全 文 ：书林业科学研究!"#$%!"&"#$# $#
!"#$%&$%$(#)*
!!文章编号!$##$($)*&""#$%##(##(#&
日本落叶松纤维素合酶基因片段的克隆及
单核苷酸多态性分析
易!敏! 张守攻! 谢允慧! 孙晓梅
"林木遗传育种国家重点实验室!中国林业科学研究院林业研究所!北京!$###*$#
收稿日期$ "#$)(#%("+
基金项目$ 国家%*,&计划项目""#$"-.$$)%#+#
作者简介$ 易!敏"$*&%#!女!在读博士研究生!主要从事落叶松遗传改良研究(电话$#$# /+"&&*+&%(0(1234$53136+$#)7$+89:1
!
通讯作者$博士!研究员!主要从事落叶松良种选育及定向培育技术研究(电话$#$# /+"&&*+&%(0(1234$;1<=6792>829896
摘要!)目的*纤维素合酶"9?4=4:质和产量的重要基因+ 从日本落叶松中分离克隆与纤维素合成相关的 +,-$%.基因!并对其进行核苷酸多样性以及
连锁不平衡分析!为在日本落叶松中开展基于 +,-$%.基因的连锁不平衡作图及其辅助日本落叶松木材纤维性状的
分子育种提供理论依据+ )方法*依据日本落叶松转录组数据库检测到的纤维素合酶"-$%.#基因0CD<序列设计引
物!从日本落叶松中分离获得 +,-$%.基因片段+ 在此基础上!利用 E62CF%8# 软件对日本落叶松 )# 株基因型个体
的 +,-$%.序列进行核苷酸多样性和连锁不平衡分析+ )结果*从日本落叶松中成功克隆了 -$%.基因片段$该片段
长 $ "#* GH!包含部分开放阅读框!长度为 $ #% GH!可编码 %# 个氨基酸!所推导的蛋白质氨基酸序列与火炬松/&0
-$%.1 的蛋白质氨基酸序列同源性为 *%8)I+ 在日本落叶松 )# 株基因型个体的 +,-$%.序列中共检测到 & 个 CJF
位点!CJF发生频率为 $K"$ GH!多样性指数
!
2
为 #8##+ #%+ 在这些 CJF<中!+* 个属于转换!$) 个属于颠换!其中
$* 个为常见 CJF义突变+ 进一步的连锁不平衡分析显示!随着核苷酸序列长度的增加!CJF连锁不平衡程度逐渐减弱+ )结论*!
克隆到的 +,-$%.为植物-$%.基因家族中的一员+ +,-$%.基因的连锁不平衡在基因内部就已衰退!说明选择该基因
作为候选基因!在日本落叶松中开展连锁不平衡作图用于指导日本落叶松的定向培育及木材品质改良是可行的+
此外!在 +,-$%.基因中检测到多个常见 CJF位点!为进一步开展该基因的连锁不平衡作图提供了材料+
关键词!日本落叶松(纤维素合酶基因(基因克隆(单核苷酸多态性
中图分类号!C,*$L"" 文献标识码!B
!"#$%&#(%()*(+$,-./$,#&),0#$12#345"2"6(%$1""#78,$.$#",
*1(&5%",9,(,:3%+2,(&(!"#$% &"()*#$
34567! 89.:;<*"=0>"7>! ?4@3=70*=6! "C@2@?M?5N2G:O2@:O5:>DO??P?6?@39<26Q .O??Q36R!S?U:O?<@O5!-A36?U:O?<@O5!.?3V36R!$###*$!-A362#
6;"&3%/&$ <;=,/&>,!-?4=4:H426@9?4=4:XA39A 9:6@O:4<@A?Y=243@526Q 53?4Q :>X::Q >3G?O8DA3>O:1+(#6C,($BDE$#6! 26Q >=O@A?O26245Z36R@A?6=94?:@3Q?Q3[?O<3@526Q 436W2R?Q331H:O@26@R?6?@39>:=6Q2@3:6 2<<:932@?Q X3@A +,-$%.R?6?26Q R?6?(2<<3<@?Q GO??Q36R:>6?XR?O1H42<1G4?X::Q >3G?O@O23@<36 +F,($BDE$#6F?,&5#)!B99:OQ36R@:@A??;HO?<9?4=4:@A2O:1+F,($BDE$#6@O26<9O3H@:1?Q2@2G2O2R1?6@?69:Q36R-$%.X2<3<:42@?Q >O:1+F,($BDE$#6G5
R?6?(39F-S21H43>392@3:68DA?R?6:139+,-$%.36 )# 36Q3[3Q=24@A?6 @A?<36R4?6=94?:@3Q?H:451:OHA3<1<"CJF<# Q3[?O<3@526Q 436W2R?Q3+,-$%.X?O?26245Z?Q =(
林!业!科!学!研!究 第 "& 卷
<36RE62CF%8# <:>@X2O?8@,".$&!DA?-$%.>O2R1?6@X2<$ "#* GH 36 4?6R@A X3@A 2H2O@324:H?6 O?2Q36R>O21?
