全 文 ：书金属硫蛋白对热应激奶牛血淋巴细胞凋亡基因和
犎犛犘７０基因表达的影响
罗佳捷１，吴宗明１，张彬１，李丽立２，吴力专１，陈宇光１，肖定福１，毕小艳１
（１．湖南农业大学动物科学技术学院，湖南 长沙４１０１２８；２．中国科学院亚热带农业生态研究所
动物生态营养与健康养殖联合实验室 农业生态工程重点实验室，湖南 长沙４１０１２５）
摘要：为探讨金属硫蛋白（ＭＴ）对热应激奶牛血淋巴细胞凋亡基因和犎犛犘７０基因表达的影响及其机理，选取２５头
中国荷斯坦奶牛经产泌乳母牛，随机均分为Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ５组，分别按每头０（对照），１６．０，２４．０，３２．０和４０．０ｍｇ
颈静脉注射ＺｎＭＴ，于试验第１（注射ＺｎＭＴ之前），７和１４天逐头采取血样，测定不同剂量的外源性 ＭＴ对热应
激奶牛血淋巴细胞犎犛犘７０、犅犮犾２、犅犪狓和狆５３基因表达水平的影响。结果表明，补给外源性 ＭＴ后，４个试验组奶
牛的产奶性能都有不同程度提高，其中Ｂ组奶牛的产奶量比Ａ、Ｃ、Ｄ和Ｅ组分别高出２０．９４％（犘＜０．０５），１５．８３％
（犘＞０．０５），１０．９４％（犘＞０．０５）和８．８５％（犘＞０．０５）；各试验组 犎犛犘７０基因的表达水平都有所上升，其中Ｄ组比
对照组高出１３０．００％，达到显著（犘＜０．０５）水平；各试验组犅犮犾２基因的表达水平均高于对照组，其中Ｃ组达到显
著（犘＜０．０５）水平；Ｂ、Ｄ组犅犪狓基因的表达水平和Ｃ、Ｅ组狆５３基因的表达水平较对照组分别降低了２２．００％，
１３．００％和２２．００％，３４．００％，但均未达到显著（犘＞０．０５）水平。说明外源性 ＭＴ能改善热应激奶牛的产奶性能并
有效调控奶牛血淋巴细胞犎犛犘７０、犅犮犾２、犅犪狓和狆５３基因的表达水平，且表现出较为明显的剂量效应。
关键词：金属硫蛋白；热应激；细胞凋亡；基因表达；奶牛
中图分类号：Ｓ８２３．９１３　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１２）０４０２４４０８
　　热应激对奶牛生产性能、繁殖性能及免疫性能等方面均有不利影响［１３］，探索减少或缓解热应激的途径一直
是奶牛饲养业的重大课题之一。金属硫蛋白（ｍｅｔａｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ，ＭＴ）是一种低分子量、富含金属和半胱氨酸的功
能性结合蛋白，是遍布于哺乳动物各个组织且具有广泛而重要生理学和生物学功能的天然生物活性物质［４］。
ＭＴ的主要作用是参与微量元素储存、转运和代谢，重金属解毒，拮抗电离辐射，清除羟基自由基，增强机体免疫
力，提高抗应激和抗氧化能力，参与ＤＮＡ的复制、转录和能量代谢的调节过程，其中尤以清除羟基自由基、抗应
激和抗氧化的作用大，其研究和开发涉及农业、医药保健、生物工程和环境保护等诸多领域［５１０］。近年来，有关学
者初步研究了 ＭＴ在奶牛体内的代谢规律及其对奶牛抗热应激调控的机理，发现 ＭＴ能通过提高奶牛体内超氧
化物歧化酶（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ，ＳＯＤ）、谷胱甘肽过氧化物酶（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＧＳＨＰｘ）和过氧化氢
酶（ｃａｔａｌａｓｅ，ＣＡＴ）基因的表达水平来显著提高奶牛的抗热应激和抗氧化能力［１１１４］，但此类研究较少，且欠深入。
有研究指出，热休克蛋白犎犛犘７０和抗细胞凋亡基因犅犮犾２均能有效提高机体对抗热应激的能力［１５，１６］，犅犪狓和
狆５３基因则能通过促进机体细胞凋亡来削弱机体抗应激的能力［１７１９］，而 ＭＴ对奶牛体内犎犛犘７０和细胞凋亡基
因表达的影响尚未见报道。本研究拟探索外源性 ＭＴ对奶牛体内犎犛犘７０、犅犮犾２、犅犪狓和狆５３基因表达的影响，
为揭示 ＭＴ调控奶牛抗热应激机理的理论研究及其在奶业安全生产中的应用提供科学依据。
１　材料与方法
１．１　材料及其来源
金属硫蛋白使用湖南农业大学畜禽品质改良实验室建立的方法诱导合成、分离和纯化的奶牛肝脏锌金属硫
２４４－２５１
２０１２年８月
　　　草　业　学　报　　　
　　　ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ　　　
第２１卷　第４期
Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．４
收稿日期：２０１１０５２０；改回日期：２０１１１０２７
