全 文 ：当归苯丙氨酸解氨酶基因片段克隆和
组织特异性表达分析
雒军１，２，王引权１，２，温随超１，李静３，张金林３，夏琦１，２
（１．甘肃中医学院药学院，甘肃 兰州７３００００；２．甘肃省高校中（藏）药化学与质量研究省级重点实验室，
甘肃 兰州７３００００；３．兰州大学草地农业科技学院，甘肃 兰州７３００２０）
摘要：苯丙氨酸解氨酶（ＰＡＬ）在高等植物苯丙烷类代谢中具有重要作用，与植物体内很多重要的次生代谢产物的
合成密切相关。当归主要药效成分阿魏酸是苯丙烷类代谢途径中的产物之一。为了探究阿魏酸生物合成和积累
的机理，本研究克隆了当归苯丙氨酸解氨酶基因（犘犃犔）部分序列，运用荧光定量ＰＣＲ方法分析该基因在当归不同
组织部位的表达差异。根据已经克隆的植物犘犃犔保守序列设计一对扩增引物，以当归叶片总 ＲＮＡ 为模板，采用
反转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）方法扩增出犘犃犔片段并连接到ｐＧＥＭＴＥａｓｙ载体上，转化大肠杆菌ＤＨ５α，阳性克隆经
ＰＣＲ检测后测序，得到一段７０６ｂｐ的序列（登录号：ＫＪ０００２５８），内含终止密码子 ＴＡＡ，编码２３２个氨基酸，与
ＧｅｎＢａｎｋ中注册的伞形科植物珊瑚菜等６个物种的犘犃犔核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性都在８０％以上；
运用ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ荧光定量ＰＣＲ方法，以当归肌动蛋白基因犃犮狋犻狀为内参基因，检测犘犃犔在当归不同组织中的表
达量，结果显示犘犃犔在叶片中表达量最高，其次是茎和根，叶片和茎中表达量分别是根中表达量的７．５和２．７倍。
关键词：当归；苯丙氨酸解氨酶基因；基因克隆；荧光定量ＰＣＲ；基因表达
中图分类号：Ｓ５６７．２３＋９；Ｑ９４３．２　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１４）０４０１３００８
犇犗犐：１０．１１６８６／ｃｙｘｂ２０１４０４１６　　
　　当归（犃狀犵犲犾犻犮犪狊犻狀犲狀狊犻狊）为伞形科当归属草本植物，以干燥根入药，具有补血活血，调经止痛，润肠通便等功
效，为临床常用药［１］。甘肃是当归主产区，年栽培面积和总产量都占全国９０％以上，当归适宜栽培在２０００～２８００
ｍ海拔的高寒阴湿地带［２］。目前对当归栽培模式、当归生理特征、药材品质和产量形成进行了许多研究，王慧珍
等［３］报道连作当归比轮作当归的挥发油含量、叶片光合色素含量和光合特性显著降低，进而导致产量和品质下
降；王田涛等［４］研究发现当归／大蒜（犃犾犾犻狌犿狊犪狋犻狏狌犿）间作能提高当归产量和优等品比率，并能降低当归麻口病
发病率；邱黛玉等［５］报道当归种苗的大小影响生长过程中当归茎叶和根部蛋白质、游离氨基酸、可溶性糖含量的
变化，进而影响成药期抽苔率，但对当归药效成分生物合成及其代谢调控的分子生物学机理尚未开展过系统研
究。
阿魏酸（ｆｅｒｕｌｉｃａｃｉｄ，ＦＡ）是当归药材中含量较高的水溶性活性成分，为《中国药典》规定的当归质量控制指
标之一［６］。现代药理研究表明，ＦＡ具有明显抗动脉粥样硬化，抗血小板凝集和血栓，清除亚硝酸盐、氧自由基、
过氧化亚硝基，抗菌消炎，抗肿瘤，抗突变，增加免疫功能等作用［７］。ＦＡ为苯丙烷代谢途径生成的中间产物之
一，其主要生物合成途径是由苯丙氨酸解氨酶（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅａｍｍｏｎｉａｌｙａｓｅ，ＰＡＬ）催化犔苯丙氨酸（犔Ｐｈｅ）生
