全 文 ：林业科学研究 ２０１６，２９（２）：２５０ ２５５
ＦｏｒｅｓｔＲｅｓｅａｒｃｈ
文章编号：１００１１４９８（２０１６）０２０２５００６
平榛 ＣｈＷＲＫＹ２８基因克隆及表达模式分析
赵天田，梁丽松，马庆华，王贵禧
（中国林业科学研究院林业研究所，国家林业局林木培育重点实验室，林木遗传育种国家重点实验室，北京 １０００９１）
收稿日期：２０１４１２０３ 修回日期：２０１５１１２４
基金项目：国家自然基金（３１５００５５５）；林业公益性行业科研专项（２０１３０４７１０）；林业科学技术推广项目［２０１４］３号
作者简介：赵天田（１９８４—），男，博士，主要从事榛属植物抗逆遗传育种方面的研究．Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｏｔｉａｎ１９８４＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者：研究员．Ｅｍａｉｌ：ｗａｎｇｇｘ０１１４＠１２６．ｃｏｍ
摘要：［目的］研究平榛ＣｈＷＲＫＹ２８基因序列特征及其在不同非生物胁迫下的表达规律。［方法］以平榛为试材，采
用ＲＡＣＥＰＣＲ方法进行基因克隆；利用实时荧光定量ＰＣＲ方法检测基因在不同组织及不同非生物胁迫下的表达模
式。［结果］表明：克隆得到的ＷＲＫＹ基因，全长１３４２ｂｐ，基因内部包含１个长９６３ｂｐ的完整开放阅读框，编码３２０
个氨基酸残基，命名为ＣｈＷＲＫＹ２８。构建的系统发育树表明：该序列与拟南芥 ＡｔＷＲＫＹ２８及杨树 ＰｔｒＷＲＫＹ９３的关
系最近，相似性分别为４９％和６０％。基因表达分析表明：ＣｈＷＲＫＹ２８在雄花序、雌花芽及茎中均有表达，但在茎部
（皮）中的表达量高于雄花序和雌花芽中的表达量，具有组织表达特异性；低温、干旱及盐胁迫均能诱导 ＣｈＷＲＫＹ２８
基因的表达，但受诱导程度存在差异。亚细胞定位分析结果表明：ＣｈＷＲＫＹ２８蛋白分布在细胞核内，是一个核蛋
白。［结论］推测ＣｈＷＲＫＹ２８基因可能参与植物响应非生物胁迫的信号转导过程。
关键词：平榛；转录因子；克隆；亚细胞定位；表达
中图分类号：Ｓ７１８４６ 文献标识码：Ａ
ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＣｈＷＲＫＹ２８ｆｒｏｍ
ＣｏｒｙｌｕｓｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌａＦｉｓｃｈ
ＺＨＡＯＴｉａｎｔｉａｎ，ＬＩＡＮＧＬｉｓｏｎｇ，ＭＡＱｉｎｇｈｕａ，ＷＡＮＧＧｕｉｘｉ
（ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＴｒｅｅＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＢｒｅｅｄｉｎｇ，ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＳｉｌｖｉｃｕｌｔｕｒｅｏｆＳｔａｔｅＦｏｒｅｓｔｒｙＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，
ＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００９１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：［Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ］ＴｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｆｅａｔｕｒｅｓａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｒｕｌｅｓｏｆＷＲＫＹｇｅｎｅｆｒｏｍＣｏｒｙｌｕｓｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌ
