全 文 ：书甘露醇及犃犵犖犗３对根癌农杆菌介导的
多年生黑麦草遗传转化的影响
乔定君１，２，毛萍１，２，马欣荣１，杨宏１
（１．中国科学院成都生物研究所生态恢复重点实验室，四川 成都６１００４１；２．中国科学院研究生院，北京１０００４９）
摘要：多年生黑麦草是优良的牧草和草坪草。农杆菌介导多年生黑麦草遗传转化非常困难。为了建立稳定的多年
生黑麦草遗传转化体系，本研究以品种“多福”种子成熟胚为外植体诱导愈伤组织，携质粒ｐＣＡＭＢＩＡ２３０１的根癌
农杆菌ＥＨＡ１０５介导，进行遗传转化。在预培养及共培养基中添加０．１ｍｏｌ／Ｌ甘露醇或５ｍｇ／Ｌ硝酸银，并分析了
二者对转化的影响。经巴龙霉素筛选、ＰＣＲ及 ＧＵＳ组织染色检测表明，共获得了转基因植株３８株。添加０．１
ｍｏｌ／Ｌ甘露醇或５ｍｇ／ＬＡｇＮＯ３ 或０．１ｍｏｌ／Ｌ甘露醇＋５ｍｇ／ＬＡｇＮＯ３，转化效率分别为对照的１．９６，１．５９和２．９５
倍。结果表明，在根癌农杆菌介导的多年生黑麦草愈伤组织遗传转化中，在预培养和共培养基中添加甘露醇或
ＡｇＮＯ３ 能提高转化率，且当二者共同添加时可显著提高。
关键词：多年生黑麦草；根癌农杆菌；遗传转化；愈伤组织；硝酸银；甘露醇
中图分类号：Ｓ５４３＋．６０３；Ｑ９４３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１１）０１０１０２０９
我国草地草场沙漠化程度日益严重，伴随着草地退化，草种急剧退化，植被组成发生变化，可食牧草比重下
降，劣质、低质杂草及毒草大量滋生，致使牧草资源日渐短缺。同时，水资源短缺以及土地的干旱、盐渍化限制园
林绿化中草坪的建植［１］。因此，开展优良牧草和草坪草的培育具有重要意义。多年生黑麦草（犔狅犾犻狌犿狆犲狉犲狀狀犲）
根系发达、适应性强、耐践踏、有一定的抗寒能力，是优良的牧草和草坪草。因其建植速度快，分蘖能力强，在防风
固沙、保持水土、城市绿化和运动场建设中具有重要作用。目前，在我国南方各省、自治区均有种植，长江流域以
南的中南山地区及云贵高原等地有大面积栽培［２］。但是多年生黑麦草对干旱和高温的耐受力较弱。由于自交不
亲和，传统育种困难而复杂。为获得优良农艺性状的黑麦草品种，应用现代生物技术，尤其是转基因技术对其进
行遗传改良迫在眉睫。
近十几年来，国内外对多种禾本科单子叶植物的遗传转化进行了大量的研究，迄今主要有原生质体转化法、
农杆菌介导转化法、基因枪法、硅碳纤维介导法。相较于其他转基因方法，农杆菌介导法具有操作简单、成本低、
重复性好、转化率高、拷贝数低、基因沉默现象少、转育周期短、可插入大片段ＤＮＡ和无需经原生质体再生等诸
多优点［３８］。自１９９８年Ｐｏｓｓｅｌｔ等［９］将ＲｇＭＶ（ｒｙｅｇｒａｓｓｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ）外壳蛋白基因对３个黑麦草品种进行农杆
菌介导的遗传转化获得第１株转基因黑麦草以来，通过农杆菌介导法已经获得多个黑麦草转基因株系。如
Ｄｅｖｅｒｅａｕｘ［１０］将烟草（犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪犮狌犿）的犕狀犛犗犇 基因导入多年生黑麦草，获得的转基因植株明显提高了越
冬和复苏能力。Ｂｅｔｔａｎｙ等［１１］获得６个转基因一年生黑麦草（犔．犿狌犾狋犻犳犾狅狉狌犿）株系和２个转基因高羊茅（犉犲狊狋狌
犮犪犪狉狌狀犱犻狀犪犮犲犪）株系。Ｗｕ等［１２］通过根癌农杆菌介导法获得的转入水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）液泡膜Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转
运蛋白犗狊犖犎犡１基因的多年生黑麦草转基因植株，具有良好的抗旱、耐盐能力。刘萍等［１３］将克隆自辽宁碱蓬
（犛狌犪犲犱犪）的甜菜碱醛脱氢酶基因（犅犃犇犎）转入多年生黑麦草，获得了具有耐盐能力的转基因矮化株系 Ｇｓｃ
ＬＰ５。Ａｌｔｐｅｔｅｒ［１４］建立了以绿色荧光蛋白基因（狊犵犳狆犛６５犜）为报告基因的黑麦草愈伤组织转化体系，并获得了转
基因植株。Ｂａｊａｊ等［１５］通过转化二次诱导的多年生黑麦草愈伤组织，将拟南芥犎２犃１、犞犘１等多个基因分别导入
１０２－１１０
２０１１年２月
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
第２０卷 第１期
Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１
收稿日期：２０１００５１１；改回日期：２０１００６０２
基金项目：国家８６３计划项目（２００８ＡＡ１０Ｚ４０９，２００９ＡＡ１０Ｚ１０８）和中国科学院知识创新工程重要方向项目（ＫＳＣＸ２ＹＷＮ０４６）资助。
作者简介：乔定君（１９８５），男，四川泸州人，在读硕士。
毛萍（１９８６），女，四川乐山人，在读硕士。
