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Physiological and Biochemical Changes During the Seed Development of Cypripedium japonicum

扇脉杓兰种子发育过程中的生理生化变化



全 文 :林业科学研究 2015,28(6):851 857
ForestResearch
  文章编号:10011498(2015)06085107
扇脉杓兰种子发育过程中的生理生化变化
闫晓娜,田 敏,王彩霞
(中国林业科学研究院亚热带林业研究所,浙江省林木育种技术研究重点实验室,浙江 杭州 311400)
收稿日期:20150402
基金项目:国家自然科学基金面上项目(31370553);浙江省重大科技攻关项目(2010C02004-2)
作者简介:闫晓娜(1989—),女,黑龙江齐齐哈尔人,在读硕士研究生,主要从事兰花生殖生物学研究.
 通讯作者:副研究员,博士,硕士生导师,主要从事野生兰保护生物学研究.
摘要:为了解扇脉杓兰种子发育过程中的生理特性和变化规律,以浙江省天目山国家级自然保护区内的2个野生扇
脉杓兰居群为材料,对其种子发育过程中的营养物质、内源激素含量和酶活性进行测定。结果表明:(1)可溶性蛋
白质含量在扇脉杓兰授粉后20d和85d分别达到最高值774.03μg·g-1和最低值373μg·g-1。淀粉含量从最初
的2.65%急速增加到21.82%,授粉后60d升至峰值,此后保持在20%左右。可溶性糖含量为1.72% 3.09%。
淀粉和可溶性糖之间呈极显著正相关(P<0.01),二者与可溶性蛋白质之间呈极显著负相关(P<001)。(2)GA3、
ZR、IAA峰值发生具有时间顺序性,扇脉杓兰授粉后20、30、40d依次出现。3种激素极显著正相关(P<0.01)。
ABA含量在授粉60d后逐渐上升,授粉115d时达到峰值,其含量与3种促进激素呈显著负相关(P<0.05)。(IAA
+GA3+ZR)ABA比值在授粉后20d达到峰值,此后逐渐下降。(3)SOD活性在扇脉杓兰授粉后20d迅速上升
至峰值451.18U·g-1·min-1,授粉后85d降至最低,其变化趋势与可溶性蛋白质变化保持一致。POD活性和
CAT活性呈单峰曲线变化。SOD、POD和CAT活性之间相关不显著(P>0.05),但是三者与可溶性蛋白质之间呈显
著正相关(P<0.05)。
关键词:扇脉杓兰;种子发育;生理生化变化
中图分类号:S718.43 文献标识码:A
PhysiologicalandBiochemicalChangesDuringtheSeedDevelopmentof
Cypripediumjaponicum
YANXiaona,TIANMin,WANGCaixia
(ResearchInstituteofSubtropicalForestry,ChineseAcademyofForestry,KeyLaboratoryofTreeBreedingofZhejiangProvince,
Hangzhou 311400,Zhejiang,China)
Abstract:TwowildpopulationsofCypripediumjaponicumfromWestTianmuMountainNationalNatureReservein
ZhejiangProvincewereusedtostudythephysiologicalcharacteristicsandvariationofC.japonicumduringseedde
velopment.Thecontentofnutrients,endogenoushormonesandenzymeactivityofdevelopingseedsweremeasured.
Theresultsareasfolows:1)Thesolubleproteincontentpeakedas774.03μg·g-1twentydaysafterpolination
(DAP).Andthevaluewasminimizedas373μg·g-1at85DAP.Thestarchcontentroserapidlyfromtheinitial
2.65% to21.82%,andpeakedat60DAP.Thereafterthecontentmaintainedatabout20%.Thesolublesugar
contentchangedbetween1.72% and3.09%.Thereexistedahighlysignificantpositivecorelationbetweenstarch
andsolublesugar(P<0.01),andthestarchandsolublesugarhadhighlysignificantnegativecorelationwithsolu
bleproteins(P<0.01).(2)ThepeakofGA3,ZRandIAAoccuredinatimesequence,as20DAP,30DAP
and40DAP.Therewashighlyasignificantpositivecorelationamongthem(P<0.01).ABAcontentincreasedat
60DAPandreachedapeakatthetimeof115DAP.ABAcontentsweresignificantlynegativelycorelatedwith
林 业 科 学 研 究 第28卷
threeaccelerativehormones(P<0.05).Theratioof(IAA+GA3+ZR)andABApeakedat20DAP,thenthis
ratiodecreased.(3)TheSODactivityroserapidlytoapeakas451.18U·g-1·min-1at20DAP,andthende
creaseduntil85DAP.TheSODactivityandsolubleproteintrendskeptconsistent.BothPODactivityandCATac
tivityshowedasinglepeakcurve.TheSOD,PODandCAThadnosignificantcorelation(P>0.05),butthey
showedasignificantpositivecorelationwithprotein(P<0.05).
