全 文 ：书通过花粉管通道法导入红树总犇犖犃获得耐盐
紫花苜蓿犜０代植株及其犚犃犘犇验证
张立全，牛一丁，郝金凤，哈斯阿古拉
（内蒙古大学生命科学学院 内蒙古自治区牧草与特色作物生物技术重点实验室，内蒙古 呼和浩特０１００２１）
摘要：利用花粉管通道法将盐生植物红树总ＤＮＡ导入紫花苜蓿，共导入１３９１朵花，获得８９４粒Ｔ０ 代转化种子。
Ｔ０ 代种子种植在含有２２５ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ的 ＭＳ培养基上，获得１２株耐盐性强的植株。以供体和受体为对照，对
１２株耐盐植株进行ＲＡＰＤ分析，在５５条随机引物中有８条扩增出稳定、清晰的条带，条带的差异性表现为新增条
带、供体特异条带和受体条带丢失。以上结果初步证实外源ＤＮＡ已经整合到受体的基因组中，而且Ｔ０ 代植株耐
盐能力提高可能与外源基因的导入有关。
关键词：紫花苜蓿；红树；花粉管通道法；耐盐；ＲＡＰＤ
中图分类号：Ｓ５４１＋．１；Ｑ９４３．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１１）０３０２９２０６
土壤盐碱化是一个世界性的问题，培育抗盐转基因作物新品种，充分利用盐碱地，具有重要意义［１］。利用转
基因技术进行育种即可以有效地打破物种界限，又可达到定向改良植物的目的［２］。然而，植物的耐盐性是多种耐
盐代谢、生理过程综合表现的结果，受多个基因控制［３］。因此，培育转基因耐盐植物时，转移单个基因往往只能获
得部分耐盐性。为了获得具有应用价值的耐盐植物品种，可能需要直接转移耐盐供体基因组ＤＮＡ，花粉管通道
法（ｐｏｌｅｎｔｕｂｅｐａｔｈｗａｙ）［４］转基因技术的创建使其成为可能。利用盐生植物ＤＮＡ直接导入受体来培育耐盐植
物已有许多成功的报道。林栖凤等［５８］开展了耐盐作物分子育种研究，将海岸盐生植物红树（犚犺犻狕狅狆犺狅狉犪犪狆犻犮狌
犾犪狋犪）ＤＮＡ导入番茄（犔狔犮狅狆犲狉狊犻犮狅狀犲狊犮狌犾犲狀狋狌犿）［５］、豇豆（犞犻犵狀犪狊犲狊狇狌犻狆犲犱犪犾犻狊）［６］、茄子（犛狅犾犪狀狌犿犿犲犾狅狀犵犲狀犪）［７］、
辣椒（犆犪狆狊犻犮狌犿犪狀狀狌狌犿）［８］，获得了耐盐能力明显增强的变异后代。肖军等［９］将碱蓬（犛狌犪犲犱犪狊犪犾狊犪）总ＤＮＡ导
入番茄，获得了抗盐植株。以上研究证实直接转移供体基因组ＤＮＡ进行作物耐盐性育种是可行的。
紫花苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）是世界上栽培面积最大的优质豆科牧草［１０，１１］，而利用基因工程技术来提高苜蓿
抗寒、抗旱、耐盐碱能力以及改良其营养品质已成为苜蓿发展和研究的新趋势和重点［１２］。张改娜和贾敬芬［１３］将
豌豆清蛋白１（ＰＡ１）基因转入紫花苜蓿，结果显示转ＰＡ１基因再生植株中蛋氨酸和半胱氨酸的含量提高４倍。
Ｗｉｎｉｃｏｖ和Ｂａｓｔｏｌａ［１４］将转录因子基因犃犳犾犻狀１导入苜蓿，超表达犃犳犾犻狀１的愈伤组织可抵抗１７１ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ的
胁迫作用。燕丽萍等［１５］对转ＢＡＤＨ基因Ｔ１ 代苜蓿的抗盐性进行了研究，结果表明转基因植株的耐盐性明显高
于对照。以上研究均是利用农杆菌介导法，而且导入的均是单一基因，有关导入基因组ＤＮＡ来培育苜蓿新品种
尚未见相关报道。
本研究利用花粉管通道法，将盐生植物红树总ＤＮＡ直接导入紫花苜蓿，对获得的Ｔ０ 代植株进行耐盐性筛
选和随机扩增多态性ＤＮＡ（ｒａｎｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ，ＲＡＰＤ）分子鉴定，旨在为紫花苜蓿耐盐育种提
供新的种质材料。
１ 材料与方法
１．１ 材料
供体：盐生植物红树采自深圳市红树海滨生态公园。
２９２－２９７
２０１１年６月
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
