全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(11): 19251935 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家自然科学基金项目(31071457), 湖南省科技计划重点项目(2012NK3062), 湖南省教育厅项目(SCX1103)和湖南省教育厅
科学研究一般项目(12C0156)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 张学文, E-mail: xwzhang@hunau.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: llyyxxtc@163.com ** 同等贡献(Contributed equally to this work)
Received(收稿日期): 2014-03-10; Accepted(接受日期): 2014-09-16; Published online(网络出版日期): 2014-10-08.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20141008.0958.010.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.01925
两种苎麻纤维素合酶基因 cDNA序列的克隆及表达
刘昱翔 1,** 陈建荣 2,** 彭 彦 1 黄 妤 1 赵 燕 1 黄丽华 1
郭清泉 2 张学文 1,*
1湖南农业大学生物科学技术学院, 湖南长沙 410128; 2长沙学院生物工程与环境科学系, 湖南长沙 410003
摘 要: 从苎麻转录组数据出发 , 利用 Blast 工具从中分析出与多种植物纤维素合酶高度相似的片段 CL789 和
Unigene 20360。根据片段信息设计特异性引物, 从苎麻[Boehmeria nivea (Linn.) Gaud.]栽培种湘苎 3号中克隆纤维素
合酶核心片段, 并利用 5及 3RACE技术获得 2个片段的全长 cDNA。两者都具有典型的纤维素合酶特征结构域, 表
明为 2 个苎麻纤维素合酶基因 CesA 的 cDNA 序列, 分别命名为 BnCesA2 和 BnCesA3。BnCesA2 基因编码区全长度
3240 bp, 编码 1079氨基酸多肽; BnCesA3基因编码区全长 3120 bp, 编码 1039氨基酸多肽。对 BnCesA2和 BnCesA3
基因在湘苎 1 号、湘苎 3 号、湘潭大叶白和城步青麻苎麻品种木质部和韧皮部荧光定量 PCR 分析显示, 2 个基因在
不同品种苎麻的木质部及韧皮部都有表达, 但表达量存在着一定差异, 整体而言 BnCesA2 具有更高的表达水平, 其
木质部和韧皮部的表达都为 BnCesA3的 2~5倍。推测 BnCesA2和 BnCesA3均参与了苎麻细胞壁的次生合成。
关键词: 苎麻; 纤维素合酶基因; cDNA克隆; 表达分析
cDNA Cloning and Expression of Two Cellulose Synthase Genes from Boeh-
meria nivea
LIU Yu-Xiang1,**, CHEN Jiang-Rong2,**, PENG Yan1, HUANG Yu1, ZHAO Yan1, HUANG Li-Hua1, GUO
Qing-Quan2, and ZHANG Xue-Wen1,*
1 College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2 Department of Biotechnology and Environ-
mental Science, Changsha University, Changsha 410003, China
Abstract: Two potentially high homologous fragments CL789 and Unigene 20360 were identified as plant cellulose synthase
character sequence from the transcriptome data we obtained previously by Blast aligning and homologous screening. The two
pairs of specific primers were then designed based on the CL789 and Unigene 20360 sequences information. The intermediate
fragments of two cellulose synthase gene cDNA were cloned from ramie variety Xiangzu 3 by RT-PCR. And the whole cDNA was
cloned by followed 5 and 3 RACE. The full length cDNAs were sequenced and their encoded putative proteins were identified as
cellulose synthase by the conserved domain analysis. The‘se two cDNA sequences were named as BnCesA2 and BnCesA3 respec-
tively. The full-length coding sequence of BnCesA2 gene is 3240 bp, and encodes a putative 1079 amino acids. The coding se-
quence of BnCesA3 gene is 3120 bp, and could be translated into a 1039 amino acids protein. We designed the specific primers
based on cDNA sequences of the two genes and their expression levels were tested by quantitative real-time PCR (qRT-PCR),
indicating that BnCesA2 and BnCesA3 were both actively expressed in phloem and xylem in the four different cultivars of ramie.