基金项目：国家自然科学基金项目（３１０７２０５３；３０６７１５１６），湖南省自然科学基金重点项目（１１ＪＪ２０１４）和湖南省博士生科技创新基金项目
（ＣＸ２０１０Ｂ２８４）资助。
作者简介：罗佳捷（１９８４），男，湖南湘潭人，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｋａｋａａｄｒｉａｎｏ＠１２６．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｚｈｂ８２３６＠１２６．ｃｏｍ，ｌｉｌｉ＠ｉｓａ．ａｃ．ｃｎ
蛋白（ＺｎＭＴ）［２０］，并用该实验室建立的间接竞争型酶联免疫吸附剂测定（ｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ，
ＥＬＩＳＡ）法定量［２１］。
１．２　试验动物的选择、分组与试验设计
本试验于２０１０年７月２７日－８月１７日在湖南省畜牧兽医研究所奶牛场进行，选取年龄、体重、胎次、产犊
时间、泌乳量及以往泌乳期产奶成绩相近的中国荷斯坦奶牛经产泌乳母牛２５头，随机均分为Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ５组，
每组５头。其中Ａ组为对照组，Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ组为试验组，分别在正式试验开始的当天（１ｄ）每头颈静脉注射经生理
盐水溶解的ＺｎＭＴ１６．０，２４．０，３２．０和４０．０ｍｇ。试验期为１５ｄ（１～１５ｄ）。
１．３　饲养管理方式
试验奶牛在同一牛舍以双列对尾栓系式饲养，每头牛１个牛床。各组奶牛饲喂相同日粮，日粮系奶牛场参照
美国国家研究委员会（ｎａｔｉｏｎａｌｒｅｓｅａｒｃｈｃｏｕｎｃｉｌ，ＮＲＣ）（２００１）和《中国奶牛饲养标准》（２００４）自行配制，其组成为
（ｋｇ／头）：玉米３．１３６、麦麸０．７２８、豆粕０．５０４、棉粕０．４４８、菜粕０．２８０、酵母粉０．２８０、磷酸氢钙０．０５６、石粉
０．０５６、碳酸氢钠０．０５６、稻草１０、象草２０；日粮营养水平：产奶净能（ｎｅｔｅｎｅｒｇｙｆｏｒｌａｃｔａｔｉｏｎ，ＮＥＬ）８６．６０ＭＪ／
（头·ｄ）、奶牛能量单位（ＮａｉｎｉｕＮｅｎｇｌｉａｎｇＤａｎｗｅｉ，ＮＮＤ）２７．６０／（头·ｄ）、粗蛋白质（ｃｒｕｄｅｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＰ）１５８５．６０
ｇ／（头·ｄ）、Ｃａ５７．４４ｇ／（头·ｄ）、Ｐ３２．８０ｇ／（头·ｄ）。专人饲养管理，各组饲养管理方式一致，每天记录产奶量。
１．４　采样
在试验期的第１（注射 ＭＴ前），７和１４天分别从供试奶牛的尾静脉采血。每次采血约为２０ｍＬ，用肝素钠
（３．２ｍＬ，２５０Ｕ／ｍＬ）抗凝全血，马上分离淋巴细胞或放入４℃冰箱保存待用。
１．５　基因表达分析
１．５．１　引物设计及合成　基因表达分析采用荧光定量逆转录聚合酶链式反应（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
ｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＲＴ－ＰＣＲ）法，根据网上（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）发表的基因序列，以犅犲狋犪犪犮狋犻狀ｍＲ
ＮＡ和３磷酸甘油醛脱氢酶基因（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ３ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅａｓｅｇｅｎｅ，犌犃犘犇犎）ｍＲＮＡ作内参，根
据ＧｅｎＢａｎｋ中奶牛的 犎犛犘７０、犅犮犾２、犅犪狓、狆５３、犌犃犘犇犎 和犅犲狋犪犪犮狋犻狀 的基因登陆序列（依次为ＢＴＵ０９８６１、
ＢＴＵ９２４３４、ＢＴＵ９２５６９、ＢＣ１０２４４０．１、ＢＴＵ８５０４２和ＢＣ１４２４１３），用ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５．０软件设计引物（表１）。引
物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
１．５．２　血液淋巴细胞及总ＲＮＡ的提取　血液淋巴细胞用北京索莱宝科技有限公司生产的淋巴细胞分离液进
行提取，所有过程均在无菌操作台上进行。
表１　犎犛犘７０、犅犮犾２、犅犪狓、狆５３、犌犃犘犇犎和犅犲狋犪犪犮狋犻狀基因的引物设计
犜犪犫犾犲１　犘狉犻犿犲狉犱犲狊犻犵狀犳狅狉犎犛犘７０，犅犮犾２，犅犪狓，狆５３，犌犃犘犇犎犪狀犱犅犲狋犪犪犮狋犻狀