第２０卷 第３期
Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．３
收稿日期：２０１００５１０；改回日期：２０１００８１１
基金项目：国家科技支撑计划子课题（２００８ＢＡＤＢ３Ｂ０１０２），内蒙古自然科学基金项目（２００６０７０１０５０３）和内蒙古大学“５１３人才计划”科研项目
资助。
作者简介：张立全（１９７８），男，内蒙古锡盟人，实验师，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｌｉｑｕａｎ４３０＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｈａｓｉｎｄ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
受体：紫花苜蓿阿尔冈金（Ａｌｇｏｎｇｕｉｎ）品种，种子由中国农业科学院草原研究所于林清研究员提供，２００５年
种植于内蒙古大学生命科学学院花房试验田。
１．２ 方法
１．２．１ 外源ＤＮＡ的导入 十六烷基三甲基溴化铵（ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ，ＣＴＡＢ）法［１６］提取红树
总ＤＮＡ，用ＴＥ缓冲液（１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ，１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）回溶，０．１×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ：１５０ｍｍｏｌ／Ｌ氯
化钠，１５ｍｍｏｌ／Ｌ柠檬酸钠）稀释至终浓度为２５０ｎｇ／μＬ，－２０℃冻存备用。２００７年６月和２００８年６月连续２年
的盛花期，在晴天上午８时选择当天新开放的花朵，人工辅助异花授粉。授粉后２４ｈ时切去１／２柱头，用微量进
样器在柱头切口处滴加５μＬ红树ＤＮＡ溶液，共导入１３９１朵，按常规方法进行栽培管理，荚果成熟时采摘收集
Ｔ０ 代转化种子。
１．２．２ Ｔ０ 代植株的盐胁迫筛选 取未转基因种子，砂纸轻轻打磨，７０％酒精表面消毒１０ｍｉｎ后，０．１％的升汞
消毒１０ｍｉｎ，无菌水冲洗４～５次，播种在ＮａＣｌ浓度为０，５０，７５，１００，１２５，１５０，１７５，２００，２２５和２５０ｍｍｏｌ／Ｌ的
ＭＳ培养基上，每个培养皿播种２０粒种子，重复３次。培养２周后，统计发芽率。取Ｔ０ 代转化种子，表面消毒后
种植在含２２５ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ的 ＭＳ培养基上，培养２周后，将正常发芽且生长主根和真叶的植株移栽至不含
ＮａＣｌ的 ＭＳ培养基上，培养３周，移栽至花盆，获得耐盐Ｔ０ 代植株。
１．２．３ 耐盐性Ｔ０ 代植株ＲＡＰＤ分析 取耐盐性Ｔ０ 代植株叶片，采用十二烷基硫酸钠（ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌ
ｐｈａｔｅ，ＳＤＳ）法提取ＤＮＡ［１７］。选用上海生工生物工程公司Ｓ编号的随机引物５５条，以红树ＤＮＡ和未转化紫花
苜蓿ＤＮＡ为模板，选出扩增产物清晰、稳定的引物，对耐盐性Ｔ０ 代植株ＤＮＡ样品进行ＲＡＰＤ分析。ＰＣＲ反应
体系２５μＬ：１０×缓冲液２．５μＬ，ＭｇＣｌ２（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）２．０μＬ，ｄＮＴＰ（各２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）２．０μＬ，引物（５ｐｍｏｌ／μＬ）
２．０μＬ，ＤＮＡ模板１００ｎｇ，Ｔａｑ酶（５Ｕ／μＬ）０．３μＬ，补蒸馏水至２５μＬ。ＰＣＲ反应条件：９５℃预变性５ｍｉｎ；９５℃