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｍａｘｒ＠ｃｉｂ．ａｃ．ｃｎ
黑麦草，获得较高的遗传转化效率。王奇丽等［１６］将抗除草剂基因犫犪狉成功转入多年生黑麦草，获得抗除草剂
Ｂａｓｔａ的转基因植株。此外，马欣荣等［１７１９］将来自拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）的转录因子ＤＲＥＢ导入多年生
黑麦草中，获得抗逆转基因植株。这些研究促进了黑麦草的遗传改良研究。然而，在农杆菌介导的黑麦草转化
中，转化方法的稳定性及可重复性，预培养及共培养条件，都是影响转化的重要因素。因此转化方法的探索及优
化仍然是研究热点。
研究表明，多种因素影响农杆菌介导单子叶植物遗传转化，如外植体的选择，愈伤组织的胚性，农杆菌感染浓
度与共培养时间，菌株，启动子与载体，信号分子与 Ｖｉｒ基因的诱导，抗生素浓度的选择和压力，光照时间
等［７，２０２３］。为了更好地优化和建立高效的农杆菌介导的黑麦草转化体系，国内外诸多研究均对上述条件进行优
化。在外植体的选择、启动子与载体、信号分子诱导方面均达到统一认可。通常来源于单子叶植物的启动子如
Ａｃｔ１，Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ和Ｅｍｕ启动子［２０，２４，２５］在单子叶植物中的表达效率高于来自于双子叶植物的启动子。使用乙酰
丁香酮等外源小分子酚类化学物质可以促使农杆菌犞犻狉基因活化表达［２６］。但在预培养及共培养条件等方面却
存在差异。
在农杆菌介导的单子叶植物转化中，共培养后愈伤组织的褐化坏死、分化率较低等问题，是获得转基因植株
的瓶颈。本研究前期观察表明，在黑麦草愈伤组织培养及其分化中，硝酸银可以减少愈伤组织的褐化及促进其分
化。在相关的基因枪转化方法中，一定浓度的甘露醇培养基预处理外植体，能获得较高的转化效率［２７，２８］。
目前，有关硝酸银及甘露醇对遗传转化的影响，已有一些报道。在大豆（犌犾狔犮犻狀犲犿犪狓）［２９，３０］、油菜（犅狉犪狊狊犻犮犪
狀犪狆狌狊）［３１］、水稻［３２］、甘蓝（犅狉犪狊狊犻犮犪狅犾犲狉犪犮犲犪ｖａｒ．犮犪狆犻狋犪狋犪）［３３］等植物的遗传转化研究中，添加硝酸银可以促进转
化。２～８ｍｇ／Ｌ硝酸银能有效提高水稻转化效率［３２］，５ｍｇ／Ｌ硝酸银对离体培养烟草叶片的愈伤组织芽分化具
有最佳促进作用［３４］。甘露醇是一种单糖，中性糖。糖类物质中的中性糖对 Ｖｉｒ区基因具有诱导和致病毒力作
用，而酸性糖对农杆菌浸染有调控作用［３５］。此外，甘露醇能有效提高犌犝犛基因的表达［３６］。陈志俊和刘荣维［３７］
分别采用０．１，０．３和０．４ｍｏｌ／Ｌ的甘露醇预处理的兰花（犃狉犪狀犱犪）圆球茎，在基因枪转化后０．１ｍｏｌ／Ｌ甘露醇处
理犌犝犛基因表达效率最高。迄今，在农杆菌介导的黑麦草遗传转化研究中，尚未见硝酸银和甘露醇影响的报道。
因此，在前人及已有的研究基础上，本研究设置一定条件，在预培养和共培养中添加５ｍｇ／Ｌ硝酸银和０．１
ｍｏｌ／Ｌ甘露醇，通过根癌农杆菌介导，获得转基因多年生黑麦草。本研究探讨了在预培养和共培养中添加硝酸银
和甘露醇对黑麦草遗传转化的影响，并试图建立一种稳定的农杆菌介导的黑麦草遗传转化方法。
１ 材料与方法
１．１ 菌株和载体
大肠杆菌（犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻）菌株ＪＭ１０９，根癌农杆菌（犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊）菌株ＥＨＡ１０５，由中国科
学院成都生物研究所保存。质粒ｐＣＡＭＢＩＡ２３０１由海南热带植物研究所蒋昌顺教授惠赠，并获澳大利亚国际农
业分子生物学应用中心（ＣＡＭＢＩＡ）使用许可。该质粒携选择基因新霉素磷酸转移酶基因（ｎｅｏｍｙｃｉｎｐｈｏｓｐｈｏ
ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，狀狆狋Ⅱ）和报告基因β葡萄糖苷酸酶基因（βｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ，犵狌狊）。启动子均为花椰菜花叶病毒（犆犪狌
犾犻犳犾狅狑犲狉犿狅狊犪犻犮ｖｉｒｕｓ）３５Ｓ启动子（ＣａＭＶ３５Ｓｐ）。其中的犵狌狊基因中含有过氧化氢酶内含子（ｃａｔａｌａｓｅｉｎｔｒｏｎ），
只能在其整合到真核生物细胞基因组中才能表达。图１为该载体ＴＤＮＡ表达盒示意图。
１．２ 植物材料
多年生黑麦草，品种 “多福”（Ｔｏｖｅ），牧草型，购自市场。
１．３ 培养基和培养条件
所用培养基及成分见表１。培养温度为２３～２７℃，诱导、继代均为暗培养，分化和生根为光照培养，光强为
３５００ｌｘ，光周期１６ｈ／ｄ。
１．４ 外植体培养及转化
选取外观均一、饱满的多福成熟种子，７０％乙醇处理１ｍｉｎ后，用含活性氯２％～４％次氯酸钠水溶液并加入
约５μＬＴｒｉｔｏｎ１００灭菌１０ｍｉｎ，无菌去离子水清洗５次，无菌条件下剥取黑麦草种子成熟胚接种到诱导培养基