"\SU! $ #% GH# XA39A X:=4Q G?92H2G4?@:?69:Q?2HO?Q39@?Q HO:@?36 :>%# BB8DA?@A?Q?Q=9?Q 2136:293Q<O:1/67=%&($G(FB@:@24:>& CJF26Q @A?>O?Y=?69526Q Q3[?O<3@5:>CJF<"
!
D
# X?O?$K"$ GH 26Q #8##+ #%! O?4:6R36R@:@O26<3@3:6 @5H?26Q ") G?4:6R36R@:@O26<[?O<3:6 @5H?! 3694=Q36R$* 9:11:6 CJF<26Q +) O2O?CJF<8T6
@:@24! %) CJF+,-$%.! 21:6RXA39A "# X?O?<56:651:=<1=@2@3:6 26Q )
X?O?13<436W2R?Q36=94?:@3Q?4?6R@A88#(/$."#(!DA?O?<=4@<:>@A3<<@=Q536Q392@?@A2@+,-$%.3<21?1G?O:>-$%.R?6?>213458DA?
436W2R?Q3+,-$%.<=RR?<@<@A2@@A?R?6?9:=4Q G?=926Q3Q2@?R?6?>:ONE12HH36R!XA39A 9:6@O3G=@?@:@A?Q3O?9@3:6249=4@3[2@3:6 26Q X::Q Y=243@531HO:[?1?6@36 ]2H(
26?=O@A?ONE12HH36R8
A,1 B#3)"$+(#6C,($BDE$#6( 9?4=4:纤维素是植物细胞壁的主要成分之一!也是地
球上最丰富的天然有机物和重要的可再生资源,$- +
在树木中!纤维素含量为 )# %^#I,"- !是造纸和纸
浆业最重要的天然原料!可以创造巨大的商业价值+
由于日本落叶松"+(#6C,($BDE$#6"N21G8# -2O8#具
有生长迅速.适应性强.木材密度较其他针叶树种
高.造纸工业利用率高等优点!被认为是有广阔市场
前景的短周期纸浆用材树种, /)- + 因此!深入研究
纤维素的生物合成途径!挖掘控制木材纤维品质和
产量的重要基因!对于日本落叶松的定向培育及木
材品质改良具有重要意义+
纤维素合成酶"9?4=4:纤维素合成途径中的关键酶!通常以一个六边玫瑰
型复合体的形式存在于细胞质膜上,%- + $**+ 年
F?2O等,+-从棉花";"%HD6=B*6#%=&=BN366#中克隆了
第 $ 个植物纤维素合酶基因!随后又相继在拟南芥
".#(I6G"D%6%&*(J6(7( "N8# _?56A8#
,,-
.玉米 "8$(
B(H%N8#
,&-
.水稻"K#HL( %(&6M( N8# ,*-等植物中分离
克隆出多个 -$%.基因+ 林木中首次克隆的纤维素
合酶基因是从美洲山杨"/"D=J=%&#$B=J"6G$%` 39A;#
中得到的/&#-$%.N 基因!表达分析表明该基因在木
质部特异表达!与次生壁的形成有关,$#- + 随后!又
在毛果杨"/F)*")(#D( D:O8aPO25#中鉴定出了 $&
个 -$%.基因!其中 /&#-$%.O!/&#-$%.P!/&#-$%.Q!
/&#-$%.R!/&#-$%.NQ 和/&#-$%.NR 都在木质部特异表
达,$$ /$"- + 而针叶树纤维素合酶的研究起步较晚!直
到 "##% 年才从新西兰辐射松 "/67=D%#(G6(&( E8
E:6#中克隆到 $ 个全长的/#-$%.NS 基因!该基因在
次生木质部中表达水平较高,$- + 之后!又在火炬松
"/67=%&($G( N8#中克隆到 个与次生细胞壁合成有
关的-$%.基因,$)- + 上述研究显示!虽然纤维素合
酶基因已在部分树种中分离克隆!且这些基因都不
同程度的参与了植物初生.次生细胞壁的形成!但不
同植物的纤维素合酶基因的成员数量.结构以及表
达模式不尽相同!而且目前关于日本落叶松纤维素
合酶基因的克隆研究也罕有报道+ 所以!在日本落
叶松中克隆-$%.基因成员具有重要的应用价值+
为此!本研究以选自日本落叶松原生种源K家系
试验林能最大程度地反映日本落叶松分布范围的
)# 株基因型个体为材料!克隆 +,-$%.基因片段!分
析该基因的结构和系统进化!为后续的 +,-$%.基因
全长的克隆及功能分析提供了试验依据+ 另外还在
此基础上对该基因片段的单核苷酸多态性"<36R4?