扩增基因Ｇｅｎｅ 引物序列Ｐｒｉｍｅｒｓｑｕｅｎｃｅ（５′３′） 产物Ｐｒｏｄｕｃｔ（ｂｐ）
犎犛犘７０ 上游Ｕｐｐｅｒｓｔｒｅａｍ：５′ＴＧＴＣＧＣＴＧＧＧＡＣＴＧＧＡ３′ １４０
下游Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ：５′ＧＣＣＣＴＣＧＴＡＣＡＣＣＴＧＧＡＴ３′
犅犮犾２ 上游Ｕｐｐｅｒｓｔｒｅａｍ：５′ＧＡＴＧＡＣＣＧＡＧＴＡＣＣＴＧＡＡＣＣ３′ １２２
下游Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ：５′ＧＡＧＡＣＡＧＣＣＡＧＧＡＧＡＡＡＴＣＡ３′
犅犪狓 上游Ｕｐｐｅｒｓｔｒｅａｍ：５′ＧＡＧＴＧＧＣＧＧＣＴＧＡＡＡＴ３′ ９１
下游Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ：５′ＧＣＣＴＴＧＡＧＣＡＣＣＡＧＴＴＴ３′
狆５３ 上游Ｕｐｐｅｒｓｔｒｅａｍ：５′ＣＴＴＴＧＡＧＧＴＧＣＧＴＧＴＴＴ３′ １１８
下游Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ：５′ＣＡＧＴＧＣＴＣＧＣＴＴＡＧＴＧＣ３′
犌犃犘犇犎 上游Ｕｐｐｅｒｓｔｒｅａｍ：５′ＡＴＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＧＴＡＴＧＴ３′ １６６
下游Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ：５′ＡＡＴＣＴＴＧＡＧＧＧＴＧＴＴＧＴＴＡＴ３′
β犪犮狋犻狀 上游Ｕｐｐｅｒｓｔｒｅａｍ：５′ＴＣＣＡＧＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴ３′ １１６
下游Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ：５′ＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＧＴＧＴＴＧＧＣＧＴＡＧＡ３′
５４２第２１卷第４期 草业学报２０１２年
１．５．３　反转录ｃＤＮＡ　采用 ＲｅｖｅｒｔＡｉｄＴＭ Ｆｉｒｓｔ
ＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｓｔｈｅｓｉｓＫｉｔ反转录试剂盒，按试剂盒
说明书操作。
１．５．４　ｃＤＮＡ的ＲＴ－ＰＣＲ反应体系　犎犛犘７０、犅犮犾
２、犅犪狓和狆５３的荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ反应体系各成分
及加样量见表２。反应条件为：９５℃预变性１ｍｉｎ，进
行如下循环：９５℃１５ｓ，６０℃１５ｓ，７２℃４５ｓ；３５个循环
后，７２℃延伸７ｍｉｎ，４℃保存。
１．５．５　ＲＴ－ＰＣＲ产物的检测与相对定量　所得产
物用１％琼脂糖凝胶电泳检测条带，条件为：９０Ｖ，６０
ｍｉｎ，凝胶电泳成像系统成像，以５０ｂｐＭａｒｋｅｒ作对照
检验目标条带大小是否与β犪犮狋犻狀产物大小相同。本
试验中将ｃＤＮＡ样品进行１，５，２５，１２５，６２５，３１２５倍
稀释，对目的基因和内参基因进行ＰＣＲ扩增，以ｃＤ
ＮＡ稀释倍数取对数值为横坐标，△Ｃｔ值为纵坐标作
图，得到回归线狔＝０．０６２９狓＋６．０５８，犚２＝０．５５，曲线
表２　犚犜－犘犆犚反应体系各成分及加样量
犜犪犫犾犲２　犐狀犵狉犲犱犻犲狀狋狊犪狀犱犪犱犱犻狀犵狊犪犿狆犾犲犪犿狅狌狀狋
狅犳犚犜－犘犆犚狉犲犪犮狋犻狅狀狊狔狊狋犲犿
成分
Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ
加样量
Ａｄｄｉｎｇｓａｍｐｌｅ
ａｍｏｕｎｔ（μＬ）
ｃＤＮＡ ５．０
嵌合荧光定量逆转录聚合酶链式反应预混液
ＳＹＢＲｇｒｅｅｎｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲｍａｓｔｅｒｍｉｘ
２５．０
β犪犮狋犻狀上游引物Ｕｐｐｅｒｓｔｒｅａｍｐｒｉｍｅｒ（１０ｐｍｏｌ／μＬ） １．０
β犪犮狋犻狀下游引物Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍｐｒｉｍｅｒ（１０ｐｍｏｌ／μＬ） １．０
犌犃犘犇犎 上游引物Ｕｐｐｅｒｓｔｒｅａｍｐｒｉｍｅｒ（１０ｐｍｏｌ／μＬ） １．０
犌犃犘犇犎 下游引物Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍｐｒｉｍｅｒ（１０ｐｍｏｌ／μＬ） １．０