上，诱导培养３周。之后继代培养，部分愈伤组织长出幼苗则切去幼苗后继代培养。
３０１第２０卷第１期 草业学报２０１１年
图１ 表达载体狆犆犃犕犅犐犃２３０１的犜犇犖犃区结构简图
犉犻犵．１ 犃狊犮犺犲犿犪狋犻犮犱犻犪犵狉犪犿狅犳狋犺犲犜犇犖犃狉犲犵犻狅狀狅犳狏犲犮狋狅狉狆犆犃犕犅犐犃２３０１
ＣａＭＶ３５Ｓｐ：花椰菜花叶病毒３５Ｓ启动子Ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ３５Ｓｐｒｏｍｏｔｏｒ；犵狌狊ｉｎｔｒｏｎ：含内含子的β葡萄糖苷酸酶基因，只能在真核细
胞中表达βｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅｇｅｎｅｉｎｃｌｕｄｉｎｇａｎｉｎｔｒｏｎ，ｏｎｌｙｃａｎｅｘｐｒｅｓｓｉｎｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｃｅｌ；狀狆狋Ⅱ：新霉素磷酸转移酶基因Ｎｅｏｍｙｃｉｎｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ
ｇｅｎｅ；ＮｏｓｐｏｌｙＡ，ＣａＭＶ３５ＳｐｏｌｙＡ：终止子 Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ；ＬＢ、ＲＢ：左、右边界Ｌｅｆｔａｎｄｒｉｇｈｔｂｏｒｄｅｒ
表１ 培养基组分
犜犪犫犾犲１ 犕犲犱犻犪犪狀犱犮狅犿狆狅狀犲狀狋狊
培养基 Ｍｅｄｉａ 成分Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ
ＬＢ １０ｇ／Ｌ胰蛋白胨＋５ｇ／Ｌ酵母提取物＋１０ｇ／Ｌ氯化钠，ｐＨ＝７．２
１０ｇ／ＬＴｒｙｔｐｏｎｅ＋５ｇ／ＬＹｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ＋１０ｇ／ＬＮａＣｌ，ｐＨ＝７．２
ＭＳ［３８］ ＭＳ＋３ｇ／Ｌ植物凝胶（或７ｇ／Ｌ琼脂粉）＋３０ｇ／Ｌ麦芽糖（或３０ｇ／Ｌ蔗糖），ｐＨ＝５．８
ＭＳ＋３ｇ／ＬＰｈｙｔａｇｅｌ（ｏｒ７ｇ／ＬＡｇａｒ）＋３０ｇ／ＬＭａｌｔｏｓｅ（ｏｒ３０ｇ／ＬＳｕｇａｒ），ｐＨ＝５．８
ＡＢ盐 ＡＢＳａｌｔｓ ２０ｇ／ＬＮＨ４Ｃｌ＋６ｇ／ＬＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ＋３ｇ／ＬＫＣｌ＋３ｇ／ＬＣａＣｌ２·Ｈ２Ｏ＋０．０９１ｇ／ＬＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ
ＡＢ培养基ＡＢｍｅｄｉｕｍ ＡＢ盐５ｍＬ＋０．５ｍｏｌ／Ｌ４吗啉乙磺酸缓冲液＋０．５ｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液＋１０ｇ／Ｌ葡萄糖＋２００μｍｏｌ／Ｌ乙酰丁香酮
ＡＢＳａｌｔｓ＋０．５ｍｏｌ／ＬＭＥＳｂｕｆｆｅｒ＋０．５ｍｏｌ／ＬＰｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｅｒ＋１０ｇ／ＬＧｌｕｃｏｓｅ＋２００μｍｏｌ／ＬＡｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ（ＡＳ）
愈伤组织诱导培养基（ＩＭ）
Ｃａｌｕｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍ
ＭＳ＋７ｍｇ／Ｌ２，４二氯苯氧乙酸＋３ｇ／Ｌ植物凝胶
ＭＳ＋７ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ＋３ｇ／ＬＰｈｙｔａｇｅｌ
愈伤组织继代培养基 （ＳＭ）
Ｃａｌｕｓｓｕｂｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍ
ＭＳ＋３ｍｇ／Ｌ２，４二氯苯氧乙酸＋３ｇ／Ｌ植物凝胶
ＭＳ＋３ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ＋３ｇ／ＬＰｈｙｔａｇｅｌ
预培养基 （ＰＭ）Ｃａｌｕｓｐｒｅ
ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍ
ＭＳ＋１０ｇ／Ｌ葡萄糖＋３ｍｇ／Ｌ２，４二氯苯氧乙酸＋２ｍｇ／Ｌ激动素＋４００μｍｏｌ／Ｌ乙酰丁香酮＋３ｇ／Ｌ植物凝胶
ＭＳ＋１０ｇ／ＬＧｌｕｃｏｓｅ＋３ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ＋２ｍｇ／ＬＫＴ＋４００μｍｏｌ／ＬＡＳ＋３ｇ／ＬＰｈｙｔａｇｅｌ
液体预培养基（ＬＰＭ）Ｃａｌｕｓ
ｌｉｑｕｉｄｐｒｅｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍ
ＭＳ＋３０ｇ／Ｌ麦芽糖＋１０ｇ／Ｌ葡萄糖＋３ｍｇ／Ｌ２，４二氯苯氧乙酸＋２ｍｇ／Ｌ激动素＋４００μｍｏｌ／Ｌ乙酰丁香酮