成反式肉桂酸（狋ＣＡ），肉桂酸４羟基化酶（Ｃ４Ｈ）催化反式肉桂酸生成对香豆酸（狆Ｃｏｕｍａｒｉｃａｃｉｄ），对香豆酸
经香豆酸３羟基化酶（Ｃ３Ｈ）作用生成咖啡酸（ｃａｆｆｅｉｃａｃｉｄ），再以甲硫氨酸（犛腺苷犔 甲硫氨酸）为甲基供体，在咖
啡酸犗甲基转移酶（ＣＯＭＴ）的催化下生成阿魏酸（ＦＡ）［８９］。犘犃犔催化犔苯丙氨酸（犔Ｐｈｅ）生成反式肉桂酸
（狋ＣＡ），是苯丙烷代谢的第一步反应，也是其中的关键步骤之一［１０］。目前有多种植物的犘犃犔已经得到克隆，在
药用植物中有朝鲜当归（犃狀犵犲犾犻犮犪犵犻犵犪狊）［１１］、皱波天竺葵（犘犲犾犪狉犵狅狀犻狌犮狉犻狊狆狌犿）［１２］、金银花（犔狅狀犻犮犲狉犪犼犪狆狅狀犻
１３０－１３７
２０１４年８月
　　　草　业　学　报　　　
　　　ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ　　　
第２３卷　第４期
Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．４
收稿日期：２０１４０１０３；改回日期：２０１４０３１４
基金项目：国家自然科学基金项目（８１０６０３２７，８１２６０６１６）资助。
作者简介：雒军（１９８１），男，甘肃秦安人，硕士。Ｅｍａｉｌ：ｌｕｏｊｕｎｎｗｎｕ＠１２６．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｋｊｋｆｐｐ＠１６３．ｃｏｍ，ｊｌｚｈａｎｇ＠ｌｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
犮犪）［１３］、黄芩（犛犮狌狋犲犾犾犪狉犻犪犫犪犻犮犪犾犲狀狊犻狊）［１４］、紫草（犔犻狋犺狅狊狆犲狉犿狌犿犲狉狔狋犺狉狅狉犺犻狕狅狀）［１５］、黄芪（犃狊狋狉犪犵犪犾狌狊犿犲犿犫狉犪狀犪
犮犲狌狊）［１６］和丹参（犛犪犾狏犻犪犿犻犾狋犻狅狉狉犺犻狕犪）［１７］等，但尚未有当归犘犃犔研究的报道。本研究的重点在于用ＲＴ－ＰＣＲ
方法克隆当归代谢相关犘犃犔片段、进行序列分析，并运用实时荧光定量ＰＣＲ分析其在当归不同组织的特异性表
达，为进一步获得当归犘犃犔全长及其阐明ＦＡ的生物合成与制定调控策略提供理论基础。
１　材料与方法
１．１　材料
当归植株于２０１３年８月采自甘肃岷县茶埠镇试验基地（海拔２７８０ｍ，东经１０４°０６′，北纬３４°２９′）。田间挖取
当归全株，立即装入干冰泡沫箱中，于当日带至实验室后迅速用去离子水冲洗干净，并将根、茎、叶组织分离后用
液氮迅速冷冻后，保藏于－８０℃超低温冰箱，用作ＲＮＡ提取材料。大肠杆菌（犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻）ＤＨ５α菌株由本
实验室保存。
采用的分子生物学试剂主要包括：ＲＮＡ提取试剂十六烷基三甲基溴化铵（ＣＴＡＢ）、ＬｉＣｌ和聚乙烯吡咯烷酮
３６０（ＰＶＰ３６０）为美国Ｓｉｇｍａ产品，ｃＤＮＡ合成试剂盒（ＴａＫａＲａ，大连），ＴａｑＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ，美国）、
ＰＣＲ产物回收试剂盒（ＴｒａｎｓＧｅｎ，北京）、ＰＣＲ 产物克隆试剂盒（Ｐｒｏｍｅｇａ，美国），ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ（ＴｒａｎｓＧｅｎ，北