灭菌蒸馏水Ｄｉｓｔｉｌｅｄｗａｔｅｒ １６．０
总反应体积Ｃｕｂａｇｅｏｆｔｈｅｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ ５０．０
斜率为０．０６２９，说明目的基因和内参基因扩增效率基本一致，可以用２△△Ｃｔ法计算本试验中基因相对表达量，即
以对照组基因表达量为１倍，处理组表达量为相对于对照组的表达倍数。
１．６　数据处理与统计分析
数据用Ｅｘｃｅｌ进行初步处理后，再使用ＳＰＳＳ１６．０统计软件进行成对样本差异显著性检验，结果用平均值±
标准误表示，检验误差为５％和１％水平。
２　结果与分析
２．１　不同剂量 ＭＴ对奶牛产奶性能的影响
注射外源性 ＭＴ后，各试验组奶牛的产奶性能较Ａ组均有提高（表３），其中Ｂ、Ｃ组在试验期第７和１４天的
产奶量均显著（犘＜０．０５）或极显著（犘＜０．０１）高于Ａ组；Ｄ、Ｅ组在试验期第７天的产奶量虽然较Ａ组有所提高，
但差异不显著（犘＞０．０５），而到试验期第１４天时差异均达到显著（犘＜０．０５）水平。这说明较低剂量（１６．０和
２４．０ｍｇ）的 ＭＴ在注射后马上发挥了效用，而较高剂量（３２．０和４０．０ｍｇ）的 ＭＴ在注射７ｄ后才开始发挥功
效。从各试验组奶牛在正式试验期产奶量的平均值看，Ｂ、Ｃ、Ｄ和Ｅ组的产奶量比对照组分别高出２０．９４％（犘＜
０．０５）、１５．８３％（犘＞０．０５）、１０．９４％（犘＞０．０５）和８．８５％（犘＞０．０５）。说明１６．０ｍｇ的 ＭＴ注射量对热应激奶
牛产奶性能的改善作用最为显著。
表３　不同剂量 犕犜对奶牛产奶性能的影响
犜犪犫犾犲３　犈犳犳犲犮狋狊狅犳犕犜犻狀犱犻犳犳犲狉犲狀狋犱狅狊犪犵犲狊狅狀犿犻犾犽狆狉狅犱狌犮犻狀犵犪犫犻犾犻狋狔狅犳犱犪犻狉狔犮犪狋狋犾犲 ｋｇ／ｄ
时间
Ｔｉｍｅ（ｄ）
剂量 Ｄｏｓａｇｅ（ｍｇ）
Ａ（０） Ｂ（１６．０） Ｃ（２４．０） Ｄ（３２．０） Ｅ（４０．０）
１ １０．２８±０．８２ａ １１．１２±０．６７ａ １０．６８±１．１６ａ １０．２７±０．７３ａ １０．３５±０．９４ａ
７ １０．１２±１．２７ｂ １３．０８±１．３６ａ １２．８７±０．７３ａ １１．５２±０．８３ｂ １０．７６±０．４４ｂ
１４ ８．４１±１．４２Ｂｃ １０．６４±０．２９Ａａ ９．８２±０．８４ｂ １０．１７±０．６１ａｂ １０．２３±０．５６ａｂ
平均 Ｍｅａｎ ９．６０±１．０４ｂ １１．６１±１．２９ａ １１．１２±１．５７ａｂ １０．６５±０．７５ａｂ １０．４５±０．２８ａｂ
　注：同行不同大写字母表示差异极显著（犘＜０．０１），不同小写字母表示差异显著（犘＜０．０５）。下同。
　Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅｒｅａｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｂｅｔｗｅｅｎｆｉｇｕｒｅｓｉｎｔｈｅｓａｍｅｒｏｗｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｏｗｅｒｃａｓｅｌｅｔｔｅｒｓ（犘＜０．０５）ａｎｄｃａｐｉｔａｌｌｅｔｔｅｒｓ（犘＜０．０１）
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ．
６４２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．４
２．２　不同剂量 ＭＴ对奶牛犎犛犘７０基因表达水平的影响
在正式试验开始的当天（补给外源性ＭＴ前），各组奶牛血液中犎犛犘７０基因的表达水平均无显著（犘＞０．０５）
差异（表４）。补给 ＭＴ后，４个试验组奶牛犎犛犘７０基因的表达水平均有一定程度的提高，其中Ｃ组在试验期第
１４天、Ｄ组在试验第７和１４天犎犛犘７０基因的表达水平均显著（犘＜０．０５）高于对照组。就正式试验期所测奶牛
犎犛犘７０基因表达水平的平均值看，Ｄ组较对照组有显著（犘＜０．０５）提高，而Ｂ、Ｃ、Ｅ组虽高于对照组，但差异不
显著（犘＞０．０５）。说明通过注射３２．０ｍｇ剂量的外源性 ＭＴ对奶牛犎犛犘７０基因表达量产生了积极的影响。
表４　不同剂量 犕犜对奶牛犎犛犘７０基因表达水平的影响
犜犪犫犾犲４　犈犳犳犲犮狋狊狅犳犕犜犻狀犱犻犳犳犲狉犲狀狋犱狅狊犪犵犲狊狅狀犎犛犘７０犵犲狀犲犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀犾犲狏犲犾狊狅犳犱犪犻狉狔犮犪狋狋犾犲
时间
Ｔｉｍｅ（ｄ）
剂量 Ｄｏｓａｇｅ（ｍｇ）