6=94?:@3Q?H:451:OHA3<12R?Q3中开展 +,-$%.基因的连锁不平衡作图奠定基础+
$!材料和方法
C8CD植物材料
以 $**& 年建于湖北长岭岗林场的日本落叶松
种源K家系试验林为材料!该试验林包括日本落叶松
自然分布区内 + 个种源"产地#的 &) 个天然林分
"草津林分 "# 个.浅间林分 + 个.富士林分 $+ 个.日
光林分 $& 个.伊那林分 $% 个.松本林分 * 个#和日
本国内各种子园的 $", 个家系"北海道美呗种子园
) 个.栗山种子园 )% 个.岩手县盛冈种子园 , 个.长
野县小诸种子园 +, 个.江刺种子园 " 个以及北海道
和长野县 " 个混和#!共 "$$ 个林分K家系!同时以辽
宁丹东.山东崂山和湖北建始的 个母树林及 $ 个
辽宁种子园做为对照+ 从这片试验林中随机选取了
)#
第 期 易!敏等$日本落叶松纤维素合酶基因片段的克隆及单核苷酸多态性分析
)# 株最能反映日本落叶松天然分布范围的基因型
个体"表 $#!采集完全展开的新叶置硅胶中带回实
验室放于超低温冰箱" /&#b#中保存备用+
表 CD供试材料来源
产地 种子来源
林分K
家系数
入选
株数
采种地情况
纬度 经度 海拔K1 年平均气温Kb 年降水量K11
日本
日本北海道
日本岩手县
日本长野县
中国
总计
草津国有林天然林 "# + +c%d $&c#d $ ,) +8* $ ,),
浅间国有林天然林 + " +c"#d $&c#d *", *8 $ +#
富士国有林天然林 $+ + %c#d $&c)%d &)) $#8% $ %*%
伊那国有林天然林 $% % %c)%d $&c$#d $ ,"+ %8* $ ,*%
日光国有林天然林 $& , +c)%d $*c"%d $ ))) %8* " ##
松本国有林天然林 * +c"#d $*c)%d $ +"# $)8# $ "++
北海道美呗种子园 ) $ )c"#d $)$c%#d "# ,8# $ #%
北海道栗山种子园 )% $ )c#&d $)$c)%d "+ ,8" $ "&
北海道远轻种子园"混合# $ $ ))c##d $)c"#d "+ %8 *"*
岩手县盛冈种子园 , $ *c)"d $)$c$#d $% $#8 $ $#
岩手县江刺种子园"混合# " $ *c$#d $)$c$"d )# $#8, $ "#
长野县小诸种子园 +, $ +c"#d $&c)#d &) *8* $ %,&
长野县安云种子园"混合# $ $ +c$#d $,c)%d $ $% ,8$ $ *$
辽宁丹东母树林"混合# $ $ )#c#d $")c#%d "# &8# ,%#
山东崂山母树林"混合# $ $ +c#%d $"#c"%d $$# $"8# $ ###
辽宁清源种子园"混合# $ $ )"c)%d $"%c)&d %%# +8# +%#
湖北建始母树林"混合# $ $ #c)%d $#*c)%d $ ,## $%8# $ +##
"$$ )#
CEFD总G-6$总@-6提取及/G-6合成
总EJB的提取参照EJBP0J#说明书描述的方法进行+ 总 SJB的提取使用
DBMBSB公司试剂盒"SJB3<:F4=<#!9EJB第一链
的反转录合成使用 DBMBSB公司试剂盒"S?[?ODO26<9O3H@2CEHD!&+,-基因片段的克隆
对本研究前期测序获得的日本落叶松转录组数据
库,$%-进行比对分析后获得-$%.基因片段的0CD序列!
以该序列为模板!使用FO31?OFO?13?O%8# 软件设计一
对特异性引物!上游引物$%/(-BD-BB-P-DDBDP(
PBBBB-PP(/(下游引物$%/(DDPDPDDDDBD--DD-P(
PDD-B(/+ 由深圳华大基因公司合成+
扩增的F-S反应体系为 #
"
N$NB$# fG=>?O
"
N.QJDF)
"
N"$# 11:40N
/$
#.NBD2Y EJB聚合
酶 #8
"
N"% gK
"
N# "以上试剂购自 DBMBSB公
司#!上游和下游引物各 $8"
"
N"$#
"
1:40N
/$
#.