变性１ｍｉｎ，３６℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸２ｍｉｎ，４５个循环；７２℃延伸７ｍｉｎ。ＰＣＲ产物在３．０％的琼脂糖凝胶上进
行电泳分析，溴化乙锭染色后用凝胶成像仪观察结果并拍照。试验设２次重复。
２ 结果与分析
２．１ Ｔ０ 代种子的获得
２００７和２００８年２年共导入１３９１朵花，获得荚果４４５个，收集饱满种子８９４粒，结荚率为３２．０％，结籽率为
２．０１粒／荚。
２．２ Ｔ０ 代植株耐盐性筛选
未转基因种子在含０，５０，７５，１００，１２５，１５０，１７５，２００，２２５，２５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ的 ＭＳ培养基上种子发芽率分
别为９５．０％（图１Ａ），９０．０％，８５．０％，７０．０％，４７．５％，３０．０％，２２．５％，１２．５％，０（图１Ｂ），０，即２２５ｍｍｏｌ／Ｌ的
ＮａＣｌ浓度是筛选耐盐性种子的适合浓度。
图１ ２２５犿犿狅犾／犔犖犪犆犾筛选犜０ 代植株
犉犻犵．１ 犜０狊犲犲犱犾犻狀犵狊狊犲犾犲犮狋犲犱犫狔２２５犿犿狅犾／犔犖犪犆犾
Ａ：未转基因种子在含０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ的 ＭＳ培养基上发芽 ＵｎｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｓｅｅｄｓｇｅｒｍｉｎａｔｅｄｉｎＭＳｗｉｔｈ０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ；Ｂ：未转基因种子在含
２２５ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ的 ＭＳ培养基上发芽 ＵｎｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｓｅｅｄｓｇｅｒｍｉｎａｔｅｄｉｎＭＳｗｉｔｈ２２５ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ；Ｃ：Ｔ０代种子在含２２５ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ的 ＭＳ
培养基上发芽 Ｔ０ｓｅｅｄｓｇｅｒｍｉｎａｔｅｄｉｎＭＳｗｉｔｈ２２５ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ
３９２第２０卷第３期 草业学报２０１１年
将收获的８９４粒Ｔ０ 代种子播种在含２２５ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ的 ＭＳ培养基上。培养２周后，有１２粒正常发芽，
且长有发育良好的真叶、主根和侧根（图１Ｃ）。移栽至不含ＮａＣｌ的 ＭＳ培养基上，培养３周，移栽至花盆，获得耐
盐性Ｔ０ 代植株，编号分别为：Ｍｓｒａ１～Ｍｓｒａ１２。
２．３ ＲＡＰＤ分析
选用５５条 ＲＡＰＤ 引物对供体和受体基因组
ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，筛选得到清晰扩增产物、重复性
好的８条引物（表１）。利用选定的８条引物对１２株
Ｔ０代植株进行ＲＡＰＤ分析，同时以供体ＤＮＡ和受体
ＤＮＡ作对照。观测所有的扩增电泳条带，８条引物扩
增出３６条条带，扩增产物分子量为０．１７～２．５０ｋｂ（图
２）。多态性主要表现为供体和受体均没有的新增条
带、供体特异条带、受体条带丢失３种情况（表２）。
表１ 犚犃犘犇引物序列
犜犪犫犾犲１ 犛犲狇狌犲狀犮犲狊狅犳犚犃犘犇狆狉犻犿犲狉狊
编号 Ｎｏ． 序列Ｓｅｑｕｅｎｃｅ 编号 Ｎｏ． 序列Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ｓ６７ ＧＴＣＣＣＧＡＣＧＡ Ｓ１７８ ＴＧＣＣＣＡＧＣＣＴ