ＭＳ＋３０ｇ／ＬＭａｌｔｏｓｅ＋１０ｇ／ＬＧｌｕｃｏｓｅ＋３ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ＋２ｍｇ／ＬＫＴ＋４００μｍｏｌ／ＬＡＳ
共培 养 基 （ＣＭ）Ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ
ｍｅｄｉｕｍ
ＭＳ＋１０ｇ葡萄糖＋３ｍｇ／Ｌ２，４二氯苯氧乙酸＋２ｍｇ／Ｌ激动素＋４００μｍｏｌ／Ｌ乙酰丁香酮＋３ｇ／Ｌ植物凝胶
ＭＳ＋１０ｇＧｌｕｃｏｓｅ＋３ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ＋２ｍｇ／ＬＫＴ＋４００μｍｏｌ／ＬＡＳ＋３ｇ／ＬＰｈｙｔａｇｅｌ
除菌恢复培养基（ＲＣＭ）Ｒｅ
ｃｏｖｅｒｉｎｇｍｅｄｉｕｍ
ＭＳ＋１０ｇ／Ｌ葡萄糖＋３ｍｇ／Ｌ２，４二氯苯氧乙酸＋２ｍｇ／Ｌ激动素＋２００ｍｇ／Ｌ特美汀＋３ｇ／Ｌ植物凝胶
ＭＳ＋１０ｇ／ＬＧｌｕｃｏｓｅ＋３ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ＋２ｍｇ／ＬＫＴ＋２００ｍｇ／ＬＴｉｍｅｎｔｉｎ＋３ｇ／ＬＰｈｙｔａｇｅｌ
选择培养基（ＳＥＭ）Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ
ｍｅｄｉｕｍ
ＭＳ＋１０ｇ／Ｌ葡萄糖＋３ｍｇ／Ｌ２，４二氯苯氧乙酸＋２ｍｇ／Ｌ激动素＋２００ｍｇ／Ｌ特美汀＋巴龙霉素（１０ｍｇ／Ｌ；２５
ｍｇ／Ｌ；５０ｍｇ／Ｌ）＋７ｇ／Ｌ琼脂粉 ＭＳ＋１０ｇ／ＬＧｌｕｃｏｓｅ＋３ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ＋２ｍｇ／ＬＫＴ＋２００ｍｇ／ＬＴｉｍｅｎｔｉｎ＋
Ｐａｒｏｍｏｍｙｃｉｎ（１０ｍｇ／Ｌ；２５ｍｇ／Ｌ；５０ｍｇ／Ｌ）＋７ｇ／ＬＡｇａｒ
分化培养基（ＳＲＭ）Ｓｈｏｏｔｒｅ
ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍ
ＭＳ＋０．１ｍｇ／Ｌ２，４二氯苯氧乙酸＋０．５ｍｇ／Ｌ６苄氨基嘌呤＋２００ｍｇ／Ｌ特美汀＋７ｇ／Ｌ琼脂粉
ＭＳ＋０．１ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ＋０．５ｍｇ／Ｌ６ＢＡ＋２００ｍｇ／ＬＴｉｍｅｎｔｉｎ＋７ｇ／ＬＡｇａｒ
生根培养基（ＲＲＭ）Ｒｏｏｔｒｅ
ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍ
１／２ＭＳ＋０．０５ｍｇ／Ｌ萘乙酸＋２００ｍｇ／Ｌ特美汀＋３ｇ／Ｌ植物凝胶
１／２ＭＳ＋０．０５ｍｇ／ＬＮＡＡ＋２００ｍｇ／ＬＴｉｍｅｎｔｉｎ＋３ｇ／ＬＰｈｙｔａｇｅｌ
注：巴龙霉素、特美汀、乙酰丁香酮在培养基高压灭菌后冷至５０℃左右加入。
Ｎｏｔｅ：Ｐａｒｏｍｏｍｙｃｉｎ，ｔｉｍｅｎｔｉｎａｎｄＡＳｗｅｒｅａｄｄｅｄｗｈｅｎｍｅｄｉｕｍｃｏｏｌｅｄｔｏ５０℃．
继代培养２周后，进行转化。在预培养及共培养中，设置４个处理Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３和Ｔ４，不添加甘露醇及硝酸
银的处理为Ｔ１（作为对照组），添加０．１ｍｏｌ／Ｌ甘露醇的为Ｔ２，添加５ｍｇ／Ｌ硝酸银的为Ｔ３，同时添加０．１ｍｏｌ／Ｌ
４０１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１
甘露醇和５ｍｇ／Ｌ硝酸银的为Ｔ４。不同处理间，除
培养基不同，其他条件相同，见表２。愈伤组织固体
预培养基上培养１周后，分别转入相应液体预培养
基中，２５℃，８０ｒ／ｍｉｎ振荡暗培养２ｄ用于农杆菌共
培养。
取液氮保存的携表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ２３０１的
农杆菌ＥＨＡ１０５菌液接种到含利福平２０ｍｇ／Ｌ和
表２ 不同转化处理
犜犪犫犾犲２ 犇犻犳犳犲狉犲狀狋狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狋犻狅狀狋狉犲犪狋犿犲狀狋狊
处理Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ 项目Ｉｔｅｍ Ｔ１ Ｔ２ Ｔ３ Ｔ４
预培养及共培养
Ｐｒｅｃｕｌｔｕｒｅ＆
Ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ
甘露醇 Ｍａｎｎｉｔｏｌ（ｍｏｌ／Ｌ） ０ ０．１ ０ ０．１
硝酸银ＡｇＮＯ３（ｍｏｌ／Ｌ） ０ ０ ５．０ ５．０
卡那霉素５０ｍｇ／Ｌ的ＬＢ培养基中，２８℃，２００ｒ／ｍｉｎ振荡培养５～８ｈ至ＯＤ６００值约为０．６。离心后取菌体重悬浮
于ＡＢ培养基中，再次振荡培养１ｈ。经过预培养后的愈伤组织置于菌液中浸泡，其间不断摇动，１０ｍｉｎ后取出用
