全 文 ：林业科学研究!"#$%!"&"#$&# &+
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!!文章编号!$##$($)*&""#$%##(#&#(#,
对两个分离自海南尖峰岭的木本豆科植物
根瘤菌菌株的多相鉴定
程!涛$!"! 焦如珍$!"!! 高俊莲
"$8中国林业科学研究院林业研究所! 北京!$###*$( "8国家林业局林木培育重点实验室! 北京!$###*$(
8北京市农林科学研究院生物技术研究中心! 北京!$###*,#
收稿日期$ "#$)(#%($)
基金项目$ *)& 项目""#$()(%)#(林业科技推广项目","#$"-& 号#
作者简介$ 程!涛!男!福建宁德人!硕士研究生!主要从事豆科植物根瘤菌研究!9A?6R@2:"#"#7A:@123489:1
!
通讯作者$V32:OZA7$"+89:1
摘要!对分离自海南尖峰岭自然保护区木本豆科植物的 " 个根瘤菌菌株 STU"##&% 和 STU"##&)% 进行了鉴定+ 这
两个菌株的 $+C OEJB序列同模式菌株 *6L"I6=BB6J="7$7%$--gBg)$"%$D的相似度分别为 *&8"&I和 *&8%$I+
对这两个菌株进行全细胞脂肪酸组分和全细胞醌组分的分析结果表明!菌株 STU"##&% 和 STU"##&)% 在组分上与
模式菌株较为一致!但在含量上稍有差异+ STU"##&% 和 STU"##&)% 这两个菌株的 EJBPy-1:4I 含量分别为
+8+&I和 +#8%+I!介于根瘤菌Py-1:4I含量范围"%,I +%I#之内+ 这两个菌株的看家基因 (&D\.>J74.#$).
和#D"Z!不同于模式菌株!而独立聚成一个分支+ 研究结果表明!菌株 STU"##&% 和 STU"##&)% 可能为根瘤菌属
*6L"I6=B中的新种+
关键词!根瘤菌($+C OEJB(全细胞脂肪酸组分(全细胞醌组分(看家基因(EJBPy-1:4I 含量
中图分类号!C,$)L 文献标识码!B
0#$145%"/!),(&7/%&#(#7QB# =1$>03$7(*&3%("73#2N##)1 Y,+.2,"(
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D
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A,1 B#3)"$ *6L"I6=B( $+C OEJB( >2@5293Q 9:1H:<3@3:6( j=36:6?9:1H:<3@3:6( _:=众所周知!豆科植物同根瘤菌之间的共生固氮
作用是土壤氮最为重要的来源,$ /- + 根瘤菌与豆科
植物.生态环境之间存在着复杂的关系!因此!在选
择豆科植物最佳匹配根瘤菌时!应根据种植地的生
第 期 程!涛等$对两个分离自海南尖峰岭的木本豆科植物根瘤菌菌株的多相鉴定
态环境和宿主植物两方面因素选择合适的根瘤菌+
对木本豆科植物根瘤菌的分离.筛选及鉴定是木本
豆科植物高效固氮研究的基础!同时也是科学认识
根瘤菌和宿主协同进化.固氮生理.固氮遗传以及微
生物与高等植物之间的分子对话机制研究的基
础,)- + 目前!世界上已知豆科植物有约 ,%# 属和近
" 万个种!但人们只对其中 #8I #8%I的豆科植
物进行过共生关系研究!表明根瘤菌的资源调查及
分类研究还存在明显不足+ 另外!对根瘤菌的研究
多集中在重要农作物!如大豆.田菁.苜蓿.花生和紫
云英等如草本豆科植物!而对乔木.灌木.半灌木状
的木本豆科植物"占总种数的近乎一半#根瘤菌的
研究则较少+ 木本豆科植物生长环境的广泛多样
性!也决定了其共生固氮菌也具有广泛的生物多样
性特点+ 近些年来!随着根瘤菌宿主研究范围的不
断扩大和多相分类技术的应用!根瘤菌的分类研究
突飞猛进!不断有新属和新种报道+ 据预测!根瘤菌
的种类数量与豆科植物种的数量"$& ### 种#应该
一样多,)- + 在我国!对根瘤菌种质资源的开发利用
研究总体上来讲很有限!而且侧重于农业.牧业等!