But the level of expression showed significant difference that the BnCesA2 expression was 2 to 5 multiples higher than
BnCesA3 in both phloem and xylem. It is speculated that both the BnCesA2 and BnCesA3 participate the primary and secondary
cell wall biosynthesis.
Keywords: Ramie (Boehmeria nivea L.); Cellulose synthase genes; cDNA cloning; Expression analysis
苎麻为荨麻科苎麻属多年生宿根性草本植物 , 是重要的韧皮纤维作物 [1], 同时还具有较强的水土
1926 作 物 学 报 第 40卷
保持能力。苎麻韧皮纤维单纤维长度一般在 27~
268 mm 之间[2], 是植物界最长的优质纤维之一, 也
是重要的纺织工业原料, 具有较高的经济价值。近
年来, 苎麻被作为新型植物能源原料,木质纤维发酵
生产乙醇。以传统的育种方法改良苎麻品种已表现
出明显的局限性。苎麻的韧皮纤维区别于棉花种子
纤维和树木的木质纤维, 从分子水平探明其特殊发
育、调控过程与成分积累机理, 具有深远的理论意
义和实际应用价值。
纤维素是由多个葡萄糖分子以 β-1,4糖苷键连接
构成的不分支多糖, 是自然界中含量最高的生物大
分子 [3], 也是植物细胞壁微纤丝的主要成分 , 赋予
植物机械强度和弹性, 决定植物细胞的生长方向及
大小。纤维素合酶在植物纤维素合成过程中起关键
作用, 其催化亚基(CesA)是植物细胞壁中纤维合成
的核心催化剂[4]。第1个植物纤维素合酶催化亚基于
1996年从棉花中被鉴定出来[4-5], 随后全基因组测序
显示出拟南芥纤维素合酶家族至少由10个 CesA 基
因构成[6], 进一步的研究则表明不同 CesA 基因在植
物体内表达模式有明显差异[7]。
随着高通量测序技术的发展, 对不同发育时期
的苎麻韧皮部转录组的测序已有报道, 并将关注的
热点集中在 CesA基因家族的表达状况[8]。然而高通
量测序的数据分析获得的 CesA 家族成员过于庞大,
不排除有同一基因 cDNA 的重复分析。这是由于在
GenBank 中确定获得的苎麻纤维素合酶基因 cDNA
全长序列仍仅有 BnCesA1的序列[9-10]。本研究在苎麻
转录组数据的基础上 , 克隆获得了2个新的苎麻纤
维素合酶基因家族新成员, 并通过荧光定量RT-PCR
技术探索其在苎麻木质部及韧皮部的表达情况, 丰
富了苎麻 CesA家族的研究内容。
1 材料与方法
1.1 试验材料
苎麻[Boehmeria nivea (Linn.) Gaud.]栽培种湘
苎 1 号、湘苎 3 号、湘潭大叶白和城步青麻均采自
湖南农业大学资源苗圃, 由湖南农业大学苎麻研究
所提供。大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α菌株, 由
湖南农业大学细胞生物学实验室保存。
1.2 苎麻 RNA提取
选取实验室栽培生长旺盛的湘苎 3 号品种苎麻
的茎秆上部组织约 100 mg, 使用 Promega 公司 SV
Total RNA Isolation System试剂盒提取苎麻总 RNA。
通过 TaKaRa公司 Primescript 1st Strand cDNA Syn-
thesis试剂盒合成 cDNA第 1链。
1.3 苎麻纤维素合酶基因核心序列克隆
从 GenBank 网站下载拟南芥, 毛白杨, 大豆等
多种植物的纤维素合酶基因序列, 构建本地 Blast数
据库, 利用本地 Blast 工具与苎麻转录组数据库比
对。苎麻转录组数据库中序列 CL789 和 Unigene
20360 与多种植物纤维素合酶基因有较高相似度。
根据CL789及Unigene 20360序列信息, 针对CL789
和 Unigene 20360 序列设计上下游引物, CL789-F:
5-AAGACCACGGATGGCGAACCTT-3, CL789-R:
5-CTTCTCACGAGAAACATACACC-3, Unigene 20360-