Keywords:Cypripediumjaponicum;seeddevelopment;physiologicalandbiochemicalchanges
扇脉杓兰(CypripediumjaponicumThunb.),又名
双叶兰、兰花双叶草,隶属于兰科(Orchidaceae)杓兰
亚科(Cypripedioideae)杓兰属(CypripediumL.),是
多年生草本植物[1]。其双叶对生,叶脉扇形,叶型圆
润,单花顶生,大而艳丽,花型奇特,因而具有较高的
栽培观赏价值。扇脉杓兰根状茎细长、横走,有活血
调经、祛风镇痛之功效,又具显著的药用价值。主要
分布于中国、日本、韩国和缅甸等地,产于我国湖北、
四川、云南、安徽、浙江、台湾等省[2-3]。扇脉杓兰种
子非常细小,一个蒴果内含成千上万粒种子,成熟种
子胚纵横径分别只有208.71μm和106.19μm,种
子结构简单,不含胚乳组织[4]。自然状态下种子严
重败育,萌发率极低,更新能力差,主要依靠分株繁
殖维持个体的存活[5],因此,扇脉杓兰是一种易濒植
物,目前已被世界自然保护联盟(IUCN)濒危物种红
色目录列为“濒危(Endangered)”物种[6]。
针对扇脉杓兰保护生物学的研究,前人已从传
粉生态学[7]、遗传多样性[8-10]、繁育系统和花果发
育[4,11]等方面开展了一些工作,但是关于扇脉杓兰
种子的研究罕有报道。大多数兰科植物在授粉后胚
珠才开始发育,种子发育过程与生长素和乙烯信号
转导途径密切相关[12-13]。本试验通过研究扇脉杓
兰种子发育过程中营养物质、内源激素及活性酶的
动态变化,旨在揭示种子发育过程中的生理特性和
规律,进一步掌握发育不同时期对养分的需求情况,
为提出扇脉杓兰种胚拯救的有效措施和研究物种保
育提供生理学依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
野生扇脉杓兰取自浙江省临安市境内天目山国
家级自然保护区(119°23′47″ 119°28′27″E,30°18′
30″ 30°24′55″N)内的2个居群,约120株。试验
地属亚热带季风气候,年均降水量 1390 1870
mm,空气相对湿度 76% 81%[4]。土壤成分以有
机质为主,含氮、磷、钾等微量元素,土壤 pH值为4.