缺少对木本豆科植物根瘤菌的系统研究,%- + 因此!
寻找和培育优良高效和抗逆性强的根瘤固氮菌株显
得异常重要,+- +
本文采用表型特征观察.细胞组分分析以及基
因序列分析的方法对分离自海南尖峰岭的两株木本
豆科植物根瘤菌进行了鉴定!为深入开展根瘤菌高
效利用研究提供理论基础+
$!材料与方法
C8CD试验材料
$8$8$!主要仪器与试剂!U:O12-42<<
*
B" 型超净
工作台.NS_("%#B型生化培养箱._-(DF$$.(% 型
架盘药物天平. N`(#"# 型 CBJn\高压灭菌锅.
H_"$$_BJJB酸度计.C3R12 /$&M高速冷冻离心
机.B.T型 F-S仪.CA?6?OR5.349:4:OE_o(#" 型恒
温摇床.电泳仪.e34G?O### 型凝胶成像系统.北京
鼎国生物技术有限公司 ge("%) 暗箱式紫外透射
仪.\A2=
移液器.浊度仪.控温培养箱等+
$8$8"!供试菌株!从海南尖峰岭国家自然保护区
海拔 &## 1处采集木本豆科植物的根瘤!并从中分
离纯化到一批根瘤菌+ 本试验只对华楹 ".JI6L6(
)*67$7%6%#根瘤和葫芦茶"+(>$76#6%( %6)$#(#6(#根瘤处
获得的两个菌株STU"##&% 和 STU"##&)% 进行种类
鉴定+
C8FD试验方法
$8"8$!形态特征观察!通过平板菌落法对菌落进
行表征观察!观察和记录菌落的大小.形状.凹凸.边
缘.硬度以及透明度等特征+ 采用革兰氏染色法在
显微镜下进行菌体形态观察+
$8"8"!$+C OEJB及看家基因的序列测定
$8"8"8$!供试菌株总 EJB的提取及检测$采用
D?O?>?X:OW
,,-的方法!提取根瘤菌基因组总EJB+
$8"8"8"!$+C OEJB序列扩增$选用 ",U和 $)*"S
引物! 扩增片断长度大致有 $8% WG左右+ 反应液组
成$$# fF-S.=>?O%8#
"
N! $# 11:401N
/$ 的
QJDF<$8#
"
N!通用引物 ",U和 $)*"S$# 11:40
1N
/$各 $8#
"
N!D2Y 聚合酶 % g0
"
N
/$
#8%
"
N!模板
EJB$8#
"
N!补加超纯水至总体积 %#8#
"
N+ 扩增
反应在B.T/F-S仪上进行,& /*- + F-S反应程序$
*%b预变性 % 136!*)b 变性 $ 136!%%b退火 $
136!,"b 延伸 $8% 136!# 个循环!,"b终延伸
$# 136+
$8"8"8!看家基因扩增$选用#D"Z.#$)..>J74和 (&0
D\四个基因的引物分别为$ #D"Z "#,#UK#D"Z
*)*S.#$).)$UK#$).+)#S.>J74$"UK>J74+&*S和
(&D\"%%UK(&D\,&"S!这四个基因扩增片断长度在
%# GH &&# GH 之间+ 反应体系及程序同 $+C OE(
JB序列扩增相似+
$8"8"8)!$+C OEJB和看家基因扩增产物的检测及
序列分析$采用 #8&I $8"I 浓度的琼脂糖凝胶!