Ｓ１０５ ＡＧＴＣＧＴＣＣＣ Ｓ１８０ ＡＡＡＧＴＧＣＧＧＣ
Ｓ１４４ ＧＴＧＡＣＡＴＧＣＣ Ｓ１９８ ＣＴＧＧＣＧＡＡＣＴ
Ｓ１５２ ＴＴＡＴＣＧＣＣＣＣ Ｓ１４０７ ＧＴＡＡＡＣＣＧＣＣ
图２ 犚犃犘犇分析图谱
犉犻犵．２ 犜犺犲狆犪狋狋犲狉狀狊狅犳犚犃犘犇犪狀犪犾狔狊犻狊
Ｍ：ＤＬ５０００标准ＤＮＡＤＬ５０００ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；ｃｋ１：红树ＤＮＡ为模板ＤＮＡｆｒｏｍ犚．犪狆犻犮狌犾犪狋犪ａｓｔｅｍｐｌａｔｅ；ｃｋ２：未转基因苜蓿ＤＮＡ为模板ＤＮＡ
ｆｒｏｍｕｎｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｅｄ犕．狊犪狋犻狏犪ａｓｔｅｍｐｌａｔｅ；１～１２：１２株Ｔ０代植株ＤＮＡ为模板 ＤＮＡｆｒｏｍ１２Ｔ０ｓｅｅｄｌｉｎｇｓａｓｔｅｍｐｌａｔｅ
所获得的１２株植株均有大小不等的供体特异条带出现（图２，表２），Ｓ１７８引物在５个植株（Ｍｓｒａ３、Ｍｓｒａ６、
Ｍｓｒａ８、Ｍｓｒａ１１、Ｍｓｒａ１２）中出现供体特异条带，大小约０．７和０．９ｋｂ。Ｓ１９８在４个植株（Ｍｓｒａ１、Ｍｓｒａ５、Ｍｓ
ｒａ６、Ｍｓｒａ１１）中均有供体特异条带的出现，大小约为０．９０ｋｂ；Ｓ１８０在植株 Ｍｓｒａ５和 Ｍｓｒａ６中均出现了２条供
体特异条带，大小约为０．５５和０．６５ｋｂ，而在植株Ｍｓｒａ２、Ｍｓｒａ４和 Ｍｓｒａ１１中也有约０．６５ｋｂ的供体特异条带
出现；Ｓ１４４在所有植株中都有约０．４５ｋｂ大小的供体特异条带。除 Ｍｓｒａ６、Ｍｓｒａ７、Ｍｓｒａ１０和 Ｍｓｒａ１１外，其
余均出现了供体和受体都没有的新增条带。Ｓ１９８在５个植株（Ｍｓｒａ３、Ｍｓｒａ４、Ｍｓｒａ５、Ｍｓｒａ１１、Ｍｓｒａ１２）中出
现了新增条带，而有４个引物（Ｓ６７、Ｓ１０５、Ｓ１８０、Ｓ１４４）在植株 Ｍｓｒａ２中出现了新增条带。同时，各植株均有受体
条带丢失现象，其中引物Ｓ１７８在所有转化植株中都丢失约１．２０ｋｂ的受体条带，Ｓ１４０７在各转化植株中的受体
条带丢失现象更为明显。
４９２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．３
表２ 犚犃犘犇多态性分析
犜犪犫犾犲２ 犜犺犲狆狅犾狔犿狅狉狆犺犻狊犿狊狅犳犚犃犘犇犪狀犪犾狔狊犻狊
引物Ｐｒｉｍｅｒ 项目Ｉｔｅｍ Ｍｓｒａ１ Ｍｓｒａ２ Ｍｓｒａ３ Ｍｓｒａ４ Ｍｓｒａ５ Ｍｓｒａ６ Ｍｓｒａ７ Ｍｓｒａ８ Ｍｓｒａ９ Ｍｓｒａ１０ Ｍｓｒａ１１ Ｍｓｒａ１２
Ｓ６７
Ｎ １．３０ １．３０ １．３０ １．３０
Ｄ ０．５５
０．７０
Ｒ－ １．００ １．００ １．００ １．００
Ｓ１０５
Ｎ ０．６０
Ｄ ０．５５ ０．５５ ０．５５ ０．５５ ０．５５ ０．５５
Ｒ－ ０．７５ ０．７５ ０．７５ ０．７５ ０．７５ ０．７５ ０．７５
１．００ １．００
１．２０ １．２０ １．２０ １．２０ １．２０ １．２０ １．２０
Ｓ１４４
Ｎ ０．６５
Ｄ ０．４５ ０．４５ ０．４５ ０．４５ ０．４５ ０．４５ ０．４５ ０．４５ ０．４５ ０．４５ ０．４５ ０．４５
Ｒ－
Ｓ１５２
Ｎ ０．２５ ０．２５
Ｄ ０．３０
Ｒ－ ０．４０ ０．４０ ０．４０ ０．４０ ０．４０ ０．４０ ０．４０ ０．４０ ０．４０ ０．４０
０．９０ ０．９０ ０．９０
１．３０ １．３０ １．３０ １．３０ １．３０ １．３０ １．３０
Ｓ１７８
Ｎ
Ｄ ０．７０ ０．７０ ０．７０ ０．７０
０．９０ ０．９０
Ｒ－ １．２０ １．２０ １．２０ １．２０ １．２０ １．２０ １．２０ １．２０ １．２０ １．２０ １．２０ １．２０
１．５０ １．５０ １．５０ １．５０ １．５０ １．５０ １．５０ １．５０ １．５０ １．５０ １．５０
Ｓ１８０
Ｎ ０．３０
０．４０ ０．４０
Ｄ ０．５５ ０．５５
０．６５ ０．６５ ０．６５ ０．６５ ０．６５