Ａ（０） Ｂ（１６．０） Ｃ（２４．０） Ｄ（３２．０） Ｅ（４０．０）
１ １．００ａ １．１４±０．１５ａ １．０８±０．１２ａ ０．９４±０．０８ａ １．１２±０．１０ａ
７ １．００ｂ １．２６±０．１７ｂ １．１３±０．１０ｂ ３．２２±０．１３ａ １．１９±０．１７ｂ
１４ １．００ｂ １．１７±０．０９ｂ ２．５０±０．１８ａ ２．７３±０．１５ａ １．２１±０．１２ｂ
平均 Ｍｅａｎ １．００ｂ １．１９±０．０６ａｂ １．５７±０．８１ａｂ ２．３０±１．２０ａ １．１７±０．０５ａｂ
２．３　不同剂量 ＭＴ对奶牛犅犮犾２基因表达水平的影响
补给外源性 ＭＴ前，各组奶牛血液淋巴细胞中犅犮犾２基因的表达水平差异不显著（犘＞０．０５）（表５）。注射
ＭＴ后，Ｃ组在试验期第７和１４天、Ｄ组在试验期第７天及Ｅ组在试验期第１４天犅犮犾２基因的表达水平均显著
（犘＜０．０５）或极显著（犘＜０．０１）高于对照组；而Ｂ组犅犮犾２基因的表达水平与对照组差异不显著（犘＞０．０５）。从
正式试验期各组奶牛犅犮犾２基因表达水平的平均值看，Ｃ组显著（犘＜０．０５）高于对照组。说明２４．０ｍｇ剂量的
ＭＴ对奶牛犅犮犾２基因表达的诱导作用最为显著。
表５　不同剂量 犕犜对奶牛犅犮犾２基因表达水平的影响
犜犪犫犾犲５　犈犳犳犲犮狋狊狅犳犕犜犻狀犱犻犳犳犲狉犲狀狋犱狅狊犪犵犲狊狅狀犅犮犾２犵犲狀犲犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀犾犲狏犲犾狊狅犳犱犪犻狉狔犮犪狋狋犾犲
时间
Ｔｉｍｅ（ｄ）
剂量 Ｄｏｓａｇｅ（ｍｇ）
Ａ（０） Ｂ（１６．０） Ｃ（２４．０） Ｄ（３２．０） Ｅ（４０．０）
１ １．００ａ １．１５±０．１６ａ １．１１±０．２１ａ １．０６±０．１４ａ １．０３±０．２０ａ
７ １．００Ｂｃ １．０４±０．１１Ｂｃ ４．２９±０．０９Ａａ ２．３２±０．１１ｂ １．１７±０．１３Ｂｃ
１４ １．００Ｂｃ １．０７±０．１４Ｂｃ ４．１６±０．３６Ａａ １．１４±０．１６Ｂｃ ３．８３±０．０８ｂ
平均 Ｍｅａｎ １．００ｂ １．０９±０．０６ｂ ３．１９±１．８０ａ １．５１±０．７１ａｂ ２．０１±１．５８ａｂ
２．４　不同剂量 ＭＴ对奶牛犅犪狓基因表达水平的影响
在正式试验开始时（注射外源性 ＭＴ前），各组奶牛血液淋巴细胞中犅犪狓基因的表达水平均无显著（犘＞
０．０５）差异（表６）。注射 ＭＴ后，Ｂ组奶牛在试验第７天、Ｄ组奶牛在试验期第１４天犅犪狓基因的表达水平均显著
（犘＜０．０５）低于对照组；Ｂ、Ｅ组奶牛在试验期第１４天及Ｄ组奶牛在试验期第７天犅犪狓基因的表达水平虽然较
对照组有所降低，但未达到显著（犘＞０．０５）水平；而Ｃ组在试验期第７和１４天犅犪狓基因的表达水平比对照组有
所提高，但差异也不显著（犘＞０．０５）。就正式试验期各组奶牛犅犪狓基因表达水平的平均值看，尽管Ｂ、Ｄ两组
犅犪狓基因的表达水平分别较对照组下降了２２．００％（犘＞０．０５）和１３．００％（犘＞０．０５），但各组之间差异均未达到
显著水平。
２．５　不同剂量 ＭＴ对奶牛狆５３基因表达水平的影响
在试验开始时（注射外源性 ＭＴ前），各组奶牛血液淋巴细胞中狆５３基因的表达水平均无显著（犘＞０．０５）差
７４２第２１卷第４期 草业学报２０１２年
异（表７）。注射 ＭＴ后，Ｂ组奶牛在试验期第７天、Ｃ组奶牛在试验期第７和１４天、Ｄ组奶牛在试验期第１４天及
Ｅ组奶牛在试验期第７和１４天狆５３基因的表达水平要显著（犘＜０．０５）或极显著（犘＜０．０１）低于对照组。就正式
试验期各组奶牛狆５３基因表达水平的平均值看，Ｃ、Ｅ两组分别较对照组下降了２２．００％（犘＞０．０５）和３４．００％（犘
＞０．０５）。说明２４．０和４０．０ｍｇ剂量的外源性 ＭＴ能对奶牛血液淋巴细胞中狆５３基因的表达产生一定的抑制
作用。
表６　不同剂量 犕犜对奶牛犅犪狓基因表达水平的影响
犜犪犫犾犲６　犈犳犳犲犮狋狊狅犳犕犜犻狀犱犻犳犳犲狉犲狀狋犱狅狊犪犵犲狊狅狀犅犪狓犵犲狀犲犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀犾犲狏犲犾狊狅犳犱犪犻狉狔犮犪狋狋犾犲
时间
Ｔｉｍｅ（ｄ）
剂量 Ｄｏｓａｇｅ（ｍｇ）
Ａ（０） Ｂ（１６．０） Ｃ（２４．０） Ｄ（３２．０） Ｅ（４０．０）
１ １．００ａ １．１３±０．０４ａ １．２６±０．０３ａ １．２１±０．０６ａ １．１９±０．０７ａ
７ １．００ａ ０．３１±０．０５ｂ １．１５±０．０７ａ ０．９６±０．０８ａ １．０４±０．０８ａ
１４ １．００ａ ０．９１±０．０８ａ １．０４±０．０６ａ ０．４３±０．０９ｂ ０．８７±０．１０ａ