无菌滤纸吸干菌液，分别接种于相应共培养基上，２５℃暗培养３ｄ。
共培养后用无菌滤纸吸干愈伤组织，接种于含２００ｍｇ／Ｌ特美汀的除菌恢复培养基１周后，以２周为周期筛
选３次，筛选浓度依次为巴龙霉素１０，２５和５０ｍｇ／Ｌ。之后将抗性愈伤组织转入分化培养基，待分化幼苗约２～
３ｃｍ时移入生根培养基中。壮苗２周后，再次进行２５ｍｇ／Ｌ抗生素筛选。最后将筛选后的抗性植株炼苗、移栽
于盆钵中。
愈伤组织分化效率及转化效率计算：
抗性愈伤组织分化率＝（分化出植株的抗性愈伤组织数／共培养愈伤组织数）×１００％
转化效率＝（转基因植株数／共培养愈伤组织数）×１００％
１．５ 转基因植株鉴定
１．５．１ ＧＵＳ染色 ＧＵＳ染色法参见Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ等［３９］的方法。选取抗性愈伤组织和抗性植株的叶片、根浸入
ＧＵＳ染液，于３７℃保温过夜后吸出染液，加入７０％乙醇脱色，３７℃保温１２ｈ，其间更换乙醇３次。
１．５．２ ＰＣＲ鉴定 取植株叶片，提取基因组ＤＮＡ，方法采用改良的ＣＴＡＢ法［３５］。ＰＣＲ扩增狀狆狋Ⅱ基因片段，
长度为４６９ｂｐ。
上游引物ｎｐｔ１：５′ＴＣＣＧＧＣＣＧＣＴＴＧＧＧＴＧＧＡＧＡＧ３′
下游引物ｎｐｔ２：５′ＣＴＧＧＣＧＣＧＡＧＣＣＣＴＧＡＴＧＣＴ３′
以含质粒ｐＣＡＭＢＩＡ２３０１的大肠杆菌ＪＭ１０９为阳性对照，野生型“多福”基因组ＤＮＡ为阴性对照，检测抗
性植株。ＰＣＲ反应体系为２５μＬ，扩增条件９４℃预变性３ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，５８℃退火３０ｓ，７２℃延伸３０ｓ，３５
个循环；最后７２℃延伸５ｍｉｎ。扩增产物经１％的琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统观察并照相。
２ 结果与分析
２．１ 转化方法的建立
选择生长状态良好、致密均一的愈伤组织（图２Ａ）进行农杆菌浸染。通过３轮巴龙霉素共计６周筛选后（图
２Ｂ）进行分化（图２Ｃ），检测鉴定获得转基因植株（图２Ｄ，Ｅ）。通过对预培养、共培养和其他转化条件的优化，建
立了稳定的多年生黑麦草多福愈伤组织遗传转化方法。
２．２ ＧＵＳ组织染色鉴定
ＧＵＳ组织化学染色检测抗性愈伤组织、抗性植株的根和叶片切段。结果显示，能染成深蓝色的为转基因组
织，而非转基因对照不能着色或者呈浅蓝色（图２Ｆ；ＧＵＳ检测阳性图片来源于Ｔ４）。观察发现，非转基因愈伤组
织生长旺盛的部分以及幼嫩叶片，也显示较浅的蓝色，表明ＧＵＳ在黑麦草中有一定的内源性。
２．３ ＰＣＲ检测
抗性愈伤组织经过筛选分化，共获得约１０００株植株。检测扩增狀狆狋Ⅱ基因片段。ＥＨＡ１０５ｐ２３０１菌为阳性
对照，野生型植株叶片总ＤＮＡ为阴性对照，进行ＰＣＲ验证，能扩增出大小约４７０ｂｐ片段的植株为转基因植株。
结果显示，共有３８株扩增出１条与阳性植株相同的特异片段，其中５，１０，８和１５株转基因植株分别来自Ｔ１、Ｔ２、
Ｔ３和Ｔ４。此外，有３株ＰＣＲ验证为阳性植株却未能检测到犵狌狊基因的表达。图３显示部分结果，为第１次检
测阳性的植株，进行第２次检测验证的结果。
５０１第２０卷第１期 草业学报２０１１年
图２ 农杆菌介导的多年生黑麦草遗传转化
犉犻犵．２ 犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿犿犲犱犻犪狋犲犱狆狉犲狀狀犻犪犾狉狔犲犵狉犪狊狊狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狋犻狅狀
Ａ：胚性愈伤组织Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｃａｌｉｕｓｅｄｆｏｒｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ；Ｂ：转化后在选择培养基上，抗性细胞生长，非抗性部分褐化Ｉｎｓｅｌｅｃｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍ，ｒｅ
ｓｉｓｔａｎｔｃｅｌｓｇｒｏｗｉｎｇ，ｏｔｈｅｒｓｇｅｔｔｉｎｇｂｒｏｗｎ；Ｃ：抗性愈伤组织分化Ｒｅｓｉｓｔａｎｔｃａｌｉｉｎｓｈｏｏｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍ；Ｄ：生根培养基上的转基因苗Ｔｒａｎｓ
ｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｉｎｒｏｏｔｉｎｇｍｅｄｉｕｍ；Ｅ：温室种植的转基因植株Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｇｒｏｗｉｎｇｉｎｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ；Ｆ：ＧＵＳ活性检测，染成深蓝色的为转基因材料，