9EJB$
"
N.QQ_
"
\$*L
"
N+ 扩增程序为$*)b预
变性 % 136!*)b变性 # +# )b保存+ F-S扩增产物经胶回收与 H E`$*(DC31(
H4?e?9@:O载体连接转化大肠杆菌 E_%
#
!经菌落检
测的阳性克隆送至上海美吉公司进行测序+
C8ID目的基因的序列分析
应用EJB` BJ+8# 软件对目的基因的 9EJB编
码氨基酸序列进行分析(并用 .3:0Q3@[?O<3:6 ,8# 软
件和.NBCD检索 P?6.26W 进行多重序列比较和同
源性分析(用 0`PB%8#% 软件的 J?3RAG:O(]:3636R
"J]# 算法分析同源基因间的进化关系!并构建该蛋
白的系统进化树+
CEJD!&+,-基因的*-0多样性分析
利用.3:0Q3@的-4=<@24h程序对同一基因片段
的 )# 条拼接完整的序列进行比对!获得基因片段的
一致序列!结合 E62位点!计算 CJF频率.转换和颠换的 CJF数量!分析
同义突变和非同义突变的碱基变异情况及对相应氨
基酸的影响!估算基因的核苷酸多样性水平!并进一
步分析连锁不平衡的延伸模式+
"!结果与分析
FECD日本落叶松 !&+,-基因片段的克隆及其序
列分析
!!分别以日本落叶松 9EJB和总 EJB为模板!依
据日本落叶松转录组数据序列检索到的 -$%.0CD
序列设计特异性引物进行 F-S扩增!经 $I的琼脂
糖电泳检测!发现特异性扩增出 $ 条约 $ "## GH"图
%#
林!业!科!学!研!究 第 "& 卷
$ B#和 $ 条约 $ ,## GH "图 $ .#的基因组 EJB
片段+
经回收.连接.转化.测序之后发现!克隆的 9E(
JB片段长为 $ "#* GH!包括 $%+ GH的 i端非编码区
"dg6(@O26<42@?Q O?R3:6!dgDS#和部分开放阅读框!
大小为 $ #% GH!可编码 %# 个氨基酸+ 克隆的基
因组EJB片段长为 $ ,$% GH!与 9EJB序列对比发
现该片段包含 个外显子和 " 个内含子!其中第一
外显子不完全+ 外显子长度分别为 $$, GH.%$ GH
和 %&% GH!符合典型的PDKBP规则"图 "#+
B$+,-$%.基因的9EJB扩增产物 .$+,-$%.基因的 EJB扩增产物
$`EN%### 12OW?O
图 $!+,-$%.基因的F-S扩增结果
图 "!日本落叶松 +,-$%.基因片段的核苷酸序列"阴影部分为外显子区域#
将日本落叶松-$%.基因与P?6.26W中 ) 个-$0
%.基因所编码蛋白的氨基酸序列进行同源比较和
结构分析!结果表明"图 #$NW-?B@-?性分别为 &)8+I和 ,&8+I+ 典型的植物纤维素合
酶基因含有 " 个高度保守的亚结构域" C=GQ:1236<
B和.#!在 C=GQ:1236酸残基"E#!主要为纤维素合成所需底物"gEF(P#
的结合域(C=GQ:1236<.中除含有 $ 个保守的天冬
氨酸残基外!还有另一个 j;;Sh"谷氨酰胺(;(;(精
氨酸/色氨酸#保守序列!其功能与纤维素合成酶的
催化活性有关,$+ /$,- + 另外还含有 & 个高度保守的
跨膜结构域!其中 " 个位于 J(端!+ 个位于 -(端!是
$
($!)(葡萄糖苷链穿过质膜进入细胞壁的重要通
道,$&- + 从图 可以看出!+,-$%.基因片段的氨基酸
序列也含有位于-端的 + 个跨膜结构域区域!同时
还含有位于 C=GQ:1236<.中的一个保守 E残基和
j;;Sh保守序列+
+#
第 期 易!敏等$日本落叶松纤维素合酶基因片段的克隆及单核苷酸多态性分析
"
D` /&$跨膜结构域(
#
$E残基和j;;Sh区域(NW-?F@-?蛋白(B@-?图 !日本落叶松与其它植物-?为了分析日本落叶松NW-?蛋白的系统发育进化关系!利用 0`PB软件将在
J-.T注册的拟南芥.大麦.火炬松.海岸松.杉木.赤
桉.巨桉.美洲山杨等 & 个物种的氨基酸序列进行序
列分析!得到了这些 -?)#+ 由图 ) 可以看出!-?<蛋白由极点向 " 个方向
发生了进化!形成了 " 个分枝+ 拟南芥 B@-?大麦_[-?分为 " 个亚分支!分别向裸子植物和被子植物方向
发生分歧!其中日本落叶松 NW-?FEFD!&+,-基因的*-0多样性分析