对基因扩增产物进行检测+ 将有条带的 F-S扩增
产物样品送交华大基因进行测序+ 将获得的序列采
用-:6@3R0;HO?<<软件进行拼接!拼接结果通过 J-(
.T网站进行比对!最后的结果通过 ?`R2%8$ 和
EJB126软件构建系统发育树和相似性矩阵表+
$8"8!细胞组分测定
$8"88$!细胞脂肪酸和细胞醌型组分测定$脂肪酸
的提取方法参照 C2<将获得的样品送交北京市农林科学院农业生物技术
研究中心!借助气相色谱仪测定脂肪酸组分和含量+
醌的提取方法参照陈坚,$"-等的方法+ 将获得
的样品送交北京市农林科学院农业生物技术研究中
心!借助高效液相色谱仪测定醌型组分+
$8"88"!EJBPy-1:4I 含量测定
$8"88"8$!菌体的培养与收集$供试菌株经 n` B
$&
林!业!科!学!研!究 第 "& 卷
平板活化后!接入 "%# 1Nn` 液体培养基!"&b摇
床振荡培养至对数生长后期+ 取菌液于无菌的 %#
1N离心管中!& ### OH1离心 $# 136 收集菌体+ 用
$ fD0C 缓冲液离心洗涤菌体 次! /"#b保存
备用+
$8"88"8"!基因组总 EJB的提取$基因组总 EJB
的提取参照 2`O1=O,$-和 ]:A6<:6,$)-的方法+ 2
B
值
的测定采用热变性温度法!主要参考刘天岩,$$-和
E?4?5
,$%-的方法+ 借助仪器测得供试菌株的2
B
值后
代入EJBPy-1:4I含量计算公式!Py-1:4Il
%$8" y"8#& "2
B
"?# /2
B
"##!其中$2
B
"?#表示待
测菌株的2
B
值!2
B
"#表示 @%)*$#6)*6( )"J6M($" 的
2
B
值+
"!结果与分析
F8CD形态特征
供试菌株 STU"##&% 和 STU"##&)% 在 n` B培
养基上生长的菌落形态为透明或半透明状!颜色为
白色或乳白色!表面凸起!边缘光滑!培养 天后的
菌落直径 " % 11+ 革兰氏染色呈红色!为 P/菌!
小杆状+
FEFDCP*3G-6序列分析
菌株 STU"##&% 同模式菌株 *6L"I6=B B6J=0
"7$7%$<@O236 --.Bg)$"%$
D
.FB=J&6*"%D6&6=B<@O236
--.Bg&)#
D
.F)(J6(7G#($<@O236 --P0%").F
B(H$7%$<@O236 --P0%"+.F*(67(7$7%$<@O236 T++.F
W(>=(#6%<@O236 --P0%"% 和F&#"D6)6-TBD&** 的相
似性分别为 *&8%I. *&8)I. *&8#I. *,8+I.
*,L&I.*&8"I和 *,8$I!相似性大致在 *&I左
右+ 而菌株STU"##&)% 同上七株模式菌株的前六个
模式菌株的相似性分别为 *,8"I.*,8I.*,8#I.
*+8,I.*+8&I和 *,8"I!相似性大致在 *,I左右!
并且同模式菌株 FB(H$7%$<@O236 --P0%"+ 和 F
*(67(7$7%$<@O236 T++ 的相似度都低于 *,I!而同模
式菌株 FB=J&6*"%D6&6=B<@O236 --.Bg&)#$D的相
似性最高!但亦即只有 *,8I的相似性+ 相似性矩
阵表见表 $+ 系统发育树见图 $!模式菌株的 J-.T
序列登陆号列于菌株名称后+
表 CD菌株@!:F[[OHJ 和@!:F[[OIJ 的 CP*3G-6相似性矩阵表
菌株编号 $ " ) % + , &
--.Bgz)$"%$
2
$##I
--.Bgz&)#$
2
**8&I $##I
--P0z%") **8)I **8+I $##I
--P0z%"% **8)I **8I **8%I $##I
--P0z%"+ **8+I **8)I **8&I **8+I $##I
T++ **8&I **8*I **8%I **8I **8)I $##I
STU"##&% *&8%I *&8)I *&8#I *,8+I *,8&I *&8"I $##I
STU"##&)% *,8"I *,8I *,8#I *+8,I *+8&I *,8"I *+8)I $##I
图 $!基于 $+C OEJB序列的菌株STU"##&% 和STU"##&)% 与模式菌株的系统发育树
F8HD看家基因的序列分析
本研究对根瘤菌菌株 STU"##&% 和 STU"##&)%
的 ) 个看家基因 (&D\.>J74.#$).和#D"Z进行了F-S