ｌａＦｉｓｃｈ．［Ｍｅｔｈｏｄ］ＴｈｅｇｅｎｅｗａｓｃｌｏｎｅｄｂｙＲＡＣＥＰＣＲ．ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲｗａｓｕｓｅｄｉｎａｎａｌｙｚｉｎｇｇｅｎｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｖａｒｉｏｕｓｔｉｓｓｕｅｓａｎｄｄｉｆｅｒｅｎｔａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｅｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｃｏｌｄ，ｈｉｇｈｓａｌｉｎｉｔｙａｎｄｄｒｏｕｇｈｔ．［Ｒｅｓｕｌｔ］Ｔｈｅ
ｃＤＮＡｏｆＷＲＫＹｉｓ１３４２ｂｐｉｎｌｅｎｇｔｈ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇａｃｏｍｐｌｅｔｅｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）ｏｆ９６３ｂｐｅｎｃｏｄｉｎｇａｐｒｏ
ｔｅｉｎｏｆ３２０ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ，ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓＣｈＷＲＫＹ２８．ＰｈｙｌｏｇｅｎｙｔｒｅｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄＣｈＷＲＫＹ２８ｗａｓｍｕｃｈｃｌｏｓｅｒｔｏ
ＡｔＷＲＫＹ２８ｆｒｏｍＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａａｎｄＰｔｒＷＲＫＹ９３ｆｒｏｍＰｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ，ｇｅｎｅｒａｔｅｄ４９％ ａｎｄ６０％ ａｍｉｎｏ
ａｃｉｄｓｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ．ＳｐａｔｉａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｅｓｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＣｈＷＲＫＹ２８ｗａｓｈｉｇｈｅｒｉｎｓｔｅｍ
ｔｈａｎｔｈａｔｉｎｍａｌｅａｎｔｈｏｔａｘｙａｎｄｆｌｏｒａｌｂｕｄｓｗｈｉｃｈｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｉｓｓｕｅｓｐｅｃｉｆｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＣｈＷＲＫＹ２８ｗａｓｃｌｅａｒｌｙｉｎ
ｄｕｃｅｄｂｙｃｏｌｄ，ｈｉｇｈｓａｌｉｎｉｔｙａｎｄｄｒｏｕｇｈｔ，ｂｕｔｔｈａｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｔｅｎｄｅｎｃｙｗｅｒｅｅｖｉｄｅｎｔｌｙｄｉｆｅｒｅｎｔｏｆｔｈｉｓｇｅｎｅ．Ｔｈｅ
ｓｕｂｃｅｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｄｔｈａｔＣｈＷＲＫＹ２８ｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｔａｒｇｅｔｅｄｔｏｔｈｅｎｕｃｌｅｕｓ．［Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ］Ｔｈｉｓｓｔｕｄ
ｙｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔＣｈＷＲＫＹ２８ｇｅｎｅｍａｙｂｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｐａｔｈｗａｙ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＣｏｒｙｌｕｓｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌａＦｉｓｃｈ；ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓ；ｃｌｏｎｅ；ｓｕｂｃｅｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
平榛（ＣｏｒｙｌｕｓｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌａＦｉｓｃｈ．）为榛科（Ｃｏｒｙ
ｌａｃｅａｅ）榛属（ＣｏｒｙｌｕｓＬ．）植物，广泛分布于我国的华
北、东北地区，其榛仁富含不饱和脂肪酸、蛋白质、维
生素 Ａ、Ｂ、Ｅ等，具有较高的营养价值和经济价
第２期 赵天田，等：平榛ＣｈＷＲＫＹ２８基因克隆及表达模式分析
值［１－２］。据世界粮农组织的统计数据，目前，我国带
壳榛子的年产量约２．３万ｔ（ｈｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆａｏ．ｏｒｇ／ｄｏ
ｃｒｅｐ／００３／ｘ４４８４Ｅ／ｘ４４８４ｅ０３．ｈｔｍ），其中，平榛贡献
了超过７０％的产量［３］。此外，平榛在水土保持和维
持生态平衡方面也发挥了重要的作用。平榛是我国
榛属植物资源中最有经济价值的一个种，它具有高
产、早熟、抗东方枯萎病及抗寒性强等优点［４］。目
前，在世界范围内（主要是黑海和地中海沿岸）广泛
种植的是欧洲榛（ＣｏｒｙｌｕｓａｖｅｌａｎａＬ．），但是欧洲榛
抗寒性较差，在我国的引种试验中发现：欧洲榛雌花
芽、雄花序等易受低温的伤害，造成枯死、抽干等现
象，从而影响坚果的产量，造成经济损失［５］；而平榛
能够忍耐最低 －４８℃的极端低温［６］，抗寒能力远强
于欧洲榛。因此，对平榛响应逆境胁迫尤其是低温
胁迫的机制进行研究，将对今后培育抗寒性强的榛
子新品种具有重要意义。
目前，关于平榛响应逆境胁迫机制的研究才刚刚
开始［７］，而植物中的转录因子家族在植物抵御外界逆
境胁迫上具有重要作用［８］，转录因子可以通过激活或
抑制目标基因的表达，来感知或转导外部刺激［９］。
ＷＲＫＹ作为植物中最重要的转录因子家族之一，除参
与植物的生长发育、衰老、抗病等一系列生理活动外，
还参与植物对环境胁迫的应答反应，如低温、干旱、高
盐等非生物胁迫。ＷＲＫＹ蛋白典型的特征是含有保
守的ＷＲＫＹ结构域，该结构域一般由６０个氨基酸残
基组成，在 Ｎ端含有高度保守的氨基酸序列
ＷＲＫＹＧＱＫ，在 Ｃ端含有 Ｃ２Ｈ２ 或 Ｃ２ＨＣ锌指结
构［１０－１２］。自从在甘薯（Ｉｐｏｍｏｅａｂａｔａｔａｓ（Ｌ．）Ｌａｍ．）中
首次克隆得到ＷＲＫＹ转录因子开始［１３］，陆续在其他