Ｒ－ ０．７５ ０．７５ ０．７５ ０．７５ ０．７５
Ｓ１９８
Ｎ ０．３０ ０．３０
０．５０ ０．５０
０．６０
Ｄ ０．９０ ０．９０ ０．９０ ０．９０
Ｒ－ ２．００ ２．００ ２．００ ２．００ ２．００ ２．００ ２．００ ２．００
Ｓ１４０７
Ｎ ０．２５
Ｄ ０．３０ ０．３０
０．６５
Ｒ－ ０．４０ ０．４０ ０．４０ ０．４０ ０．４０ ０．４０ ０．４０ ０．４０ ０．４０ ０．４０ ０．４０ ０．４０
０．８５ ０．８５ ０．８５ ０．８５
１．００
１．５０ １．２０
Ｎ：新增条带；Ｄ：供体特异条带；Ｒ－：受体丢失条带；单位：ｋｂ。
Ｎ：Ｎｅｗｃｏｍｅｒ；Ｄ：ｓｐｅｃｉｆｉｃｂａｎｄｏｆｄｏｎｏｒ；Ｒ：ｄｅｌｅｔｅｄｂａｎｄｏｆｒｅｃｅｐｔｏｒ；Ｕｎｉｔ：ｋｂ．
５９２第２０卷第３期 草业学报２０１１年
３ 讨论
本研究以红树总ＤＮＡ为供体，利用花粉管通道法获得了紫花苜蓿耐盐新种质，在２２５ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ胁迫条
件下，获得１２株正常生长的植株，而未转基因种子在２２５ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ胁迫时，不能正常发芽，表明已获得了比
对照耐盐性显著增强的Ｔ０ 代植株。
以ＰＣＲ为基础的ＲＡＰＤ技术可以检测基因组上的微小差异［１８］，因此，ＲＡＰＤ技术已成为验证外源ＤＮＡ是
否导入受体的有效手段，并有许多研究得到了证实［８，１９，２０］。本研究ＲＡＰＤ结果显示，１２个Ｔ０ 代耐盐植株大多数
条带与受体一致，但也明显出现有供体的特异条带，表明已有外源ＤＮＡ导入并整合到受体基因组中。由于外源
ＤＮＡ的导入并整合在受体基因组中，导致了后代基因组ＤＮＡ在一级结构上发生改变，可能会改变导入后代基
因组某些片段的引物结合位点，从而会导致新的ＤＮＡ条带出现或受体原有条带丢失。这些结果表明供体红树
ＤＮＡ已整合在所获得的１２株耐盐植株基因组中。
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６９２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．３
犘狉狅犱狌犮狋犻狅狀犪狀犱犚犃犘犇狏犲狉犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犜０狊犪犾狋狋狅犾犲狉犪狀狋犪犾犳犪犾犳犪犻狀狋狉狅犱狌犮犻狀犵狋犺犲狋狅狋犪犾犇犖犃
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ＺＨＡＮＧＬｉｑｕａｎ，ＮＩＵＹｉｄｉｎｇ，ＨＡＯＪｉｎｆｅｎｇ，ＨＡＳＩＡｇｕｌａ
（ＣｏｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆ
Ｈｅｒｂａｇｅ＆ＥｎｄｅｍｉｃＣｒｏｐＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈｏｈｈｏｔ０１００２１，Ｃｈｉｎａ）
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ｔｈｅｐｏｌｅｎｔｕｂｅｐａｔｈｗａｙ．Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，１３９１ｆｌｏｗｅｒｓｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄａｎｄ８９４ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄＴ０ｓｅｅｄｓｗｅｒｅｈａｒｖｅｓ
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７９２第２０卷第３期 草业学报２０１１年