F: 5-ATGGAAGCTAGTGCCGGACTTG-3, Unigene 20360-
R: 5-CCACGGTGTTCCATCTTGCAT-3。
以 1 μL cDNA 为模板扩增 CL789 和 Unigene
20360序列, 参照 TransGen公司 Trans Start Fast Pfu
DNA聚合酶说明设置 25 μL反应体系。反应程序为
预变性 95 1 min℃ ; 变性 95 30 s, ℃ 退火 57 30 s, ℃
延伸 72 1 min, ℃ 共 30循环; 终末延伸 72 5 min℃ 。
PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳分析, 回收预期大小的
目的条带, 经 Taq 酶加 A 尾后连入 pMD18-T 载体
(TaKaRa), 重组载体转化大肠杆菌 DH5α 菌株感受
态细胞, Amp 抗性筛选, 菌落 PCR 及酶切检测所得
阳性克隆送铂尚生物技术公司测序。
1.4 5末端及 3末端 RACE扩增
使用 3-Full RACE Core Set with PrimeScript
RTase (TaKaRa)及 5-Full RACE Kit with TAP (Ta-
KaRa) 2种试剂盒对序列 5及 3端进行延伸。以测序
所得核心序列为基础, 在核心序列靠近 3末端位置
分别设计 3RACE基因特异引物, CL789 3RACE引
物 RA7: 5-GGTCTCTGGTGTTATTTCCAGG-3; Uni-
gene 20360 3RACE引物 RA2: 5-ATTCAAGGTGAG
GATAAATGCC-3。在核心序列靠近 5端分别设计 2
组 5RACE巢式 PCR引物, CL789 GSP1: 5-TTGTC
ACCAAGAATAGCAGGG-3, CL789 GSP2: 5-CTGA
TTCCCATCTTTCCTCTCG-3, Unigene 20360 GSP1:
5-GGCATCAACAATATGCTCTTGCTTC-3, Unigene
20360 GSP2: 5-CACATCTTCCTCATCATCATCTCC
-3。参照 2 种试剂盒说明处理苎麻总 RNA, 并反转
录获得 5及 3RACE适用的第 1链 cDNA, 分别完成
3和 5端序列的 RACE 扩增。将 PCR 产物连入
pMD18-T载体, 以 PCR及酶解结合筛选出阳性转化
质粒后送交铂尚生物测序。
1.5 片段拼接与生物信息学分析
利用 DNAMAN 软件对序列进行拼接, 查找开
第 11期 刘昱翔等: 两种苎麻纤维素合酶基因 cDNA序列的克隆及表达 1927
放阅读框。将完整 cDNA序列与 GenBank核酸数据
库联机比对, 分析克隆序列与已公布的纤维素合酶
基因的同源关系。将核苷酸序列翻译成蛋白质, 通
过(http://web.expasy.org/protparam/)网站预测蛋白质
的分子量, 等电点等基本理化性质。利用 BlastP 与
GenBank 蛋白数据库比对 , 并使用 NCBI 提供的
Conserved Domain Search Service 在线工具和
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/)网站对保守
结构进行分析 , 并预测其功能。因为纤维素合酶
是一类跨膜蛋白 , 在网站 (http://www.cbs.dtu.dk/
services/TMHMM/)上 , 预测这 2 种蛋白的跨膜结
构域。
1.6 实时荧光定量 PCR分析
选取原麻产量和纤维支数上存在差异的 4 个苎
麻品种, 湘苎 1号(高产中支)、湘苎 3号(高产高支)、
湘潭大叶白(中产低支)及城步青麻(低产高支)[11], 研
究 BnCesA2和 BnCesA3在茎秆韧皮部及木质部中的
表达情况。
提取4个品种苎麻茎秆韧皮部和木质部总RNA。
以检测仪测定 RNA 浓度, 并将各样品 RNA 浓度调
整至100 μg mL–1, 采用 Primescript 1st Strand cDNA
Synthesis Kit反转录合成 cDNA。依据荧光定量引物
设计原则, 为避免高相似度的苎麻其他纤维素合酶
引起非特异性扩增, 选择在苎麻纤维素合酶基因高