扩增与序列测定!将序列提交至P?6.26W数据库!参
比菌株的序列引自 P?6.26W 数据库!其序列号亦列
于菌株名称之后+ ) 个看家基因的系统发育树分别
见于图 "..) 和 %+ 从四个不同看家基因的系统发
育树可以看出!菌株 STU"##&% 和菌株 STU"##&)%
"&
第 期 程!涛等$对两个分离自海南尖峰岭的木本豆科植物根瘤菌菌株的多相鉴定
的相似性较高!并且独立于模式菌株而成一支!说明
在看家基因方面!这两个菌株不同于模式菌株+ 而
且从这 ) 个看家基因系统发育树可以发现!这两个
菌株与模式菌株的相似性相对较低!分属不同类群+
表明菌株STU"##&% 和STU"##&)% 与相关模式菌株
的亲缘关系较远!为不同种+
图 "!基于 (&D\基因序列的菌株STU"##&% 和STU"##&)% 的 N`系统发育树
图 !基于 >J74基因序列的菌株STU"##&% 和STU"##&)% 的 N`系统发育树
图 )!基于#$).基因序列的菌株STU"##&% 和STU"##&)% 与模式菌株的 N`系统发育树
图 %!基于#D"Z基因序列的菌株STU"##&% 和STU"##&)% 与模式菌株的 N`系统发育树
将 (&D\.>J74.#$).和 #D"Z四个看家基因的序 列按顺序合并!构建的 N`系统发育树表明!菌株
&
林!业!科!学!研!究 第 "& 卷
STU"##&% 和 STU"##&)% 聚在一起!与模式菌株不
在同一分支"图 +#+ 从 N`图上的自展值可以看
出!两株菌株同模式菌株的差别较大+
图 +!基于 ) 个看家基因合的菌株STU"##&% 和STU"##&)% 的 N`系统发育树
F8ID细胞脂肪酸组分分析
对菌株STU"##&% 和STU"##&)% 的全细胞脂肪
酸组分测定结果见表 "+ 菌株STU"##&% 含有 ") 种
脂肪酸!菌株STU"##&)% 含有 " 种脂肪酸+ 它们主
要由 $$ 种脂肪酸组分构成+ 菌株 STU"##&% 和菌
株STU"##&)% 与三株模式菌株的成分基本一致!但
少量成分的含量不同+ 脂肪酸组分分析结果表明!
菌株 STU"##&% 和 STU"##&)% 属于根瘤菌属 *6L"0
I6=B!但不同于已知种类+
表 FD菌株@!:F[[OHJ 和@!:F[[OIJ 与参比菌株的脂肪酸成分
脂肪酸
苜蓿中华根瘤
--gBg)$"%$
2
相思根瘤菌
--.Bg&)#$
2
海南根瘤菌
--.Bg%,#$%
2
STU"##&)% STU"##&%
C=1T6 U?2@=O?" #8%) #8)" #8+ #8+"
$#$# \_ #8,& #8+
$"$$ BD$$ /$" #8$+
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)&
第 期 程!涛等$对两个分离自海南尖峰岭的木本豆科植物根瘤菌菌株的多相鉴定
F8JD细胞醌型组分分析
通过对菌株STU"##&% 和 STU"##&)% 及 $ 株模
式菌株的醌类测定"图 ,.&.*!表 #!发现这 " 个菌
株含有的醌类成分与模式菌株 *6L"I6=BB6J="7$7%$
--gBg)$"%$D一致!主要为 j$# 型!与3伯杰氏细
菌系统与发育学手册4报道的结果一致+ 但其S>值
却存在一定的差异!表明它们之间存在一定的差别+
图 ,!菌株STU"##&% 醌组分高效液相色谱峰图
图 &!菌株STU"##&)% 醌组分高效液相色谱峰图
表 HD菌株@!:F[[OHJ 和@!:F[[OIJ 醌组分的
高效液相色谱相关信息
菌株 培养温度 参考醌型 S> 保留时间K136
STU"##&% "&b j$# #8$, $)8*"#
STU"##&)% "&b j$# #8$+ $)8&&&
SA3Z:G3=1134=:6?6--gBg)$"%$D
"&b j$# #8"$ $)8*+$
FEPDG-69\82#$] 含量分析
以 @F)"J6M$" 菌株的 EJB作参照!测定菌株
STU"##&% 和STU"##&)% 的EJB样品+ 经公式计算
得出菌株 STU"##&% 和 STU"##&)% 的 EJBPy-
1:4I含量分别为 +8+&I和 +#8%+I!属于根瘤菌
属的EJBPy-1:4I含量 %,I +%I的范围之
内!表明这两个菌株属于根瘤菌属"*6L"I6=B#+
!结论与讨论
本研究通过对两个分离自海南省尖峰岭的木本
豆植物根瘤菌菌株的形态特征观察.革兰氏染色.