Ｆ１、Ｆ３和Ｆ５分别为对照非转基因愈伤组织、叶和根，Ｆ２、Ｆ４和Ｆ６分别为转基因愈伤组织、植株叶片和根 ＧＵＳａｃｔｉｖｉｔｙａｓｓａｙｓ．Ｆ１，Ｆ３ａｎｄＦ５ｒｅ
ｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｃａｌｉ，ｌｅａｖｅｓａｎｄｒｏｏｔｓｏｆｗｉｌｄｔｙｐｅ；Ｆ２，Ｆ４ａｎｄＦ６ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｃａｌｉ，ｌｅａｖｅｓａｎｄｒｏｏｔｓ
图３ 犘犆犚检测转基因植株狀狆狋Ⅱ基因片段
犉犻犵．３ 犘犆犚犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳狀狆狋Ⅱ犵犲狀犲犳狉犪犵犿犲狀狋犻狀狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狆犾犪狀狋狊
Ｍ：ＭａｒｋｅｒＤＬ２０００；１：阳性ＥＨＡ１０５ｐ２３０１；２：阴性野生型 Ｗｉｌｄｔｙｐｅ；３～１０：转基因植株Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ
２．４ 甘露醇及ＡｇＮＯ３ 对转化的影响
共培养前，在添加有ＡＳ（ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ，乙酰丁香酮）和葡萄糖的固体培养基上进行１周的预培养，之后在
相应的液体培养基中振荡预培养２ｄ，以利于愈伤组织的活化并使其处于感受状态。同时，在预培养基的基础上，
分别添加硝酸银和甘露醇。共培养基与相应的预培养基相同，但均为固体。
结果表明，在培养基中添加甘露醇和ＡｇＮＯ３ 后，转化效率明显提高（表３）。Ｔ４、Ｔ３、Ｔ２、Ｔ１分别获得１５，８，
１０和５个转基因株系，转化效率分别为２．５１％，１．３５％，１．６７％和０．８５％。Ｔ４、Ｔ３、Ｔ２分别为对照组 Ｔ１的
２．９５，１．５９和１．９６倍，差异显著（犘＜０．０５）。共同添加甘露醇和ＡｇＮＯ３ 的Ｔ４处理组转化效率最高，表明甘露
醇和ＡｇＮＯ３ 协同作用能更有效地促进转化。并且，在添加有ＡｇＮＯ３ 的处理中（Ｔ３、Ｔ４），愈伤组织分化率显著
高于未加ＡｇＮＯ３的Ｔ１、Ｔ２（犘＜０．０５），表明一定浓度的ＡｇＮＯ３ 能促进愈伤组织的分化。
６０１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１
表３ 不同转化条件下愈伤组织转化率的影响
犜犪犫犾犲３ 犐狀犳犾狌犲狀犮犲狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀狋狋狉犲犪狋犿犲狀狋狊狅狀狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狋犻狅狀
转化处理
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ
甘露醇
Ｍａｎｎｉｔｏｌ
（ｍｏｌ／Ｌ）
硝酸银
ＡｇＮＯ３
（ｍｏｌ／Ｌ）
接种愈伤数
Ｎｕｍｂｅｒｏｆ
ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ
ｃａｌｉ
抗性愈伤数
Ｎｕｍｂｅｒｏｆ
ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
ｃａｌｉ
分化愈伤数
Ｎｕｍｂｅｒｏｆ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
ｃａｌｉ
转基因植株数
Ｎｕｍｂｅｒｏｆ
ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｐｌａｎｔｓ
愈伤分化率
Ｒａｔｅｏｆｃａｌｕｓ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
（％）
转化效率
Ｒａｔｅｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｐｌａｎｔ
（％）
Ｔ１ ０ ０ ５８９ ３１７ ８６ ５ １４．６０ ０．８５
Ｔ２ ０．１ ０ ６００ ３０１ ７５ １０ １２．５０ １．６７
Ｔ３ ０ ５ ５９４ ３８８ １２５ ８ ２１．０４ １．３５
Ｔ４ ０．１ ５ ５９７ ３５９ １４１ １５ ２３．６２ ２．５１
３ 讨论
多年生黑麦草是单子叶禾本科植物，对农杆菌不敏感。其转化方法的探索及优化仍然是研究热点。在本试
验设置的转化条件下，通过根癌农杆菌介导，获得了多年生黑麦草转基因植株。在添加ＡｇＮＯ３、甘露醇或二者共
同添加的条件下，转化效率显著提高，能达到１．５％～２．５％，二者共同添加时，转化效率最高。在后来的转化研
究中，获得类似的结果［４１］。
在获得的转基因植株中，有３株ＰＣＲ验证为阳性植株却未能检测到犵狌狊基因的表达，可能是转基因引起的