可变区内设计荧光定量引物 , BnCesA2基因引物
RT-F: 5-GATGTGCTTGTGGACGACTCTC-3; RT-R:
5-TTGGGAACAGGGTTTGTGATTC-3, 扩增长度
167 bp。BnCesA3基因引物 RT-F: 5-CCTGACCCTG
ATGACTCTAACG-3, RT-R: 5-GACAAACAGACG
AGCGATGATC-3, 扩增长度135 bp。以肌动蛋白
Actin1基因作为内照[12], Actin1扩增用引物 Actin-F:
5-GCTCCGTTGAACCCTAAG-3; Actin-R: 5-CGAT
TGTGATGATTT-3。使用 SYBR Premix ExTaq (Ta-
KaRa)荧光定量试剂盒, 参照说明设置20 μL反应体
系, 通过 LightCycler 480 System荧光定量 PCR仪完
成苎麻纤维素合酶基因表达量分析。
2 结果与分析
2.1 苎麻 RNA提取
RNA 琼脂糖凝胶电泳结果如图 1 所示 , 28S
rRNA及 18S rRNA条带清晰, 且 28S条带亮度约为
18S条带的 2倍, 紫外检测 RNA浓度为 248 μg mL–1,
OD260/OD280=1.93, RNA提取质量满足完成分子克隆
实验需要。
图 1 苎麻木质部和韧皮部总 RNA凝胶电泳图
Fig. 1 Band pattern of agarose gel electrophoresis of total
RNA extracted from ramie xylem and phloem tissues
1: 苎麻韧皮部总 RNA; 2: 苎麻木质部总 RNA。
1: RNA from the ramie phloem; 2: RNA from the ramiexylem.
2.2 苎麻纤维素合酶核心序列的获得
转录组数据库中 CL789与Unigene 20360两条序
列与多种植物的纤维素合酶有较高相似度 , CL789
序列全长 1463 bp, PCR扩增产物凝胶电泳检测结果
如图 2所示。Unigene 20360序列长 1419 bp, PCR扩
增产物凝胶电泳检测结果如图 3 所示。电泳结果显
示 CL789及 Unigene 20360扩增条带约为 1500 bp。
测序得到长度为 1463 bp和 1419 bp, 与预期的片段
大小相符。测序结果与转录组数据比对, 序列一致。
图 2 CL789片段 PCR扩增产物凝胶电泳图
Fig. 2 Agarose gel electrophoresis pattern of PCR products of
fragment CL789
M: 1 kb DNA 分子量标准; 1: 片段 CL789扩增产物。
M: 1 kb DNA marker; 1: PCR product of fragment CL789.
图 3 Unigene20360片段 PCR扩增凝胶电泳图
Fig. 3 Agarose gel electrophoresis pattern of PCR products of
fragment Unigene 20360
M: 1 kb DNA 分子量标准; 1: 片段 Unigene 20360扩增产物。
M: 1 kb DNA marker; 1: PCR product of fragment Unigene 20360.
2.3 苎麻纤维素合酶基因 5端及 3端RACE扩增
CL789及 Unigene 20360的 3RACE产物大小均
约为 2000 bp。测序显示, CL789序列 3RACE产物
1928 作 物 学 报 第 40卷
长度 2012 bp, 凝胶电泳检测结果如图 4 所示; Uni-
gene 20360序列 3RACE产物长度 2074 bp, 凝胶电
泳检测结果如图 5所示。
图 4 CL789片段 3RACE扩增结果凝胶电泳图
Fig. 4 Electrophoresis of PCR products of CL789 3RACE
amplification
M: 1 kb DNA 分子量标准; 1: CL789片段 3RACE扩增产物。
M: 1 kb DNA marker; 1: products of CL789 3RACE
amplification.