对 +,-$%.进行 CJF<多样性分析可以获得该基
因在日本落叶松进化史上所发生的单核苷酸突变位
点!是进行连锁不平衡作图的基础+ 因此!在分析
+,-$%.9EJB序列的基础上!对取自日本落叶松自
然分布区.能最大范围覆盖其生长区域的 )# 株基因
型个体进行克隆测序!然后利用 .3:0Q3@软件的
-4=<@24h程序对 )# 条拼接完整的序列进行比对!将
出现的单碱基变化的位点确定为 CJF位点+ 图 % 是
+,-$%.基因的部分核苷酸序列的比对结果!在第 $
%"% GH处出现的-(D变化.第 $ %" GH 处出现的 D(
-变化.第 $ %+ GH 处出现的 B(P变化和第 $ %%+
GH处出现的-(D变化记为 ) 个 CJF位点+
B@$拟南芥.#(I6G"D%6%&*(J6(7( "N8# _?56A(_[$大麦9"#0
G$=BM=J>(#$N(F@$火炬松 /67=%&($G( N8(-4$杉木 -=70
767>*(B6( J(7)$"J(&( "N21G#_::W8(FO$海岸松 /67=%D60
7(%&$#B3@:6(F@O$美洲山杨/"D=J=%&#$B=J"6G$%` 39A;8(09$
赤桉@=)(JHD&=%)(B(JG=J$7%6%E?A6A8(0R$巨桉 @=)(JHD&=%
>#(7G6%_34?;` 23Q?6
图 )!NW-?由表 " 可知!长度为 $ ,$% GH 的序列中共检测
到 & 个 CJF<位点!CJF频率为每 "$ GH基因组序列
出现 $ 个 CJF位点!其中外显子.内含子和 dgDS
的 CJF位点分别为 %).") 和 % 个!频率分别为 $K
"#.$K"$ 和 $K$+ 另外!在 +,-$%.基因中还发现了
, 个插入K缺失标记!长度在 $ "^$ GH+ 这 , 个插入K
缺失都发生在基因的非编码区!其中有 ) 个为单碱
基插入K缺失!$ 个双碱基插入K缺失!剩下两个的插
入K缺失长度分别为 $ GH和 "$ GH+
,#
林!业!科!学!研!究 第 "& 卷
图 %!+,-$%.基因 CJF位点筛选示意图
表 FD!&+,-基因内*-0数量及其频率
+,-$%. 总计 外显子 内含子 dgDS
序列长度 $ ,$% $ #% %#+ $%+
CJF数量 & %) ") %
CJF频率 $K"$ $K"# $K"$ $K$
进一步分析了 +,-$%.基因中的 & 个 CJF<位
点的变异类型"表 #!结果显示$& 个 CJF<中!有
+* 个属于转换类型!分别包含 # 个 B
$
P和 * 个
D
$
-(有 $) 个属于颠换类型!分别包含 + 个B
$
-."
个D
$
P.% 个B
$
D和 $ 个P
$
-!转换K颠换的比例
为 )8*k$+
表 HD!&+,-基因内*-0"变异类型
基因 CJF数量
替代类型
转换
B
$
P D
$
-
颠换
B
$
- D
$
P B
$
D P
$
-
+,-$%. & # * + " % $
FEHD*-0"引起的氨基酸变异
为了检测 +,-$%.基因编码区内核苷酸位点的
改变是否影响了其编码的氨基酸序列!在分析 CJF
多样性的基础上对 CJF的突变类型进行了统计!并
对其引起的氨基酸变异进行了分析+ 从表 ) 可以看
出!在 +,-$%.基因内部检测到的 & 个 CJF<中!有
$* 个为常见 CJF<"频率
%
%I#!+) 个为罕见 CJF<+
在编码区内的 %) 个 CJF<位点中!有 "# 个属于同义
突变!其中有 " 个位于密码子的第 $ 个核苷酸上!剩
下的 $& 个均位于密码子的第 个核苷酸上(另外 )
个属于错义突变!没有检测到无义突变+ 在这 ) 个
错义突变中!有 $" 个位于密码子的第 $ 个核苷酸
上!"$ 个位于密码子的第 " 个核苷酸!此外还有 $ 个
位于密码子的第 个核苷酸上+ 其中!有 " 个属于
常见 CJF上!其密码子由原来的 BDD和 DD-转变为 PDD和
D--!氨基酸由原来的异亮氨酸和苯丙氨酸转换为
缬氨酸和丝氨酸+
表 ID!&+,-基因内*-0"的鉴定
基因 常见 CJF罕见 CJF
非同义突变
错义突变 无义突变
同义
突变
非编
码区
+,-$%. $* +) ) # "# "*
FEID!&+,-基因的核苷酸多样性分析
使用E62性分析+ 以
"
值和
!