转录后基因沉默［４２］。
３．１ 硝酸银
有研究表明，硝酸银可以促进遗传转化，目前已用在多种作物的遗传转化中，农杆菌转化后，低浓度硝酸银可
以减轻愈伤组织褐化，提高抗性愈伤率和绿苗分化率［２９３３］。在水稻的转化中，最适浓度为２～８ｍｇ／Ｌ［３２］；烟草转
化中，５ｍｇ／Ｌ硝酸银对芽分化具有最佳促进作用［３４］。但在黑麦草遗传转化研究中还未见报道。因此，在前人的
研究基础上，本研究选择了５ｍｇ／Ｌ硝酸银进行研究。
在单子叶植物遗传转化中，农杆菌浸染后造成愈伤组织的褐化坏死，是转化的很大障碍。硝酸银是一种强还
原剂，可以降低转化过程中植物细胞的氧化，减少褐化［３２，４３］。并且在一定程度上抑制农杆菌的过度生长，减轻受
体对农杆菌产生过敏性反应造成的褐化死亡，但不影响ＴＤＮＡ的转移和整合［４４］。
此外，银离子能抑制乙烯产生及其活性，促进分化。植物在受到胁迫（如机械损伤、病菌浸染等）后，体内乙烯
含量常常会升高，从而降低细胞活性，可能是通过竞争性地结合于细胞膜上的乙烯受体蛋白而阻止乙烯与其受体
结合，从而促进器官发生和体细胞发生［４３，４５］。同时，在植物转化时使用适当的硝酸银处理，会使植物细胞的感受
态增强，这些处于良好感受态的细胞也易分化产生不定芽［４６］。
本研究在预培养和共培养中添加５ｍｇ／Ｌ硝酸银，可以有效降低愈伤组织氧化坏死，并抑制农杆菌过度生
长，以及促进愈伤组织分化、植株再生，从而获得较高的转化效率。结果表明，单独添加硝酸银或与甘露醇共同添
加时可以有效提高转化效率。
３．２ 甘露醇
甘露醇是一种单糖，中性糖。在利用基因枪转化单子叶植物愈伤组织前，常用一定浓度的甘露醇培养基预处
理，以在细胞内外形成一定的渗透压便于遗传转化。甘露醇作为Ｖｉｒ区基因诱导剂［３５］，同时可作为渗透调节物
质，调节细胞内外的渗透压。马生健等［４７］研究表明高羊茅愈伤组织在与农杆菌共培养后使用含０．０５５ｍｏｌ／Ｌ甘
露醇和抗生素的无菌水洗涤，高渗处理下，愈伤组织细胞胞质会变浓，便于愈伤组织后期生长。陈志俊和刘荣
维［３７］在基因枪转化后０．１ｍｏｌ／Ｌ甘露醇处理，ＧＵＳ基因表达效率最高。冯莹和赖钟雄［３６］研究显示石斛兰
（犇犲狀犱狉狅犫犻狌犿）圆球茎在农杆菌浸染前，在经过附加０．３ｍｏｌ／Ｌ甘露醇高渗固体培养基中进行前处理６ｈ后，
ＧＵＳ瞬时表达率可提高为６０％。其他研究也显示高渗透处理可以提高遗传转化率［４８］。综合前人研究结果，本
研究选择甘露醇浓度为０．１ｍｏｌ／Ｌ。
７０１第２０卷第１期 草业学报２０１１年
本研究中只添加甘露醇的Ｔ２，尽管愈伤组织分化率与 Ｔ１相近，但其转化效率亦达到１．６７％，高于对照
（Ｔ１）。推测，长时间的甘露醇高渗透处理会影响愈伤组织生长状态，并在农杆菌的协同作用下使部分愈伤组织
外层细胞坏死；但另一方面，高渗透处理后，会延长愈伤组织内层细胞的渗透压时间，在愈伤组织恢复培养的过程
中，附着于内层细胞的农杆菌可以有效的进行继共培养后的第２轮浸染。相对于其他处理，Ｔ２在３轮抗生素筛
选过程后，愈伤组织褐化坏死数目较多，但假阳性亦较少，从而获得一定的转化效率。
当硝酸银与甘露醇共用时，即Ｔ４，硝酸银可以降低愈伤组织的氧化率、弱化甘露醇的高渗透作用和抑制农杆
菌的快速生长，使其处于一个平衡状态，便于农杆菌浸染，从而显著提高转化率，转化效率达到２．５１％。
３．３ ＧＵＳ内源活性对检测的影响
Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ等［３９］、Ｈｕ和Ｃｈｅｅ［４９］指出有些植物在生长旺盛的组织中，如幼胚、幼穗等，具有一定的ＧＵＳ内源
活性。虽然本研究中ＧＵＳ染色结果表明黑麦草愈伤组织和植株幼嫩叶片中均有一定的ＧＵＳ内源活性。但是
在转基因愈伤组织和转基因植株中，外源ＧＵＳ基因稳定表达，ＧＵＳ染色后呈深蓝色，而非转基因组织部分呈浅
蓝色，观察中能显著区分，不影响观察结果，如图２。这说明ＧＵＳ染色依然是验证转基因植物的有力工具。
近年来，澳大利亚国际农业分子生物学应用中心（ＣＡＭＢＩＡ）从土壤细菌葡萄球菌（犛狋犪狆犺狔犾狅犮狅犮犮狌狊ｓｐ．）中，
分离克隆了一种新的、具有优良生物化学特性的犌犝犛基因，称为ＧＵＳＰｌｕｓＴＭ。灵敏度是目前广泛应用的、来自
大肠杆菌ＧＵＳ的１０倍，可以被植物细胞分泌到胞外，进行活体检测，不损失细胞，从而获得更多的转基因植
株［５０］。有望在今后的研究中得以应用。
３．４ 巴龙霉素的选择
本研究中，获得了大量假阳性植株，分析原因主要是前期筛选压力不够造成的。由于根癌农杆菌介导的转化
非常困难，共培养后，转化细胞极少，若选择压力太大，在短期内很快杀死极大多数的非转化细胞，可能造成转化
细胞亦难以存活。不同植物种类和受体系统对各种筛选剂的敏感性存在差异［５１］。筛选剂的使用浓度亦不同，氨
基糖苷类抗生素如卡那霉素的筛选浓度通常在２５～１００ｍｇ／Ｌ［５２，５３］。另外，在选择时间、周期上，本研究只进行
了３轮选择，且巴龙霉素筛选浓度从１０ｍｇ／Ｌ到５０ｍｇ／Ｌ，筛选强度较低，只在一定程度上抑制了非转化细胞的