图 5 Unigene 20360片段扩 3RACE扩增凝胶电泳图
Fig. 5 Electrophoresis of PCR products of Unigene 20360
3RACE amplification
M: 1 kb DNA 分子量标准; 1: Unigene 20360 片段 3RACE 扩增
产物。
M: 1 kb DNA marker; 1: product of Unigene 20360 3RACE
amplification.
5RACE 产物琼脂糖凝胶电泳检测结果, CL789
序列 5RACE产物长度约 500 bp如图 6所示, Unigene
20306 5RACE扩增产物约 400 bp如图 7所示, 测序
显示, 实际产物大小分别为 515 bp和 368 bp。
图 6 CL789片段扩 5RACE扩增结果凝胶电泳图
Fig. 6 Electrophoresis of PCR products of CL789 5RACE
amplification
M: 1 kb DNA 分子量标准; 1: CL789片段 5RACE扩增产物。
M: 1 kb DNA marker; 1: product of CL789 5RACE
amplification.
图 7 Unigene20360片段扩 5RACE扩增结果凝胶电泳图
Fig. 7 Electrophoresis of PCR products of Unigene 20360
5RACE amplification
M: 1 kb DNA 分子量标准; 1: Unigene 20360 片段 5RACE 扩增
产物。
M: 1 kb DNA marker; 1: product of Unigene 20360 5RACE
amplification.
2.4 苎麻纤维素合酶基因的生物信息学分析
利用 DNAMAN 软件拼接获得长度为 3876 bp
和 3455 bp 的 2 条核酸序列。分别命名为 BnCesA2
和 BnCesA3基因。
BnCesA2 基因编码区长度 3240 bp, 5端非翻译
区 403 bp, 3端非翻译区 233 bp, 推测其编码一个
1079 氨基酸多肽, 核酸及对应氨基酸序列如图 8 所
示。将 BnCesA2与 GenBank联机比对, 该基因核酸
序列与白桦(Betula platyphylla CesA2 EU591530)、亮
叶桦(Betula luminifera CesA2 KC204969)、毛果杨
(Populu strichocarpa XM_006369563)、蓖麻(Ricinus
communis XM_002532120)、巨桉(Eucalyptus grandis
CesA1 EU165708)等植物的 CesA基因相似度在 80%
以上。氨基酸水平与光皮桦(Betula luminifera CesA2
AGV22107)、蓖麻(Ricinus communis CesA6 XP_0025
32166)、银合欢(Leucaena leucocephala ACU87559)、
陆地棉(Gossypium hirsutum CesA3 ADZ16123)、芍药
(Paeonia lactiflora CesA3 AFI71894)等植物纤维素合
酶有 90%以上相似度。推测该蛋白质理论分子量
120.8 kD, 理论等电点 6.63。
BnCesA3 基因编码区全长 3120 bp, 5端非翻译
区 56 bp, 3端非翻译区 279 bp, 推测编码 1039个氨
基酸, 核酸及对应氨基酸序列如图 8所示。GenBank
进行 Blast 分析 , 结果显示其核酸序列与亮叶桦
(Betula luminifera CesA3 FJ410445)、毛白杨(Populus
tomentosa CesA7 HQ585870)、蒺藜状苜蓿(Medicago