值两个参数衡量候选基因的核
苷酸多样性+ 从表 % 可以看出!日本落叶松 +,-$%.
基因的总核苷酸多样性参数
"
T
和
!
2
分别为 #8#$$
*$ 和 #8##+ #%!其中U(VU%l#8)"" " m$!说明该基
因的同义突变遗传变异大于非同义突变!可以推断
纯化选择是 +,-$%.基因内同义 CJF位点的主要选
择压!核苷酸序列比较保守+ 采用四配子检测进行
最小历史重组事件"
5
#估算结果表明!+,-$%.基因
的
5
值为 %!除以信息位点数后得到每一位点发生
的最小重组事件为 #8#++ 利用 D2V312/26Q N3/!进行的中性检验结果表明!E!值均为负
值!而且 U= 26Q N3/+,-$%.基因可能受到了负选择的作用!而且还存在
低频率的等位基因!这与在 +,-$%.基因中发现大量
的罕见 CJF<是一致的+
&#
第 期 易!敏等$日本落叶松纤维素合酶基因片段的克隆及单核苷酸多态性分析
表 JD!&+,-基因的核苷酸多样性
基因 C %
X
!
D
!
<34
!
<56
!
6:6(<56
M2KM< _ _E
S
`
S
`
KC
D2V312/E
!
U= 26Q N3/E
!
+,-$%. & #8#$$*$ #8##+#% #8##*"" #8#$&, #8##"), #8)""" & #8**, % #8#+ /$8,*$$
/)8",)&$
!!
!!注$C$分离位点数(
!
D
$整个基因区域单核苷酸多样性(
!
<34
$编码区同义位点及其他区域位点多样性(
!
<56
$同义位点多样性(
!
6:6(<56
$非同义
位点多样性(M<$同义突变率(M2$非同义突变率(_$单体型(_E$单体型多样性(S` $最小历史重组事件(
!!
/m#8#$
FEJD!&+,-基因内*-0"的连锁不平衡分析
为了了解 +,-$%.基因内 CJF位点在日本落叶
松 )# 株基因型个体间连锁不平衡的延伸长度及程
度!利用E62CF软件中的 NE分析程序分析了 +,-$0
%.基因中 CJF的连锁不平衡水平+ 由图 + 可以看
出!随着 +,-$%.基因核苷酸序列长度的增加!CJF
的NE程度逐渐减弱!当长度达 +&# GH 左右时!#" 值
迅速下降到 #8" 以下!说明 CJF的连锁不平衡在
+,-$%.基因内部就已经衰退了+
图 +!日本落叶松 +,-$%.基因内 CJF<的连锁不平衡
!结论与讨论
通过对日本落叶松转录组数据的查找分析!克
隆获得了一个长为 $ "#* GH的-$%.基因片段序列!
核苷酸序列分析结果显示!其与多种植物的 -$%.基
因具有较高的同源性!可初步确定其为植物 -$%.基
因家族中的一员+ 多重序列比对结果亦显示其编码
的氨基酸序列中含有纤维素合酶所特有的位于 -(
端的 + 个跨膜结构域!同时还含有位于 C=GQ:1236<
.中的一个保守E残基和j;;Sh区域!从而进一步
证明本文克隆到的序列为日本落叶松的纤维素合酶
基因片段+ 目前P?6.26W中尚无落叶松属植物纤维
素合酶基因的研究!日本落叶松 +,-$%.基因片段的
克隆不仅能为 +,-$%.基因全长的克隆及功能分析
提供信息资源!也为分离其它近源种 -$%.基因奠定
了基础+
对 +,-$%.基因进行 CJF发生频率的研究!结果
表明!长度为 $ ,$% GH的序列中共含有 & 个 CJF位
点!CJF频率为 $K"$ GH!与周亚楠,$*-等对日本落叶
松 O-+基因检测的 $K"#8, GH 的频率相当!高于花
旗松"/%$=G"&%=>( B$7L6$%6" 3`OG?4# UO269:#的 $K)+
GH
,"#-
!低于毛白杨"/"D=J=%&"B$7&"%( -2O#/&A?基因的 $K$& GH,"$- + 这可能是由于不同物种和基因
在进化过程中受到的选择压不同导致基因的保守性
不同+
对 +,-$%.基因的核苷酸多样性的分析表明$
+,-$%.基因的核苷酸多样性参数
!
2
"#8##+ #%#与
花旗松抗寒K木材质量相关候选基因中发现的多样
性程度相类似"
!
l#8##+ %%#
,"#-
!高于西伯利亚落
叶松"
!
l#8##% +#
,""-
+ 但与其他针叶树种相比!