平均 Ｍｅａｎ １．００ａ ０．７８±０．４２ａ １．１５±０．１１ａ ０．８７±０．４０ａ １．０３±０．１６ａ
表７　不同剂量 犕犜对奶牛狆５３基因表达水平的影响
犜犪犫犾犲７　犈犳犳犲犮狋狊狅犳犕犜犻狀犱犻犳犳犲狉犲狀狋犱狅狊犪犵犲狊狅狀狆５３犵犲狀犲犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀犾犲狏犲犾狊狅犳犱犪犻狉狔犮犪狋狋犾犲
时间
Ｔｉｍｅ（ｄ）
剂量 Ｄｏｓａｇｅ（ｍｇ）
Ａ（０） Ｂ（１６．０） Ｃ（２４．０） Ｄ（３２．０） Ｅ（４０．０）
１ １．００ａ １．２１±０．０７ａ １．２３±０．１１ａ １．１４±０．０７ａ １．１６±０．０６ａ
７ １．００ＡＢｂ ０．６７±０．０６ＢＣｃｄ ０．７３±０．０９ＢＣｃ １．８７±０．１１Ａａ ０．５２±０．１０Ｃｄ
１４ １．００ｂ １．６３±０．０９Ａａ ０．３８±０．１３Ｂｃ ０．２４±０．０４Ｂｃ ０．３１±０．０５Ｂｃ
平均 Ｍｅａｎ １．００ａ １．１７±０．４８ａ ０．７８±０．４３ａ １．０８±０．８２ａ ０．６６±０．４４ａ
３　讨论
３．１　ＭＴ对奶牛产奶性能的影响
张彬等［１１］认为，ＭＴ是机体内清除自由基能力最强的一种蛋白质，能够有效调控奶牛泌乳量和抗氧化能力，
及时清除体内自由基，修复细胞氧化损伤。当牛舍的温湿指数（ＴＨＩ）大于７２时，奶牛就处于热应激状态［２２］，奶
牛受热应激的影响，直肠温度、呼吸频率和脉搏等３项生理常数指标均会显著升高，直接影响到奶牛的采食量，并
最终导致产奶量的显著下降［２３］。在本研究中，试验期间奶牛舍的ＴＨＩ均大于７６，说明奶牛一直处于热应激状
态。对照组奶牛产奶量的逐步减少反应了热应激对奶牛产生的不利影响，而 ＭＴ注射组奶牛的产奶量却有不同
程度的提高，４个试验组全期产奶量的平均值分别比第１天高出４．４１％，４．１２％，３．７０％和０．９７％，分别比对照
组高出２０．９４％，１５．８３％，１０．９４％和８．８５％，说明ＭＴ对奶牛热应激有很好的缓解作用，能有效清除热应激产生
的过量自由基，增强奶牛机体抗氧化功能，进而增加采食量，提高奶牛的产奶性能。此外，吴力专等［５］研究发现，
奶牛血清中胰岛素（ＩＮＳ）、胰岛素样生长因子Ⅰ（ＩＧＦⅠ）和甲状腺素（Ｔ３）的含量在注射 ＭＴ后均显著升高，说明
外源性 ＭＴ还能通过控制奶牛机体产能来调节体温，从而提高奶牛的产奶性能。在本研究中，高剂量的 ＭＴ发
挥作用较晚可能是因为机体对高剂量的外源性物质有一定的排斥性，需要一定的时间来接受和适应；ＭＴ提高产
奶量的效果随剂量的增加依次降低可能是受到试验期长度的局限，因为高剂量 ＭＴ发挥作用较晚，因此在试验
结束时还没有完全发挥出作用。
３．２　ＭＴ对奶牛犎犛犘７０基因表达的影响
有研究发现，犎犛犘的合成在细胞应激时会增加，而其他蛋白的合成则减少，并认为 犎犛犘 ｍＲＮＡ优先翻译
是因为细胞内存在识别 犎犛犘 ｍＲＮＡ５′前导区特异结构的系统，可以选择性地将其翻译出来［２４］；Ｗａｎｇ和Ｅ
８４２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．４
ｄｅｎｓ［２５］通过培养牛、羊、马和鸡的淋巴细胞发现，犎犛犘７０和 犎犛犘９０在热应激条件下的表达显著增加。犎犛犘７０
可以维持细胞内的稳态，以分子伴侣的形式调节其他蛋白质的代谢，犎犛犘７０家族在细胞内的高表达或数量的增
多可以改善细胞的生存能力，提高热应激耐受力。当机体受到热应激时，犎犛犘７０的表达水平一般会立即提高，以
保护组织细胞免受氧化应激损伤。ＭＴ和犎犛犘７０作为２种重要的抗应激蛋白，一般在机体内的表达呈明显的
正相关关系，两者之间相互作用，共同增强细胞对各种损害的耐受程度［２６］。本研究中，各试验组奶牛体内
犎犛犘７０基因的表达水平在注射 ＭＴ后均立刻提高，且平均值比对照组分别提高了１９．００％，５７．００％，１３０．００％
和１７．００％，说明外源性 ＭＴ可能通过抗氧化途径进一步激活了犎犛犘７０基因的表达，从而达到更好缓解奶牛热
应激的目的，且存在明显的剂量效应。其中，Ｄ组的水平明显好于其他组，表明３２．０ｍｇ的 ＭＴ注射量对于提高
犎犛犘７０基因的表达是最为有利的；而Ｅ组的水平与Ｄ组相比又陡然下降，这可能是因为Ｅ组外源性ＭＴ的注射
剂量过高，使动物机体由于排斥性等问题不能完全的将其利用，致使其效应反不如注射剂量稍低的Ｄ组。
３．３　ＭＴ对奶牛犅犮犾２、犅犪狓和狆５３基因表达的影响
本研究之所以探索 ＭＴ对奶牛血淋巴细胞犅犮犾２、犅犪狓和狆５３基因表达水平的影响，是基于 ＭＴ及细胞凋亡
基因对机体抗热应激的重要性。犅犮犾２是动物机体内重要的抗凋亡基因，能够有效延长细胞周期［２７］；犅犪狓属于