生长。在前期的研究中发现，选择压力增加，继代时间过长，尽管可以有效地去除非转化细胞，但是愈伤组织分化
能力急剧下降，获得许多转基因愈伤组织系，但是没能分化成植株（数据另文发表）。因此采用低剂量短时间巴龙
霉素进行筛选。尽管这样的选择方式给后期鉴定带来较大的工作量，但是能有效获得转基因植株。
综上所述，添加甘露醇和硝酸银可以辅助建立稳定的黑麦草遗传转化体系。但二者的最佳浓度，以及对农杆
菌介导的ＴＤＮＡ转移机制的影响还需要进一步探索。
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狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊ａｎｄｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓｆｒｅｅｆｒｏｍｓｅｌｅｃｔｉｏｎｍａｋｅｒｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌ，１９９６，１０：１６５１７４．
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（１．ＥＣＯＲＥＳＬａｂ，ＣｈｅｎｇｄｕＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢｉｏｌｏｇｙ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｈｅｎｇｄｕ６１００４１，Ｃｈｉｎａ；
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ＥＨＡ１０５ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｔｈｅｐｌａｓｍｉｄｐＣＡＭＢＩＡ２３０１．Ｉｎｔｈｉｓｐｒｏｔｏｃｏｌ，０．１ｍｏｌ／Ｌｍａｎｎｉｔｏｌｏｒ５ｍｇ／Ｌｓｉｌｖｅｒｎｉｔｒａｔｅ
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ＰＣＲａｎｄＧＵＳｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｗｅｇｏｔ３８ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｉｎａｌ．Ｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｆｒｅｑｕｅｎｃｙｗａｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｗｈｅｎ０．１
ｍｏｌ／Ｌｍａｎｎｉｔｏｌｏｒ５ｍｇ／ＬＡｇＮＯ３ｏｒ５ｍｇ／ＬＡｇＮＯ３＋０．１ｍｏｌ／Ｌｍａｎｎｉｔｏｌｗａｓａｄｄｅｄｉｎｔｈｅｐｒｅｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ
ａｎｄｃｏｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｍｅｄｉａ，ｗｈｉｃｈｗａｓ１．９６，１．５９ａｎｄ２．９５ｔｉｍｅｓｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｃｏｎｔｒｏｌｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，
ｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｆｒｅｑｕｅｎｃｙｗａｓｈｉｇｈｅｓｔｗｈｅｎｔｈｅｔｗｏｍａｔｅｒｉａｌｓｗｅｒｅｊｏｉｎｔｌｙｕｓｅｄ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｍａｎ
ｎｉｔｏｌａｎｄＡｇＮＯ３ｃｏｕｌｄｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅ犃．狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎｐｅｒｅｎｎｉａｌｒｙｅｇｒａｓｓｅｖｉｄｅｎｔｌｙ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ｐｅｒｅｎｎｉａｌｒｙｅｇｒａｓｓ；犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊；ｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ｃａｌｕｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；ｓｉｌｖｅｒｎｉ
ｔｒａｔｅ；ｍａｎｎｉｔｏｌ
０１１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１