$+C OEJB序列和 ) 个看家基因分析.全细胞脂肪酸
组分和醌组分分析.以及 EJBPy-1:4I 含量分
%&
林!业!科!学!研!究 第 "& 卷
图 *!模式菌株SA3Z:G3=1134=:6?6析!证明菌株 STU"##&% 和 STU"##&)% 属于根瘤菌
属!但不同于已有报道的种类+
两株菌在 n` B培养基上生长的菌落形态.革兰
氏染色的结果都和根瘤菌属菌株的特征相符+ $+C
OEJB序列的序列比对结果说明!菌株STU"##&% 和
STU"##&)% 同模式菌株的相似度都在 *,I以上!说
明两株菌株属于根瘤菌属+ 四个看家基因的序列分
析结果均表明!菌株 STU"##&% 和 STU"##&)% 聚成
一支!同模式菌株的不在一个分支上且自展值较小+
将看家基因依次合并的多位点序列分析结果亦显示
出独立于模式菌株而成一支的结果!说明两菌株可
能是根瘤菌属的新种+ 全细胞脂肪酸组分分析结果
显示两菌株同模式菌株的主要成分相同!仅有少量
成分和某些成分的含量上存在一些差异+ 这也进一
步说明两菌株是根瘤菌属内的菌株!更倾向属于新
种+ 醌组分分析结果表明!两菌株的醌型是 j$#!同
根瘤菌属的相一致+ 同时!两菌株的 EJBPy-
1:4I 含量亦处于根瘤菌属EJB的含量范围之内+
综上所述!菌株 STU"##&% 和 STU"##&)% 为根
瘤菌属!但不同于已有报道的种类!其确切分类地位
还有待进一步研究和确认+
参考文献!
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究!生物学通报!&",#!$ /!"##8
,%- 宁国赞8刘惠琴8马小彤8中国豆科牧草根瘤菌资源的采集保藏
及利用,]-8草地学报!$***8,""#($+% /$,"8
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草原与草坪 "##+8#"8"#8
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2<2@::4@:<@=Q5@A?R?6?@39Q3[?O<3@5:>SA3Z:G3=1R24?R2?3<:42@?Q
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R58"##$! *$"" #$ $+* /$
,&- oA= oN8g@343Z36R9A?1392426Q :OR2639>?O@343Z?OO?2<:62G4?! ?;H 4:(
O36R>O3?6Q45>?O@343Z?O<5<@?1, ]-8F=G4392@3:6 :>-A36?C93?69?! "##! "$ &*"*8
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学研究院硕士论文 "##*! #%8#$8
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/"$&8
,$)- ]:A6<:6! ]8N88EJBO?2<<:932@3:6 26Q SJBA5GO3Q3<2@3:6 :>G29@?(
O326=94?39293Q<8` ?@A:Q<36 3`9O:G3:4:R58$**%! $&! /,)8
,$%- E?4?5! ]88S??;21362@3:6 :>@A?2<<:932@3:6 G?@X??6 1?4@36RH:36@!
G=:526@Q?6<3@5!26Q 9A?13924G2Q?:;5O3G:6=94?39
293Q8]:=O624:>.29@?O3:4:R58$*,#! $#$"#$ ,& /,%)8
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