犅犮犾２家族，通过与犅犮犾２形成二聚体抑制犅犮犾２的功能，从而促进细胞凋亡；狆５３调控一些仅有ＢＨ３区域的蛋
白，作为犅犪狓的上游调控基因，诱导细胞凋亡的功能十分显著［２８，２９］。狆５３作为促细胞凋亡因子，其高表达能上调
犅犪狓的表达和减少犅犮犾２的表达，促进细胞凋亡；而犅犮犾２又能抑制狆５３介导的细胞凋亡。当狆５３基因失活时，
引起犅犮犾２家族基因调控失衡，凋亡抑制基因犅犮犾２的表达水平升高，导致靶细胞不易诱发细胞凋亡［３０］，因而
狆５３与犅犮犾２家族基因的调控作用是相互联系的。热应激能增加 ＨＳＰ的释放而增加机体免疫力，抑制细胞凋
亡，犎犛犘７０和犎犛犘９０通过与狆５３形成复合体来阻碍狆５３进入细胞核，从信号传导途径上抑制了细胞凋亡［３１］。
孙忠东等［３２］研究表明，ＭＴ的高表达可以抑制心肌细胞凋亡，犅犮犾２表达增多同时犅犪狓和Ｆａｓ表达明显减少；
Ｓｈｉｍｏｄａ等［３３］也曾提出 ＭＴ是细胞凋亡的抑制剂。本研究中，各剂量的 ＭＴ均使犅犮犾２基因的表达水平明显升
高，基本上与犎犛犘７０基因表达水平升高的趋势相一致，其中２４．０ｍｇ剂量组达到显著水平；在犅犮犾２基因表达水
平升高的同时，犅犪狓和狆５３基因的表达水平也呈现下降的趋势，说明外源性 ＭＴ能通过增加犎犛犘７０的表达来抑
制狆５３基因的促凋亡功能。但Ｂ组在试验期第１４天和Ｄ组在试验期第７天狆５３基因的表达呈现出相对较高的
水平，Ｂ组可能是因为外源性 ＭＴ剂量不够，而Ｄ组则可能是由于试验前期 ＭＴ要大量清除氧化自由基，促进细
胞凋亡，加速修复热应激所致细胞损伤，因而促进了狆５３基因过表达，试验后期奶牛应激趋于平稳，细胞应激敏
感性降低，为维持机体稳定代谢，抑制细胞凋亡，狆５３基因的表达水平逐步降低。
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０５２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．４
犈犳犳犲犮狋狊狅犳犿犲狋犪犾狅狋犺犻狅狀犲犻狀狅狀犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狅犳犾狔犿狆犺狅犮狔狋犲犪狆狅狆狋狅狊犻狊犵犲狀犲狊犪狀犱狋犺犲
犎犛犘７０犵犲狀犲狅犳犱犪犻狉狔犮犪狋狋犾犲狌狀犱犲狉犺犲犪狋狊狋狉犲狊狊
ＬＵＯＪｉａｊｉｅ１，ＷＵＺｏｎｇｍｉｎｇ１，ＺＨＡＮＧＢｉｎ１，ＬＩＬｉｌｉ２，ＷＵＬｉｚｈｕａｎ１，
ＣＨＥＮＹｕｇｕａｎｇ１，ＸＩＡＯＤｉｎｇｆｕ１，ＢＩＸｉａｏｙａｎ１
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＨｕｎａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ４１０１２８，Ｃｈｉｎａ；
２．ＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｎｉｍａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎａｎｄＨｕｍａｎＨｅａｌｔｈａｎｄＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｇｒｏｅｃｏｌｏｇｙ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
ｏｆＳｕｂｔｒｏｐｉｃａｌＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｈａｎｇｓｈａ４１０１２５，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｅｘｏｇｅｎｏｕｓｍｅｔａｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎｏｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｇｅｎｅｓａｎｄｔｈｅ犎犛犘７０
ｇｅｎｅｏｆｄａｉｒｙｃａｔｔｌｅｕｎｄｅｒｈｅａｔｓｔｒｅｓｓｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄｗｉｔｈ２５ｌａｃｔａｔｉｎｇＣｈｉｎｅｓｅＨｏｌｓｔｅｉｎｃｏｗｓ．Ｔｈｅｙｗｅｒｅｒａｎｄｏｍ
ｌｙｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｆｉｖｅｇｒｏｕｐｓ（Ａ，Ｂ，Ｃ，ＤａｎｄＥ，ｆｉｖｅｐｅｒｇｒｏｕｐ），ａｎｄｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄｗｉｔｈ０，１６．０，２４．０，３２．０
