等:平榛ChWRKY28基因克隆及表达模式分析
(皮)中的表达量比在雌花芽和雄花序中的高,存在
空间表达上的差异性。ChWRKY28在茎(皮)中的高
表达可能有利于提高茎部对外界环境胁迫的耐受
力,这也与在自然状况下枝条(茎)的耐寒性强于雄
花序和雌花芽一致。
Ling等[24]研究发现,处在同一进化分组中的转
录因子大多具有相似的功能。ChWRKY28与拟南
芥WRKY家族中的AtWRKY28相似性最高,并且具
有相同的锌指结构,同属于WRKY家族的Ⅱc类型。
据报道,在拟南芥中超表达 AtWRKY28基因能够增
强拟南芥抵御生物胁迫和非生物胁迫的能力,如
Marcel等[25]的研究发现,AtWRKY28可以通过调控
ICS1和 PBS3基因的表达,进而提高由水杨酸介导
的植物抵抗生物胁迫的能力。Babitha等[26]将 At
bHLH17和AtWRKY28共表达到拟南芥中,发现能
提高转基因拟南芥对氧化胁迫和盐胁迫的耐受性。
鉴于ChWRKY28与AtWRKY28基因所编码的氨基酸
序列具有相同的结构类型及较高的相似性,推测
ChWRKY28可能也具有 AtWRKY28所具有的耐受生
物胁迫的能力,但这还需要以后进一步的研究证实。
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(责任编辑:徐玉秀)
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