45 5.38[14]。
于2014年4月扇脉杓兰盛花期授粉后,每10d
采集1次发育过程中的果实,授粉70d后,每15d
采集1次果实,每次取混合样品4 8个蒴果不等,
直至果实内种子完全成熟为止。将蒴果去除果皮和
胎座部分,剩余正在发育的种子部分做为样品用于
生理生化指标的测定。激素测定样品置于 -80℃
下冷冻保存。
1.2 测定方法
1.2.1 可溶性蛋白质含量测定 准确称取样品
03g,重复4次,采用考马斯亮蓝测定法[15]。
1.2.2 可溶性糖的提取与含量测定 称取样品
02g,采用蒽酮比色法测定[16],重复3次。
1.2.3 淀粉的提取和含量测定 淀粉样品为可溶
性糖样品提取后的残渣,也采用蒽酮法测定[17-18]。
1.2.4 激素含量的测定 精确称量低温保存的种
子样品0.3g,3个重复,采用酶联免疫法(ELISA),
由中国农业大学作物化学控制研究中心测定生长素
(IAA)、细胞分裂素(ZR)、赤霉素(GA3)和脱落酸
(ABA)的含量。
1.2.5 酶液的提取与酶活性测定 称取新鲜种子
样品0.3g于研钵中,重复4次,加入5mL预冷的
pH值7.8磷酸缓冲液(分2次加入),用液氮低温下
研磨提取,然后4℃下10500r·min-1离心15min,
取上清液为酶液。超氧化物歧化酶(SOD)活性测定
采用氮蓝四唑法[19];过氧化物酶(POD)活性测定采
用愈创木酚法;过氧化氢酶(CAT)采用紫外吸
收法[15]。
1.3 数据统计分析
应用Excel2007和 SPSS17.0软件对数据进行
统计和比较分析。
2 结果与分析
2.1 扇脉杓兰种子发育过程中营养物质含量的
变化
2.1.1 可溶性蛋白质含量的变化 由图1可看出:
258
第6期 闫晓娜,等:扇脉杓兰种子发育过程中的生理生化变化
扇脉杓兰种子发育前期可溶性蛋白质含量升高,授
粉后20d含量达最大值774.03μg·g-1。授粉后
20 30d(图2A、B),可溶性蛋白质含量迅速下降,
此时正值大孢子发生时期,需要大量的营养物质供
给[4]。随后可溶性蛋白质含量继续缓慢下降,授粉
后60d(图2C)已基本完成受精作用,可溶性蛋白
质积聚,其含量略有回升,后又继续下降。授粉后
85d(图 2D)可溶性蛋白质含量最低(373μg·
g-1),这一时期球形胚逐渐形成,营养大量消耗。直
至授粉后115d种子完全成熟(图2E),球形胚不再
进一步发育,可溶性蛋白质进入一个快速合成期,最
终其含量提升33.5%。
图1 扇脉杓兰种子发育过程中可溶性蛋白质含量的变化
2.1.2 淀粉和可溶性糖含量的变化 在扇脉杓兰
种子发育初期(图2A、B),淀粉和可溶性糖含量都
呈上升趋势(图3)。淀粉逐渐积累,在授粉后的60
d时间里,其含量迅速升高,由最初的2.65%急速增
加到21.82%。在种子超微结构观察中发现,随着
种子发育成熟,淀粉粒在质体上逐渐堆积并填满整
个质体空间,这与淀粉含量的测定结果相对应。授
粉60d后,淀粉含量有所下降,但变化不大,仍保持
在20%左右(图3)。
可溶性糖含量在授粉后 30d达到最大值(
A:授粉20d;B:授粉30d;C:授粉60d;D:授粉85d;E:授粉115d
图2 扇脉杓兰果实纵切面
图3 扇脉杓兰种子发育过程中淀粉和可溶性糖含量的变化
309%),而后有所下降,直至种子成熟可溶性糖含
量都维持相对稳定的状态。在种子发育的整个过程
中,可溶性糖含量为1.72% 3.09%,变化幅度较
小(图3)。
相关分析结果(表1)显示:扇脉杓兰种子发育
过程中,淀粉和可溶性糖之间相关系数为0.618,二
者呈极显著正相关(P<0.01),并分别与可溶性蛋
白质之间存在极显著负相关(P<0.01)。
表1 扇脉杓兰种子发育过程中营养物质、内源激素和酶活性的相关性分析
项目 SOD POD CAT 可溶性蛋白质 可溶性糖 淀粉 IAA GA3 ABA
POD 0.329
CAT -0.089 -0.131
可溶性蛋白质 0.342 0.935 -0.122