ａｎｄ４０．０ｍｇＺｎＭＴ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｂｙｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｃｏｌｅｃｔｅｄａｔ１ｓｔ，７ｔｈａｎｄ１４ｔｈ
ｄａｙ，ａｎｄｔｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆ犎犛犘７０，犅犮犾２，犅犪狓ａｎｄ狆５３ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｉｎｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄ．Ｔｈｅｍｉｌｋ
ｙｉｅｌｄｏｆｔｈｅｃｏｗｓｉｎｇｒｏｕｐＢｗａｓｍｏｒｅｔｈａｎｔｈｏｓｅｉｎｇｒｏｕｐｓＡ，Ｃ，ＤａｎｄＥｂｙ２０．９４％ （犘＜０．０５），１５．８３％ （犘
＞０．０５），１０．９４％ （犘＞０．０５）ａｎｄ８．８５％ （犘＞０．０５），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆ犎犛犘７０ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎ
ｇｒｏｕｐＤｗａｓｍｏｒｅ（犘＜０．０５）ｔｈａｎｔｈａｔｉｎｇｒｏｕｐＡ，ｂｕｔｔｈｅｒｅｗｅｒｅｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ（犘＞０．０５）ｂｅ
ｔｗｅｅｎｇｒｏｕｐｓＡａｎｄＢ，Ｃ，ａｎｄＥ．Ｔｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆ犅犮犾２ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｇｒｏｕｐｓＢ，Ｃ，Ｄ，ａｎｄＥｗｅｒｅｍｏｒｅ
ｔｈａｎｔｈａｔｏｆｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（Ａ），ａｎｄｔｈｅｒｅｗａｓａｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（犘＜０．０５）ｂｅｔｗｅｅｎｇｒｏｕｐｓＡａｎｄＣ．
Ｔｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆ犅犪狓ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｇｒｏｕｐｓＢａｎｄＤｗｅｒｅｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎｇｒｏｕｐＡｂｙ２２．００％ （犘＞０．０５）
ａｎｄ１３．００％ （犘＞０．０５），ｗｈｉｌｅｔｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆ狆５３ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｇｒｏｕｐｓＣａｎｄＥｗｅｒｅｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎ
ｇｒｏｕｐＡｂｙ２２．００％ （犘＞０．０５）ａｎｄ３４．００％ （犘＞０．０５），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＥｘｏｇｅｎｏｕｓＺｎＭＴｃａｎｉｍｐｒｏｖｅｍｉｌｋ
ｐｒｏｄｕｃｉｎｇａｂｉｌｉｔｙａｎｄｒｅｇｕｌａｔｅｔｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆ犎犛犘７０，犅犮犾２，犅犪狓ａｎｄ狆５３ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｉｎｄａｉｒｙｃａｔｔｌｅｉｎａ
ｄｏｓｅｄｅｐｅｎｄｅｎｔｍａｎｎｅｒ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ｍｅｔａｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ；ｈｅａｔｓｔｒｅｓｓ；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｄａｉｒｙｃａｔｔｌｅ
１５２第２１卷第４期 草业学报２０１２年