植物如拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ（Ｌ．）Ｈｅｙｎｈ．）、水
稻（ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＬ．）、玉米（ＺｅａｍａｙｓＬ．）、葡萄（Ｖｉｔｉｓ
ｖｉｎｉｆｅｒａＬ．）中得到了ＷＲＫＹ转录因子。该转录因子
可以通过识别靶基因启动子上的特定序列Ｗｂｏｘ（Ｃ／
ＴＴＧＡＣＣ／Ｔ）来调控靶标基因的表达，进而调控植物
做出应对各种生物和非生物胁迫的变化［１４－１５］。
目前，在其他榛属植物中未见关于 ＷＲＫＹ转录
因子的报道，本研究根据平榛花芽转录组的测序结果
（ＮＣＢＩＳＲＡ数据库，登录号：ＳＲＸ５２９３００）［１６］，筛选
并克隆得到１个ＷＲＫＹ转录因子，通过构建ＷＲＫＹ
ＹＦＰ表达载体，对其进行亚细胞定位分析，以确定获
得的ＷＲＫＹ是否为核定位转录因子。另外，进一步
对该转录因子在自然低温胁迫、不同逆境胁迫及不同
组织中的表达特性进行分析。通过上述研究来探讨
平榛ＷＲＫＹ转录因子响应逆境胁迫的机制。
１ 材料与方法
１．１ 实验材料及处理
１．１．１ 自然越冬平榛花芽中 ＷＲＫＹ基因表达分析
材料的处理 用于实验的平榛雌花芽取自河北木兰
围场国有林场（４１°５８’Ｎ，１１７°４０’Ｅ），于２０１１年
１１月至２０１２年４月每隔１个月取１次，材料用液氮
冻干后，存于－８０℃冰箱。
１．１．２ 非生物胁迫平榛 ＷＲＫＹ基因表达分析材料
的处理 参考 Ｗａｎｇ等［１７］的方法，将平榛苗植于花
盆中（沙子∶草炭 ＝１∶２（ｖ／ｖ）），放置温室培养２个
月（光照时间１６ｈ昼／８ｈ夜，光照强度１００μｍｏｌ·
ｍ－２·ｓ－１，温度 ２５℃）；然后分别进行 ４℃低温、旱
（质量浓度为２５％的ＰＥＧ６０００）及盐处理（４００ｍｍｏｌ
·Ｌ－１的ＮａＣｌ），在处理２、８、２４ｈ后采集叶位相同的
叶片（完全展开的第４ ５片叶），以未处理的做对
照，每个处理设３个重复。
１．１．３ 平榛不同组织器官中 ＷＲＫＹ基因表达分析
材料的处理 在１月份分别取平榛的雌花芽、雄花
序及茎段，分析 ＷＲＫＹ基因在不同组织器官中的表
达特性。
１．２ 方法
１．２．１ 平榛ＷＲＫＹ基因的克隆与序列分析 利用
ＣＴＡＢ法进行总ＲＮＡ提取［１８］，采用 ＳＭＡＲＴＴＭＲＡＣＥ
（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司，美国）试剂盒进行反转录，得到第一
链作为ＲＡＣＥ扩增的模板。根据平榛花芽转录组的
测序结果［１６］，获得１个 Ｕｎｉｇｅｎｅ序列，通过 Ｂｌａｓｔ比
对分析，推测其可能是１个 ＷＲＫＹ基因，利用 Ｐｒｉｍ
ｅｒ５设计引物，引物见表１。以反转录得到的 ｃＤＮＡ
为模板，采用 ＴｏｕｃｈｄｏｗｎＰＣＲ程序进行扩增，扩增
产物进行凝胶回收，连接载体、转化、蓝白斑筛选及
菌落ＰＣＲ鉴定后，送生物公司进行测序。将获得的
序列在ＮＣＢＩ数据库进行 Ｂｌａｓｔ比对，确定所克隆的
基因为ＷＲＫＹ基因。用 ＤＮＡＭＡＮ６．０和 ＰｒｏｔＰａｒａｍ
（ｈｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）预测编码蛋白的分子量、
理论等电点。利用 ＭＥＧＡ５．２０软件的最大似然法
（ＭａｘｉｍｕｍＬｉｋｅｌｉｈｏｏｄ）（Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ值为１０００）构建系
统进化树，用于比对的 ＰｔｒＷＲＫＹ（杨树）和 ＡｔＷＲＫＹ
（拟南芥）蛋白序列分别从Ｐｈｙｔｏｚｏｍｅｖ１０．２和ＴＡＩＲ
９．０数据库获得。使用软件 ＥｕｋｍＰＬｏｃ２．０（ｈｔ
ｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｓｂｉｏ．ｓｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／ｂｉｏｉｎｆ／ｅｕｋｍｕｌｔｉ２／）进
行亚细胞定位预测。
１５２
林 业 科 学 研 究 第２９卷
１．２．２ ＷＲＫＹＹＦＰ表达载体的构建 首先扩增出
ＷＲＫＹ基因的编码区序列，去除终止子后，连接
ｐＥａｒｌｙＧａｔｅ１０１，利用 Ｇａｔｅｗａｙ克隆系统构建好３５Ｓ：：
ＣｈＷＲＫＹ２８ＹＦＰ重组载体，转化农杆菌，农杆菌离
心后，用１０ｍｍｏｌ·Ｌ－１的 ＭｇＣｌ２溶液（含１００μｍｏｌ
·Ｌ－１的乙酰丁香酮）重悬，注射烟草下表皮，然后利
用ＬＳＭ５１０共聚焦激光扫描显微镜观察荧光。烟草
植株在短日照条件下（８ｈ昼／１６ｈ夜）培养。
１．２．３ 平榛ＷＲＫＹ基因的表达分析 提取处理材
料的ＲＮＡ，以反转录后的ｃＤＮＡ为模板，进行实时荧
光定量 ＰＣＲ分析。用于实时荧光定量 ＰＣＲ分析的
特异引物 ＷＲＫＹＦ和 ＷＲＫＹＲ及内参基因引物 Ａｃ
ｔｉｎＦ和ＡｃｔｉｎＲ见表１。参照ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＴＭ
（ＰｅｒｆｅｃｔＲｅａｌＴｉｍｅ）说明书，扩增程序为：９５℃预变
性３ｍｉｎ；９５℃变性２０ｓ，５３℃退火２０ｓ，７２℃延伸２０
ｓ，共３９个循环；６５℃到９５℃３０ｓ结束。反应在Ｂｉｏ
ＲａｄＣＦＸ９６ＰＣＲ仪上进行，每个处理设３次重复。
表１ 平榛ＷＲＫＹ基因克隆及表达分析引物
引物名称 引物序列 引物作用
３′ＲＡＣＥ ５′ＧＧＧＡＧＣＣＡＣＧＧＴＴＴＧＣＣＴＴＣＡＴＧＡＣＣ３’ ３′末端扩增
５′ＲＡＣＥ ５’ＧＣＡＴＴＴＣＣＴＣＴＧＡＧＣＧＴＴＧＣＧＧＧＡＡ３’ ５′末端扩增
ＷＲＫＹＦ ５’ＧＣＴＧＧＴＴＣＡＴＣＡＧＣＡＴＡＣＡＡＴ３’ 检测ＷＲＫＹ
ＷＲＫＹＲ ５’ＧＧＣＡＣＴＴＧＣＣＡＡＴＧＡＧＴＴＧＴ３’ 的表达
ＡｃｔｉｎＦ ５’ＴＧＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＧＧＴＴＴＧＣ３’
扩增内标
ＡｃｔｉｎＲ ５’ＣＴＧＡＣＣＣＡＴＣＣＣＡＡＣＣＡＴＧＡ３’
２ 结果与分析
２．１ ＷＲＫＹ转录因子的克隆与氨基酸序列分析
通过分析平榛花芽转录组测序数据，获得１个
预测为 ＷＲＫＹ转录因子的 Ｕｎｉｇｅｎｅ序列，根据序列
设计３’端特异引物，ＲＡＣＥＰＣＲ后，得到３’端序列，
长度为５７８ｂｐ；然后根据３’端序列设计引物获得５’
端序列，长度为８４６ｂｐ；最后通过扩增，获得１条编码
区为１３４２ｂｐ的全长序列（图１）。Ｂｌａｓｔ比对发现：该
序列与ＷＲＫＹ转录因子同源，暂命名为ＣｈＷＲＫＹ２８。
下划线表示起始密码子和终止密码子；虚线表示锌指结构；Ｃ表示锌指结构的半胱氨酸，
Ｈ表示锌指结构的组氨酸；斜体表示ＣｈＷＲＫＹ２８保守域。
图１ ＣｈＷＲＫＹ２８氨基酸序列分析
２５２
第２期 赵天田，等：平榛ＣｈＷＲＫＹ２８基因克隆及表达模式分析
分析显示：该基因含有１个９６３ｂｐ的开放阅读框，
编码有３２０个氨基酸，其理论等电点（ｐＩ）和分子量
分别为７．３０和３５．０６ｋＤａ。该基因的氨基酸序列包
含１个 ＷＲＫＹ保守域及１个 Ｃ２Ｈ２（ＣＸ４ＣＸ２３Ｈ
Ｘ１Ｈ）锌指结构域（图１），属于 ＷＲＫＹ转录因子家
族中的第二类型。利用ＤＮＡＭＡＮ结合ＮＣＢＩ数据库
Ｂｌａｓｔ比对发现：ＣｈＷＲＫＹ２８分别与拟南芥和杨树
ＷＲＫＹ家族中的 ＡｔＷＲＫＹ２８和 ＰｔｒＷＲＫＹ９３的相似
性较高，序列同源性分别达 ４９％和 ６０％，与 Ｐｔｒ