truncatula XM_003610234) 、 陆 地 棉 (Gossypium
hirsutum CesA8 JQ345696)、蓖麻(Ricinus communis
CesA3 XM_002533182)等序列同源均达到 80%以上。
其氨基酸序列与桉树 (Eucalyptus urophylla CesA3
AGJ71354)、亮叶桦(Betula luminifera ACJ38665)、
团花(Neolamarckia cadamba CesA1 AFP93559)、毛白
第 11期 刘昱翔等: 两种苎麻纤维素合酶基因 cDNA序列的克隆及表达 1929
杨(Populus tomentosa AFZ78559)均超过 87%。推测
该蛋白质理论分子量 117.6 kD, 理论等电点 6.25。
预测显示 2种蛋白均含有 8个跨膜结构域 ,
BnCesA2中分别位于 N 端275~292、299~318、855~
877、889~911、926~948、974~996、1006~1028、1041~
1060; BnCesA3中分别位于258~275、282~303、816~
图 8 BnCesA2基因 cDNA序列及推测的蛋白质序列
Fig. 8 cDNA sequence and its putative coding protein sequences of BnCesA2 gene
1930 作 物 学 报 第 40卷
图 9 BnCesA3基因 cDNA序列及推测的蛋白质序列
Fig. 9 cDNA sequence and its putative coding protein sequence of BnCesA3 gene
838、850~872、887~909、934~956、966~988、1001~
1020, 即2个跨膜区位于N-末端, 6个位于C端。N端和
C端跨膜结构域之间区域在细胞内形成环状结构 ,
-1,4-葡萄糖苷链穿过跨膜区进入细胞壁[13]。2种纤维
素合酶基因在 N端 20~80氨基酸处均具有序列
Cx2Cx12FxACx2Cx2PxCx2Cx4Ex5CxCx2C (x任意氨
基酸, C半胱氨酸、F苯丙氨酸、P脯氨酸氨酸、A丙氨
酸、E谷氨酸)类锌指或LIM转录因子的保守结构域,
该结构可以与锌原子结合, 与纤维素合酶复合体各
亚基间的相互作用有关[14-15]。其后100~240位的氨基
酸之间呈现出高度可变的特点, 荧光定量PCR引物针
对这一区域进行设计。BnCesA2和BnCesA3分别在蛋
白序列817~822及777~782具有与糖苷转移酶催化相
关的特异QVLRW结构域[16], 如图10方框所示。
第 11期 刘昱翔等: 两种苎麻纤维素合酶基因 cDNA序列的克隆及表达 1931
图 10 BnCesA1、BnCesA2与 BnCesA3蛋白质序列比对结果
Fig. 10 Multiple alignment of BnCesA1, BnCesA2, and BnCesA3 protein sequence
方框内表示 CesA基因共有保守结构域。
The conserved domain of CesA genes are indicated in boxes.
1932 作 物 学 报 第 40卷
2.5 BnCesA2 和 BnCesA3 基因表达的荧光定量
RT-PCR分析
2个纤维素合酶基因荧光定量引物均设计在位
于苎麻纤维素合酶特有的高可变区, 避免具有较高
相似度的其他纤维素合酶影响 , 而且使用SYBR-
Green荧光定量反应体系, 可以检测到表达量极少的
基因, 以获得比半定量试验更精确的表达量结果[17]。
荧光定量试验报告显示, 扩增曲线趋势正常, 基线
平整, 溶解曲线峰值单一(图11), 引物特异性较好,
未产生非特异性扩增。
图 11 两种基因表达定量 RT-PCR溶解曲线图(Actin为内标分子)