日本落叶松的多样性水平要比云杉属高出 " ^ 倍
"
!
l#8##" #^8###
,"-
!略低于毛白杨的/&!
l#8##*")#和 /&!
l#8#$# *#
,")-
+ 由此推
测日本落叶松 +,-$%.基因的核苷酸多样性属于中
等水平!这主要是因为日本落叶松是一个以异交为
主的树种!而且本实验中所选的材料最大程度地反
映日本落叶松的天然分布范围!所以核苷酸多样性
水平较高+ 而不同的树种由于分布范围.进化历史
以及材料来源.群体大小的不同!会产生不同的遗传
基础!从而造成核苷酸多样性的差异+ 另外!根据所
选候选基因的类别.数量以及完整性的不同!核苷酸
多样性也会发生相应的变化!所以说在不同树种间
进行核苷酸多样性的精确比较还很困难+
本研究所得到的 +,-$%.基因每一位点发生的
最小重组事件数为 #F#++ 与之前日本柳杉"-#HD&"0
B$#6( W(D"76)( "N8>8# E8E:6#内检测到的最小重组
事件值"#8### # #^8#%" +#相类似,"%- !但比欧洲赤
松"/F%H6M$%%N8#的要低"#8"%# ,"+- + 造成这一结
果的主要原因可能是日本落叶松和日本柳杉的天然
分布范围类似!而欧洲赤松则广泛分布在欧亚大陆!
有效群体数远大于日本落叶松!从而导致较高的重
组率+
了解连锁不平衡的延伸模式对关联分析来说十
分重要!因为NE程度不仅影响关联作图的分辨率!
而且还决定了在基因组扫描过程中所需的最少标记
*#
林!业!科!学!研!究 第 "& 卷
数目,",- + 所以究竟是选择全基因关联分析策略还
是候选基因关联分析策略主要取决于目标群体内的
NE程度+ 由本研究的结果可以看出!随着 +,-$%.
基因核苷酸序列长度的增加!CJF<连锁不平衡程度
逐渐减弱!当长度达 +&# GH 左右时!#" 值迅速下降
到 #8" 以下+ 与之前报道的火炬松,"&- .樟子松"/F
%HJM$%%[2O8B"7>"J6)( N3@[8#
,"*-
.花旗松,"#-等的结
果一致!CJF的连锁不平衡同样在候选基因内部就
已衰退!也进一步说明在日本落叶松中基于候选基
因的NE作图是可行的+ 而在 +,-$%.基因中检测到
多个 CJF位点!也将为今后开展日本落叶松材性相
关基因的连锁不平衡作图提供理论依据+
参考文献!
,$- E?41?OEF8-?4=4::O2Q3>39=4@
>3?4Q :><@=Q5,]-8B66= S?[F426@FA5<3:4F426@` :4.3:4!$***!%#$
")% /",+
,"- U?6R?4E! h?R?6?OP8h::Q$ 9A?13<@O5! =4@O2<@O=9@=O?! O?29@3:6<
, -`8.?O436$h24@?OQ?PO=5@?O! $*&)!"+ /+%8
,- 王军辉!张守攻!石淑兰!等8日本落叶松纸浆材造纸性能的研究
,]-8北京林业大学学报!"##)!"+"%#$,$ /,)8
,)- 孙晓梅!张守攻!李时元!等8日本落叶松纸浆材优良家系多性状
联合选,]-8林业科学!"##%!)$")#$)& /%)8
,%- M31=O2C! N2:<369A23h! T@:A D8T11=6:R:4Q 42G?436R:>O:<<@?@?O(
136249?4=4:7(
(7>=J(#6%,]-8F426@-?4!$***!$$$"#,% /"#&%8
,+- F?2O]S! M2X2R:?n! C9AO?9W?6R:<@h 0! $&(JF_3RA?OH426@<
9:6@236 A:1:4:R<:>@A?G29@?O324)$J.R?6?<=G=63@:>9?4=4:@A?J2@3:624B92Q(
?15:>C93?69?,,- S39A1:6Q DB! C:1?O[34?-S8DA?9?4=4:21345
,]-8F426@FA5<3:4:R5!"###!$")$)*% /)*&8
,&- BHH?6Z?4?ON! E:G436 !` .2O?3O:S! $&(J8-?4=4:123Z?$ 3<:42@3:6 26Q ?;HO?<<3:6 26245<3<:>@A?9?4=4:"-$%.# R?6?>21345,]-8-?4=4:,*- D262W2M! =`O2@2M! n212Z2W3` ! $&(J8DAO??Q3<@369@O39?9?4=(
4::O9?4=4:36 @A?,$#- h= N! ]:399?4=4:R?6?>O:12<@O?<<,]-8F426@]:=O624!"###!""$)*% /%#"8
,$$- C:O252E! 2`@G429W