京），ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ荧光定量试剂盒（Ｐｒｏｍｅｇａ，美国），其他生化试剂均为进口或国产分析纯产品。
１．２　引物设计与合成
通过对ＧｅｎＢａｎｋ中皱波天竺葵（Ｘ８１１５９）、朝鲜当归 （ＨＭ１１４２１５）、胡萝卜（犇犪狌犮狌狊犮犪狉狅狋犪）（ＡＢ４３５６４０）和
拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）（ＮＭ＿００１２０３２９４）等植物ＰＡＬ编码基因ＣＤＳ序列进行同源比对，找出高度保守
区段，利用Ｐｒｉｍｅｒ６．０生物软件设计一对扩增引物（Ｐ１，Ｐ２），用于扩增当归犘犃犔片段。Ｐ１：５′ＧＣＴＧＡＡＣＡＧ
ＣＡＣＡＡＴＣＡＡＧＡＴＧＴ３′，Ｐ２：５′ＧＴＴＡＡＣＡＧＡＴＴＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＣ３′。
参照克隆并测序的当归ＰＡＬ片段序列，利用Ｐｒｉｍｅｒ６．０生物软件设计一对用于ＰＡＬ荧光定量ＰＣＲ检测
的特异引物（Ｐ３，Ｐ４），扩增长度为１１９ｂｐ。Ｐ３：５′ＧＴＧＴＣＡＡＣＧＧＴＧＡＧＣＴＣＣＡＴ３′，Ｐ４：５′ＧＣＡＴＣＡＡＴ
ＧＧＧＴＡＧＧＴＴＧＣＧ３′。参照当归犃犮狋犻狀片段序列［１８］，设计一对荧光定量ＰＣＲ内参基因检测的特异引物（Ｐ５，
Ｐ６），扩增长度为１０９ｂｐ。Ｐ５：５′ＴＧＧＴＡＴＴＧＴＧＣＴＧＧＡＴＴＣＴＧＧＴ３′，Ｐ６：５′ＴＧＡＧＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＧ
ＣＡＡＧＧ３′。以上所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
１．３　总ＲＮＡ的提取
当归根、茎及叶组织中总ＲＮＡ的提取参照文献［１９］方法进行，并略作修改。实验中所用玻璃容器、离心管
和去离子水在ＲＮＡ提取前均用焦炭酸二乙酯（ＤＥＰＣ）处理，以变性灭活ＲＮａｓｅ。具体操作如下：
取１ｇ材料置于含液氮和少量石英砂的研钵中充分研磨成粉末状。取约１／１０的粉末转入内含０．９ｍＬ６５℃
预热的提取缓冲液的离心管中，提取缓冲液成分包括１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＣｌ、２％ ＣＴＡＢ（ｍ／Ｖ）、２％ ＰＶＰ３６０
（ｍ／Ｖ）、３０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ、１．５ｍｏｌ／Ｌ的 ＮａＣｌ和２％ （Ｖ／Ｖ）的β巯基乙醇（βＭＥ）。充分振荡混匀后置于
６５℃水浴锅孵育２０ｍｉｎ，期间每５ｍｉｎ充分振荡１次。冷却至室温后，加等体积氯仿／异戊醇（２４∶１），剧烈振荡
３０ｓ，１１０００ｒ／ｍｉｎ、４℃离心１０ｍｉｎ。水相转入另一离心管，加约１／３体积１０ｍｏｌ／Ｌ的ＬｉＣｌ，混匀后置－２０℃冰
箱３０ｍｉｎ。１１０００ｒ／ｍｉｎ、４℃离心１０ｍｉｎ，沉淀溶解于０．５ｍＬ无ＲＮａｓｅ的去离子水，加０．５ｍＬ水饱和酚抽提
一次，再加入等体积氯仿／异戊醇（２４∶１）抽提１次，１１０００ｒ／ｍｉｎ、４℃离心１０ｍｉｎ。水相转入另一离心管，加１／１０
体积３ｍｏｌ／ＬｐＨ５．４的醋酸钠，再加１体积预冷的异丙醇，置－２０℃冰箱３０ｍｉｎ。１１０００ｒ／ｍｉｎ、４℃离心１０
ｍｉｎ，沉淀悬浮于５００μＬ无ＲＮａｓｅ的去离子水配制的７０％乙醇。１１０００ｒ／ｍｉｎ、４℃离心１０ｍｉｎ，弃去上清液，沉