Fig. 11 Melting curve in quantitative RT-PCR of BnCesA2 and BnCesA3 (Actin as internal reference)
选择BnCesA3基因在湘苎3号木质部中的表达量
为参照 , 其他各基因相对于参照基因的表达水平 ,
通过双ΔCt法计算获得(图10)。荧光定量的结果显示
BnCesA2和BnCesA3基因在4个品种苎麻的木质部和
韧皮部中均有表达 , 并且BnCesA2基因表达量均高
于BnCesA3基因, BnCesA2基因在湘苎1号韧皮部中
的表达量最高, 是BnCesA3基因表达量的5.4倍。相
对于其他品种 , 湘潭大叶白木质部及韧皮部中2个
基因的表达量都最低。由于2个基因在不同品种间的
表达差异明显, 暗示在不同品种苎麻的相同组织内
纤维素合酶复合体的构成组分不尽相同。BnCesA3
基因除在湘潭大叶白中木质部与韧皮部表达量基本
相同外, 在其他品种中都呈现出木质部表达量略高
于韧皮部表达量的趋势 , 其中湘苎3号木质部表达
量达到韧皮部表达量的2倍, 而BnCesA2基因在湘苎
3号中也表现出这样的趋势。
暂时还未发现2个纤维素合酶基因的表达水平
与4种苎麻的原麻产量与纤维支数之间有直接的联
系, 这可能由于纤维素的生物合成过程需要多种酶
的共同参与, 而苎麻原麻产量与纤维支数取决于更
为复杂的因素, 如苎麻纤维分子结晶度、取向以及
胶质的含量等[11], 是多基因共同作用的结果。
图 12 不同品种间木质部与韧皮部 BnCesA2与 BnCesA3基因
表达差异
Fig. 12 Differential expression of BnCesA2 and BnCesA3 in
phloem and xylem in different ramie varieties
1: 湘苎 3号木质部; 2: 湘苎 3号韧皮部; 3: 湘潭大叶白木质部;
4: 湘潭大叶白韧皮部; 5: 城步青麻木质部; 6: 城步青麻韧皮部;
7: 湘苎 1号木质部; 8: 湘苎 1号韧皮部。
1: xylem from Xiangzhu 3; 2: phloem from Xiangzhu 3; 3: xylem
from Xiangtandayebai; 4: phloem from from Xiangtandayebai;
5: xylem from Chengbuqingma; 6: phloem from Chengbuqingma;
7: xylem from Xiangzhu 1; 8: phloem from Xiangzhu 1.
3 讨论
在对苎麻被克隆的纤维素合酶BnCesA1的研究
中, 田志坚等[9]和蒋杰等[10]分别用半定量RT-PCR分
析 BnCesA1基因在根、茎(茎皮)、叶、和芽中的表
达量显示, BnCesA1在各组织中都有表达, 茎部的表
第 11期 刘昱翔等: 两种苎麻纤维素合酶基因 cDNA序列的克隆及表达 1933
达量明显高于其他组织 , 说明BnCesA1不具有组织
特异性, 但在不同组织表达量具有一定差异。本试
验在此基础上利用更为精确的荧光定量PCR技术分
析新克隆的2种纤维素合酶在韧皮部及木质部中的
表达状况。苎麻有发达的韧皮部纤维, 韧皮纤维是
重要的纺织工业原料, 然而关于纤维素合酶在苎麻
韧皮纤维中表达规律的研究还相对较少, 探索苎麻
纤维素合酶在韧皮部表达规律, 鉴定出韧皮部特异
性表达或高表达的纤维素合酶, 将为苎麻韧皮纤维
的定向改良提供条件, 具有一定的实际意义。本实
验克隆的2种纤维素合酶的表达虽不具有韧皮部特
异性, 但都参与了韧皮纤维的合成过程。要进一步
阐明2个基因的表达规律 , 需要在更多不同组织及
不同类型的细胞进行中进行定位和定量的研究。
纤维素的生物合成过程需要多个纤维素合酶共
同构成定位于细胞膜上的纤维素合酶复合体参与[18],
该复合体由6个亚基组成 , 呈现出六边玫瑰花型结