9:@:6X::Q"/"D=J=%)*")(#D(# O?[?24<$& 9:6<56@A2,$"- C=Z=W3C! N3N! C=6 n_! $&(JFDA?9?4=4:H?O>2134526Q G3:9A?13924>=69@3:6<:>;54?1(399?4=4:@A2$)"$$" /$")%8
,$- MO2=0! _2O3/#-@<.NS 3<36[:4[?Q 36 9?4=4:9A?3Q<:>@A?R516:$#, /$$+8
,$)- J23O6 -]! _236 Q?[?4:H36R;54?12O?:O@A:4:R:=<@:R?6?<:>26R3:,$%- 许晨璐8落叶松基因挖掘及基因差异表达与杂种优势形成机制
探讨,E-8北京$中国林业科学研究院!"#$8
,$+- ]:9?4=4:<56@A?<3<36 H:H42O<,]-8J?XFA5@:4:R3<@!"##)!$+)$ % /+$8
,$,- S39A1:6Q DB! C:1?O[34?-S8DA?9?4=4:213(
45,]-8F426@FA5<3:4!"###!$")$)*% /)*&8
,$&- S39A1:6Q D8_3RA?OH426@9?4=4:"###!$")#$##$ /##+8
,$*- 周亚楠!李!爱!陈成彬!等8日本落叶松杂种及亲本 O-+ 基因
的克隆和 CJF多态性分析,]-8林业科学研究!"#$!"专刊#$
#$& /#")8
,"#- MO=@:[Y=343GO3=1 36 9:4Q(A2OQ36?<<26Q X::Q Y=243@5(O?42@?Q 926Q3Q2@?
R?6?<36 E:=R42<>3O,]-8P?6?@39,"$- E= j!F26 h!D326 ]!$&(J8DA?gEF/R4=9=O:62@?Q?92OG:;542R?6?>2134536 F:H=4=<$ <@O=9@=O?! ?;HO?<<3:6! 26Q 2<<:932@3:6 R?(
6?@39<,]-8FN:C \6?!"#$! &$ ?+#&
,""- C?1?O3W:[eN! C?1?O3W:[2C B! F:4?ZA2?[2` B8J=94?:@3Q?Q3(
[?O<3@526Q 436W2R?Q32Q2H@3[?<3R63>3926@R?6?<36
N2O3;"F3629?2?#,]-8S=<<326 ]:=O624:>P?6?@39*"8
,"- J21O:=Q `-! P=34?@/-42=Q?-! 2`9W25]! $&(JF :`4?9=42O?(
[:4=@3:6 :>O?R=42@:O5R?6?<36 O:1Q3>?O?6@9:6@36?6@<$ A?@?O:R?6?:=436W2R?Q34?9@3:6 G=@9:O?42@?Q O?9?6@Q?1:RO2HA399A26R?<,]-8]` :40[:4!
"#$#!,#$,$ /&+8
,")- oA26RE! p= .! n26Rp! $&(J8DA?<=9O:21345
36 F:H=4=<$ <@O=9@=O?! ?;HO?<<3:6! 26Q ?[:4=@3:6,]-8DO??P?6?@39<
aP?6:1?,"%- M2Q:D!n:>?O! -#HD&"B$#6( W(D"76)( "-:HO?<<29?2?"##!$+)$$%), /$%**8
,"+- E[:O65W e! C3O[3qB! 3`WW:6?6 !` $&(JFN:X6=94?:@3Q?Q3[?O<3@5
2@@A?H24$ 4:9=<36 @A?X3Q?45Q3<@O3G=@?Q /67=%%HJM$%%,]-8` :(
4?9=42O.3:4:R526Q 0[:4=@3:6!"##"!$*$$,* /$&&8
,",- hA3@C S! .=9W4?O0.8g<36R62@=O2424?439Q3[?O<3@5@:?[24=2@?
R?6?>=69@3:6,]-8` ?@A:Q<` :4.3:4!"##("+$$" /$)#8
,"&- P:6Zr4?Z(`2O@s6?ZC -! 0O<:Z0! .O:X6 PS! $&(JFEJBY=?69?[2O32@3:6 26Q @2R<36R4?6=94?:@3Q?H:451:O(
HA3<1<2@926Q3Q2@?R?6?<>:OQO:=RA@(<@O?<+,]-8P?6?@39<"##+!$,"$$*$% /$*"+8
,"*- E[:O65W e! C3O[3qB! 3`WW:6?6 !` $&(J8N:X6=94?:@3Q?Q3[?O<3@5
2@@A?H24$ 4:9=<36 @A?X3Q?45Q3<@O3G=@?Q /67=%%HJM$%%,]-8` :(
4?9=42O.3:4:R526Q 0[:4=@3:6!"##"!$*$$,* /$&&8
#$