可溶性糖 0.149 -0.322 0.171 -0.545
淀粉 -0.047 -0.827 0.337 -0.825 0.618
IAA 0.314 0.811 -0.093 0.830 -0.382 -0.858
GA3 0.406 0.791 -0.163 0.715 -0.230 -0.513 0.626
ABA -0.054 -0.657 -0.421 -0.556 0.012 0.295 -0.368 -0.403
ZR 0.351 0.922 -0.010 0.916 -0.300 -0.805 0.917 0.619 -0.600
   注:表示在0.05水平上显著相关,表示在0.01水平上显著相关。
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林 业 科 学 研 究 第28卷
2.2 扇脉杓兰种子发育过程中内源激素含量的
变化
2.2.1 生长素(IAA)、赤霉素(GA3)和细胞分裂素
(ZR)含量变化 如图4所示:IAA含量在扇脉杓兰
种子发育初期处于较高水平,授粉后40d达到峰值
108.01ng·g-1;此后 IAA含量迅速下降,在授粉后
85d降至最低值(48.86ng·g-1),而后又缓慢上
升,但上升幅度不大。
图4 扇脉杓兰种子发育过程中生长素(IAA)、赤霉素(GA3)和
细胞分裂素(ZR)含量的变化
扇脉杓兰种子中 GA3含量变化呈波动曲线。
在授粉后0 20d内,GA3含量呈直线上升趋势,并
在授粉后20d升至最高10.45ng·g-1,但在授粉后
20 30d时发生骤降。在授粉后30 50d内GA3
含量又发生小幅度的升降,此后随着种子成熟,GA3
含量趋于稳定。在整个发育过程中 GA3含量一直
维持在较低水平。
ZR含量在授粉后缓慢升高,并在授粉后 30d
达到峰值12.54ng·g-1。此后,其含量随着种子发
育急速下降,授粉70d之后变化趋于稳定且保持在
5.2ng·g-1的较低水平,其峰值比最低值高出
172倍。
这3种促进激素在扇脉杓兰种子发育过程中峰
值依次出现,先后顺序为GA3、ZR、IAA。IAA与ZR、
IAA与GA3、ZR与 GA3之间呈极显著正相关(P<
0.01),相关系数分别为0.917、0.626和0.619(表
1)。可见,在扇脉杓兰种子不同发育时期激素之间
密切联系,而起关键作用的激素又存在一定的差异。
2.2.2 脱落酸(ABA)含量和(IAA+GA3+ZR)!
ABA的变化 ABA含量在扇脉杓兰授粉时就维持
在较高水平,授粉后10 60d内发生缓慢的波动,
趋势为下降—上升—下降,授粉后20d降至最低值
(70.12ng·g-1)。授粉60d以后,ABA含量逐渐
上升,并在授粉115d时达到最高值(图5)。在扇脉
杓兰种子发育过程中,ABA含量与上述3种促进激
素呈显著负相关(P<0.05)。
内源激素之间的平衡对种子正常发育至关重
要。由图5可看出(IAA+GA3+ZR)ABA的比值
在发育初期逐渐上升,授粉后20d达到峰值,此时
代谢旺盛,胚珠迅速发育。此后该比值呈逐渐下降
的趋势,授粉70d后稳定在0.6左右。
图5 扇脉杓兰种子发育过程中脱落酸(ABA)含量和
(IAA+GA3+ZR)ABA的变化
2.3 扇脉杓兰种子发育过程中酶活性的变化
2.3.1 超氧化物歧化酶(SOD)活性变化 扇脉杓
兰授粉后0 10d,SOD活性缓慢升高。在授粉后
10 20d,SOD活性迅速上升至峰值(451.18U·
g-1·min-1),此阶段活性比授粉后 10d增加了
724%。随后SOD活性有所下降,授粉后60d出现
小幅升高,而后迅速降低,直至授粉后85d降至最
低点,最后随着种子成熟又急速上升(图6)。SOD
活性总体变化趋势与可溶性蛋白质含量基本保持一
致(图1、6)。
2.3.2 过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活
性变化 由图7可知:POD活性和CAT活性都呈单