ＷＲＫＹ２８的相似性也达５１％。利用 ＭＥＧＡ软件构
建包括 ＣｈＷＲＫＹ２８及数据库中获得的杨树 Ｐｔｒ
ＷＲＫＹ（Ｉ）和拟南芥 ＡｔＷＲＫＹ（Ｉ）氨基酸序列的系
统发育树。结果（图２）表明：ＣｈＷＲＫＹ２８被分到第
Ｉ类型中的 Ｉｃ亚类，并与杨树的 ＰｔｒＷＲＫＹ２８、Ｐｔｒ
ＷＲＫＹ７１、ＰｔｒＷＲＫＹ９２和 ＰｔｒＷＲＫＹ９３以及拟南芥的
ＡｔＷＲＫＹ８、ＡｔＷＲＫＹ２８和 ＡｔＷＲＫＹ７１聚类到一个
分支。
２．２ ＷＲＫＹＹＦＰ融合蛋白在烟草表皮细胞中的
表达分析
利用 ＥｕｋｍＰＬｏｃ２．０软件对 ＣｈＷＲＫＹ２８进行
亚细胞定位预测，预测结果定位于细胞核。为了验
证上述预测结果的准确性，构建３５Ｓ：：ＣｈＷＲＫＹ２８
ＹＦＰ重组载体，注射烟草下表皮，然后利用共聚焦激
图２ ＣｈＷＲＫＹ２８与杨树及拟南芥ＷＲＫＹ蛋白
序列的进化树分析
光扫 描 显 微 镜 观 察 荧 光。结 果 表 明：３５Ｓ：：
ＣｈＷＲＫＹ２８ＹＦＰ重组质粒侵染的细胞，只有在细胞
核上有荧光信号（图３），说明 ＣｈＷＲＫＹ２８是核定位
蛋白，与通过软件预测的结果一致，也与ＣｈＷＲＫＹ２８
作为一个转录因子的功能相符合。
图３ ＣｈＷＲＫＹ２８的亚细胞定位分析（图中箭头所指为细胞核）
２．３ ＣｈＷＲＫＹ２８基因在自然条件下与不同组织中
的表达分析
平榛具有很强的抗寒特性，可耐冬季 －４８℃的
极端低温。以平榛１１月至次年４月每个月的雌花
芽为实验材料，检测 ＣｈＷＲＫＹ２８基因的表达特性。
结果发现：在１１月时 ＣｈＷＲＫＹ２８高丰度表达，随后
从１２月开始至次年３月，ＣｈＷＲＫＹ２８的表达量呈逐
步下降的趋势，与３月相比，４月略有升高，变化不
明显（图４Ａ）。对平榛雌花芽、雄花序及茎部（皮）
不同组织器官中的表达特性进行分析（图４Ｂ）发现：
虽然在检测的３个平榛组织中均有ＣｈＷＲＫＹ２８的表
达，但在茎部（皮）中的表达量分别是雄花序和雌花
芽中表达量的２．７倍和３．９倍，存在较大差异。
２．４ ＣｈＷＲＫＹ２８基因在非生物胁迫下的表达分析
对平榛进行低温（４℃）、旱（ＰＥＧ）及盐（ＮａＣｌ）
胁迫处理，分析 ＣｈＷＲＫＹ２８基因在上述逆境胁迫下
的表达模式。图 ５Ａ表明：在低温胁迫下，平榛
ＣｈＷＲＫＹ２８基因的表达量呈先升高后下降的变化趋
３５２
林 业 科 学 研 究 第２９卷
图４ ＣｈＷＲＫＹ２８基因在自然越冬雌花芽中
及不同组织中（１月）的表达
势。在低温处理２ｈ后，ＣｈＷＲＫＹ２８基因开始迅速上
调表达，表达量是对照（０ｈ）的６．７倍；在处理８ｈ后，
ＣｈＷＲＫＹ２８基因表达量降低；在处理 ２４ｈ后，
ＣｈＷＲＫＹ２８基因表达量明显下降。图５Ｂ表明：平榛
ＣｈＷＲＫＹ２８基因响应旱胁迫诱导强烈，在 ＰＥＧ处理
２ｈ后，ＣｈＷＲＫＹ２８基因表达量迅速升高，是对照（０
ｈ）的３６．４倍。图５Ｃ表明：平榛 ＣｈＷＲＫＹ２８基因在
盐胁迫下的表达情况与低温和旱胁迫的不同，达到
最大表达量的时间比前二者晚；在盐胁迫下，
ＣｈＷＲＫＹ２８基因表达量总体呈上升趋势，并在盐胁
迫２４ｈ时达到最高表达量，是对照（０ｈ）的１２．３倍。
以上结果表明：平榛ＣｈＷＲＫＹ２８基因受低温、旱及盐
３种胁迫的诱导而上调表达。
图５ 在低温、旱及盐胁迫处理下ＣｈＷＲＫＹ２８基因叶片中的表达情况
３ 结论与讨论
ＷＲＫＹ转录因子参与植物的一系列生长发育过
程并响应多种外界胁迫［１５，１９］；然而，与响应生物胁
迫的研究相比，ＷＲＫＹ转录因子在响应非生物胁迫
方面的研究进展缓慢［２０］。本研究从平榛的转录组
数据中筛选到１个ｕｎｉｇｅｎｅ序列，经过ＲＡＣＥ克隆得
到 ＣｈＷＲＫＹ２８基因。根据 Ｅｕｌｇｅｍ等［１２］的研究，