构, 每个亚基由6个CesA基因编码的小亚基构成[19],
因此在相同细胞的同一发育时期, 都会有多个纤维
素合酶的表达。纤维素合酶复合体的构成被认为不
是唯一的[20], 不同组织与发育期时期的细胞中参与
构成复合体的纤维素合酶基因的数量、种类及比例
都不相同。所以不能简单地将纤维素合成的量与某
种纤维素合酶的表达水平进行关联。本研究中, 苎
麻纤维聚集生长于苎麻韧皮部 , 但实验结果显示2
种纤维素合酶在韧皮部中表达水平与木质部中相比
并不存在明显的高低关系。
植物纤维素合酶表达规律的差异首先表现在表
达部位与表达量的关系上, 不同CesA基因在同一组
织中的表达水平不一样, 相同CesA基因在不同组织
中的表达量也有差别, 甚至一些CesA基因仅在某一
特定组织中表达, 例如AtCesA基因在拟南芥各部位中
都有表达, 而AtCesA7基因则具有木质部特异性[21-22]。
第二, 同一组织中有多个CesA基因表达, 如木质部
导管的伸长必须有AtCesA4、AtCesA7、AtCesA8三种
纤维素合酶共同参与[23-25]。第三, CesA基因在初生和
次生细胞壁相关性上有差异 , 拟南芥纤维素合酶
AtCesA1、AtCesA3、AtCesA6是初生细胞壁合成所
必需[26-28] , 而AtCesA4、AtCesA7、AtCesA8则参与
次生细胞壁合成 [29]。从本试验来看 , BnCesA2和
BnCesA3基因在韧皮部与木质部均表达 , 提示
BnCesA2和BnCesA3可能共同参与构成同一纤维为
素合成酶复合体, 而木质部与韧皮部基因表达水平
的差异也说明, 参与木质部与韧皮部纤维合成的纤
维素合酶复合体的组成并不相同。在与拟南芥纤维
素合酶进行同源比对后发现, BnCesA2基因与拟南芥
AtCesA3基因相似度最高, BnCesA3基因与AtCesA7基
因相似度最高。AtCesA3基因突变影响到植物初生细
胞壁合成 , 而从BnCesA2基因在韧皮部与木质部中
高表达量推测, 该基因应该参与了次生细胞壁的合
成, 并不具有初生细胞壁合成特异性。AtCesA7基因
在拟南芥木质部中特异性表达, 是拟南芥木质部导
管合成所必需的纤维素合酶 , 而BnCesA3基因则在
韧皮部与木质部中均有表达, 虽表现出木质部略高
于韧皮部的趋势, 但表达量差异不大。这与李益等[30]
提出的纤维素合酶功能的特异性与该蛋白的一级结
构没有直接规律性关联的结论一致。在对CesA基因
结构的研究中, 研究者通过交换AtCesA1与AtCesA3
2个基因的N-端, C-端, 以及催化结构域, 提出C-端
结构域与催化结构可能决定了纤维素合酶功能上的
特异性 [31]。与陆地棉(Gossypium hirsutum)相比较 ,
其相似度较与拟南芥相比的相似度更高, 并且C-端
序列更为接近, 推测苎麻纤维素合酶在功能上的特
异性可能更接近陆地棉。 BnCesA2基因与棉花
GhCesA3基因相似度达到91%, GhCesA3基因在棉花
纤维合成初始, 初生细胞壁向次生细胞壁过度及次
生细胞壁合成各个阶段都有稳定且较高的表达[32]。
4 结论
克隆获得了 2 个苎麻纤维素合酶基因 BnCesA2
和 BnCesA3的 cDNA序列。BnCesA2基因编码区全
长度 3240 bp, 编码 1079氨基酸的多肽; BnCesA3基
因编码区全长 3120 bp, 编码蛋白为 1039 氨基酸的
多肽, 两者都具有典型的植物纤维素合酶特征结构
域。BnCesA2和 BnCesA3在湘苎 1号、湘苎 3号、
湘潭大叶白和城步青麻 4 个苎麻品种的木质部和韧
皮部中均有表达, 表达量存在着一定差异。2种纤维
素合酶都参与了苎麻韧皮纤维的合成过程, 但还不
能将两者的表达水平与 4 种苎麻的原麻产量及纤维
支数直接联系。
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