峰曲线变化。POD活性峰值 3155.84U·g-1·
min-1出现在扇脉杓兰授粉后20d,此后活性迅速下
降,在授粉后85d降至最低并趋于稳定。CAT活性
在发育初期变化平缓,在授粉30d后开始呈直线上
升的趋势,并在授粉后60d达到峰值(1489.28U·
g-1·min-1)。随后 CAT活性又直线下降,种子成
熟时降至最低。
虽然SOD、POD和CAT活性之间无显著相关性
(P>0.05),但SOD、POD与可溶性蛋白质之间呈显
著正相关(P<0.05),其中,POD活性与可溶性蛋白
458
第6期 闫晓娜,等:扇脉杓兰种子发育过程中的生理生化变化
质含量呈极显著正相关(P<0.01),相关系数为
0.935(表1)。
图6 扇脉杓兰种子发育过程中超氧化扬歧化酶(SOD)活性的变化
图7 扇脉杓兰种子发育过程中过氧化扬酶(POD)、
过氧化氢酶(CAT)活性的变化
3 结论与讨论
3.1 营养物质的变化
种子中的营养物质既是组成细胞结构的重要成
分,也是维持生命活动的养料和能源,不同植物种子
中营养物质的变化趋势和类别有差异[20]。扇脉杓
兰种子在整个发育过程中可溶性糖含量在3.1%以
下,波动范围较小;在种子成熟时淀粉含量维持在
20%左右,是主要的贮存物质;而经济树种水黄皮
(Pongamiapinnata(L.)Piere)种子发育过程中,可
溶性糖含量水平较高,在18.49% 22.54%变动,
淀粉含量则维持在5.5% 7.4%[21]。虽然在牧草
作物老芒麦(ElymussibiricusL.)、无芒雀麦(Bromus
inermisL.)、结缕草(ZoysiajaponicaSteud.)和同德
小花碱茅(Puccineliatenuiflora(Griseb.)Scribn.et
Mer.cv.Tongde)种子中淀粉也是主要贮藏物质,
但种子质量的增加和淀粉的积累都是可溶性糖转化
的结果,可溶性糖和淀粉含量的变化趋势刚好相
反[17-18,22-23]。在红花子莲(NelumbonuciferaGaer
cn)胚中,可溶性糖的积累先于淀粉,早期胚中可溶
性糖含量已相当高,并随着胚的分化而不断上
升[24]。扇脉杓兰种子形成过程中淀粉与可溶性糖
的积累是同步的,并呈极显著的正相关。可见,在不
同植物种子中,营养物质含量差异较大,各成分的积
累时间和变化趋势也大不相同。
扇脉杓兰种子发育过程中可溶性蛋白质含量在
授粉20d后开始下降,授粉85d时降至最低,种子
趋于成熟时可溶性蛋白质逐渐积累。这与经济植物
南美蓋(Accaselowiana(O.Berg.)O.Berg.)胚胎
发生过程中蛋白质含量变化趋势一致。蛋白质是胚
胎发育的重要养料,它能够激活细胞代谢过程,促进
胚胎的形态形成[25],因此,在胚胎发生阶段需要大
量供给。红花子莲的子叶胚积累大量的蛋白质、淀
粉等营养物质,胚发育后期胚乳败育,子叶胚取代胚
乳供给营养;而扇脉杓兰是单子叶植物,种子成熟时
胚仍停留在球形胚时期,不能完全分化,不含胚
乳[4],种子中的营养物质有限,加之种子数量庞大,
单粒种子能得到的营养成分少,所以形成的低质量
型种子多败育,进而影响种子的萌发和生长进程。
为保障扇脉杓兰种子在发育时有充足的营养供给,
可采用种子离体培养法,在起始发育阶段补充大量
的糖和充足的蛋白质,以促进胚拯救过程和种子
萌发。
3.2 内源激素的作用
内源激素是种子中的一类生理活性物质,其含
量很低,但能调节种子的生理状态和生化变化,促使
种子生命活动强度的升高或降低[20]。生长素、赤霉
素和细胞分裂素都有促进细胞分裂和营养物质运输
的作用,是种子发育的促进激素。赤霉素在许多植
物中能够促进生长素的生物合成[26]。脱落酸对胚
胎发育具有双重影响,一方面能促进胚胎发育的起
始,另一方面又加速器官和组织的脱落[27-28]。
胚胎的正常发育受多种内源激素动态平衡和某
一时期某一主导激素的调控[29],而激素之间的平衡
关系比单一激素对胚胎发育或败育的作用更重要,