ＷＲＫＹ转录因子家族通常可分为３个类型：第 Ｉ类
型含２个ＷＲＫＹ结构域，锌指结构为 Ｃ２Ｈ２；第 Ｉ类
型只含１个ＷＲＫＹ结构域，锌指结构与第 Ｉ类型相
同；第ＩＩ类型也只含１个 ＷＲＫＹ结构域，锌指结构
为Ｃ２ＨＣ，其中，第 Ｉ类型可以进一步分为５个亚类
（Ｉａｅ）。Ｊｉａｎｇ等［２１］在利用杨树１００个ＷＲＫＹ氨基
酸序列构建系统进化树的分析中，发现 ＰｔｒＷＲＫＹ９９
在系统进化树中被分到第 ＩＩ类型，但 ＰｔｒＷＲＫＹ９９
的锌指结构却不是Ｃ２ＨＣ，而是Ｃ２Ｈ２型，应属于第Ｉ
类型。在本研究中，ＣｈＷＲＫＹ２８只含１个 ＷＲＫＹ结
构域，锌 指 结 构 为 Ｃ２Ｈ２ 型，按 照 结 构 分 类，
ＣｈＷＲＫＹ２８应属于第 Ｉ类型。为了进一步确认
ＣｈＷＲＫＹ２８的分类情况，笔者构建了包括杨树和拟
南芥ＷＲＫＹ所有第 Ｉ类型在内的系统进化树。通
过系统进化树发现，ＣｈＷＲＫＹ２８与杨树的 Ｐｔｒ
ＷＲＫＹ２８、ＰｔｒＷＲＫＹ７１及拟南芥的 ＡｔＷＲＫＹ８、Ａｔ
ＷＲＫＹ２８等聚类到一个分支，属于 Ｉｃ亚类，与其按
照结构分类相一致。
本研究中，平榛ＣｈＷＲＫＹ２８基因均受低温、盐及
旱胁迫的诱导而上调表达，但响应胁迫的速度及诱
导表达的强度存在差异。罗昌国等［２２］对 Ｍｈ
ＷＲＫＹ４０ｂ基因在几种胁迫下的表达情况进行分析
后发现，在低温和旱处理后，ＭｈＷＲＫＹ４０ｂ基因的表
达量呈先上升后下降的趋势。张娜等［２３］对 Ｇｈ
ＷＲＫＹ５基因在非生物胁迫下的表达分析后发现，
ＧｈＷＲＫＹ５受ＰＥＧ的诱导强于盐胁迫诱导，并在２ｈ
时表达量急剧升高，但在 ８ｈ时表达量开始降低。
本研究中，ＣｈＷＲＫＹ２８基因对低温和旱胁迫的响应
与上述研究相似，在低温和旱胁迫处理后，
ＣｈＷＲＫＹ２８的表达量呈现先上升后下降的趋势；但
在盐胁迫处理后，ＣｈＷＲＫＹ２８表达量总体呈逐步上
升趋势，并在处理２４ｈ后达到最大表达丰度。这表
明ＣｈＷＲＫＹ２８基因对低温及旱胁迫的响应比盐胁迫
敏感，推测ＣｈＷＲＫＹ２８可能是早期应答低温与旱胁
迫信号的转录因子。另外，检测 ＣｈＷＲＫＹ２８基因在
平榛３个不同组织器官中的表达情况，发现其在茎
４５２
第２期 赵天田，等：平榛ＣｈＷＲＫＹ２８基因克隆及表达模式分析
（皮）中的表达量比在雌花芽和雄花序中的高，存在
空间表达上的差异性。ＣｈＷＲＫＹ２８在茎（皮）中的高
表达可能有利于提高茎部对外界环境胁迫的耐受
力，这也与在自然状况下枝条（茎）的耐寒性强于雄
花序和雌花芽一致。
Ｌｉｎｇ等［２４］研究发现，处在同一进化分组中的转
录因子大多具有相似的功能。ＣｈＷＲＫＹ２８与拟南
芥ＷＲＫＹ家族中的ＡｔＷＲＫＹ２８相似性最高，并且具
有相同的锌指结构，同属于ＷＲＫＹ家族的Ⅱｃ类型。
据报道，在拟南芥中超表达 ＡｔＷＲＫＹ２８基因能够增
强拟南芥抵御生物胁迫和非生物胁迫的能力，如
Ｍａｒｃｅｌ等［２５］的研究发现，ＡｔＷＲＫＹ２８可以通过调控
ＩＣＳ１和 ＰＢＳ３基因的表达，进而提高由水杨酸介导
的植物抵抗生物胁迫的能力。Ｂａｂｉｔｈａ等［２６］将 Ａｔ
ｂＨＬＨ１７和ＡｔＷＲＫＹ２８共表达到拟南芥中，发现能
提高转基因拟南芥对氧化胁迫和盐胁迫的耐受性。
鉴于ＣｈＷＲＫＹ２８与ＡｔＷＲＫＹ２８基因所编码的氨基酸
序列具有相同的结构类型及较高的相似性，推测
ＣｈＷＲＫＹ２８可能也具有 ＡｔＷＲＫＹ２８所具有的耐受生
物胁迫的能力，但这还需要以后进一步的研究证实。
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（责任编辑：徐玉秀）
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