这是因为在植物发育过程中往往是几种激素协同作
用。在扇脉杓兰种子发育过程中,4种植物激素含
量存在明显的差异,IAA和ABA含量相对较高,GA3
和ZR则相对较低。在种子发育早期 IAA、ZR和
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林 业 科 学 研 究 第28卷
GA3含量高于发育后期,随着种子发育成熟,ABA
含量不断升高,3种促进激素含量逐渐下降,(IAA+
GA3+ZR) ABA比值也随之下降,这种变化趋势
符合种子的发育规律[30]。扇脉杓兰4种激素峰值
发生具有明显的时间顺序性,这与结缕草和偃麦草
(Elytrigiarepens(L.)Desr)的研究结果一致[22,31]。
GA3、ZR、IAA和ABA在扇脉杓兰授粉后20、30、40、
115d依次出现。可见,在种子早期发育阶段,3种
促进激素起主导作用,而在种子成熟时,ABA占优
势地位。高水平的生长抑制物和低水平的生长促进
物促使胚未完全分化的种子休眠,导致胚萌发困难
且种子败育。
此外,内源激素对贮藏物质的含量也具有调控
作用。在一种田菁(Sesbaniavirgata)植物中,ABA
通过抑制贮藏蛋白的分解和降低 α半乳糖苷酶的
活性控制贮藏物质的代谢[32]。内源激素的作用也
与胚胎发育过程相互影响。在不经受精作用和败育
的刺梨(RosaroxburghiTrat.)种子中,IAA和 GA
含量相对较低,而正常发育型种子具有较高的促进
激素水平[26]。乙烯在蝴蝶兰属(PhalaenonsisBl.)
和朵丽碟兰属(Doritaenopsis)植物授粉后能显著调
节子房发育[12,33]。掌握种子不同发育时期对激素
种类和含量的需求情况,对人为调节种胚发育过程
具有指导意义。扇脉杓兰种子成熟时高水平的抑制
激素致使内源激素平衡失调,这严重阻碍了种胚突
破种皮的生长。为促进种子萌发,可在离体培养基
中适度增加促进激素含量,维持细胞内激素的动态
平衡,打破种子休眠,促进球形胚继续分化,从而降
低种子败育率。
3.3 酶活性的影响
酶是种子发育过程中生理生化反应的有机催化
剂,绝大多数酶的成分是蛋白质[20],因此,酶的活性
与蛋白质含量呈正相关。SOD、POD和 CAT是生命
活动中具有协同作用的保护酶。种子的正常发育需
要完整的膜系统,3种保护酶对防止膜脂过氧化有
重要作用[16],其中,SOD是清除氧自由基的重要酶
之一;POD能有效保护膜结构,且与呼吸作用和生长
素水平有关;CAT可消除 H2O2的胁迫作用,抵御低
温等环境的影响[34-35]。
相比 POD和 CAT,扇脉杓兰种子发育过程中
SOD活性较低,其变化趋势随着可溶性蛋白质含量
的消长而变化,这与周碧燕等[36]的研究结果相似。
授粉20d时正值发育早期,胚珠细胞代谢旺盛,SOD
和POD活性达到最高,这有利于清除体内的氧自由
基,保护细胞膜结构完整。POD在扇脉杓兰授粉后
的50d里一直保持活跃状态,它与呼吸作用密切相
关,并能降解IAA,其含量与可溶性蛋白质呈极显著
正相关,该结果与百子莲品种(Agapanthuspraecox
ssp.Orientalis‘BigBlue’)的研究结果一致[37]。
POD和 CAT活性都呈现先升后降的变化,但 POD
活性变化的时间先于CAT。授粉后115d,虽然SOD
活性有所上升,但 POD和 CAT活性降至最低,SOD
在清除活性氧过程中积累过氧化氢,这在很大程度
上抑制了 CAT活性。种子完全成熟时保护酶活性
低,细胞膜脂易发生过氧化作用,这可能直接导致细
胞结构紊乱和种子败育。
种子的发育受内源激素含量及其平衡关系、营
养物质组成、酶活性变化等多方面生理学因素的综
合影响,各个因素内部和因素之间又发生复杂的相
互作用。本试验对各个生理生化指标的变化规律进
行了初步的探讨,而它们之间更为深入的相互作用
机理尚待研究。
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