淀干燥后溶于５０μＬ无ＲＮａｓｅ的去离子水中。
将提取到的总ＲＮＡ在使用和保存之前进行检测，使用分光光度计（ＴｈｅｒｍｏＢｉｏＭａｔｅ３，美国），根据吸光度
值测定所提总ＲＮＡ的纯度（Ａ２６０／Ａ２８０的值为１．８～２．０，说明ＲＮＡ无污染）及浓度；并依照测定出的ＲＮＡ浓度
确定下一步实验中合成ｃＤＮＡ所需模板的用量，未使用的ＲＮＡ保存于－８０℃超低温冰箱；采用非变性琼脂糖凝
胶电泳方法判断总ＲＮＡ的完整性。
１３１第２３卷第４期 草业学报２０１４年
１．４　ＲＴ－ＰＣＲ扩增
按照试剂盒说明书，以当归叶片总ＲＮＡ合成ｃＤＮＡ，然后以ｃＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ反应。反应体系：在
２００μＬＰＣＲ管中加入下列组分，无菌去离子水３５．８μＬ、ＭｇＣｌ２（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）５μＬ、１０×ＰＣＲ缓冲液５μＬ、ｄＮＴＰ
（２ｍｍｏｌ／Ｌ）１．２μＬ、正、反向引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）１μＬ、ｃＤＮＡ０．５μＬ和ＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μＬ）０．５μＬ，
总体积为５０μＬ。反应程序：９５℃预变性３ｍｉｎ；９５℃变性３０ｓ、５６℃退火３０ｓ、７２℃延伸６０ｓ，３０个循环；最后
７２℃延伸１０ｍｉｎ，４℃结束，ＰＣＲ扩增产物用１．５％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶－化学发光成像系统（ＢｉｏＲａｄＣＨＥ
ＭＩＤＯＣＸＲＳ，美国）检测。目的片段回收和纯化按照回收试剂盒说明书进行。
１．５　阳性克隆的筛选、鉴定及测序
ＤＮＡ片段与Ｔ载体连接体系包括：Ｔ４ＤＮＡ连接酶的２×连接缓冲液５μＬ、ｐＧＥＭＴＥａｓｙ载体０．５μＬ、纯
化的ＰＣＲ产物１．５μＬ（值以ＰＣＲ产物∶载体摩尔比１∶１估算）、Ｔ４ＤＮＡ连接酶０．８μＬ，无菌去离子水补充至
１０μＬ，４℃连接过夜。连接产物全部加入到１００μＬ置于冰上的感受态大肠杆菌ＤＨ５α细胞中，冰浴２０ｍｉｎ；
４２℃热激５０ｓ；冰浴２ｍｉｎ。加入９００μＬ平衡至室温的液体ＬＢ培养基，摇菌１．５ｈ（３７℃，１５０ｒ／ｍｉｎ）。取１００
μＬ菌液涂布于含有氨苄青霉素的ＬＢ固体培养基上，３７℃培养过夜。次日挑选单菌落，进行菌落ＰＣＲ检测，阳
性克隆接种于含氨苄青霉素的液体培养基培养（３７℃，１５０ｒ／ｍｉｎ），培养过夜后装入菌种保藏管送生工生物工程
（上海）有限公司测序。
１．６　序列的生物信息学分析
Ｂｌａｓｔ搜索在ＮＣＢＩ网站上进行，序列的比对、翻译和作图等在ＤＮＡＭＡＮ６．０生物软件上进行，序列保守区
分析在ＮＣＢＩ网站ＣｏｎｓｅｒｖｅｄＤｏｍａｉｎＤａｔａｂａｓｅ（ＣＤＤ）中进行。具体分析参照已经发表的关于基因克隆及序列
分析文献中方法进行［２０２２］。
１．７　犘犃犔在当归植株组织中的特异表达
采用实时荧光定量ＰＣＲ（ＢｉｏＲａｄＣＦＸ９６，美国）测定犘犃犔在当归植株组织中的特异表达。分别称取约０．１
ｇ当归根、茎、叶组织提取总ＲＮＡ，每个组织重复３次，然后用分光光度计测定浓度，计算并量取总ＲＮＡ约１００
ｎｇ。按试剂盒说明书进行ｃＤＮＡ的第一链合成，将ｃＤＮＡ用无菌去离子水稀释至３０μＬ后取１μＬｃＤＮＡ作为
荧光定量ＰＣＲ模板进行荧光定量ＰＣＲ，每个ｃＤＮＡ模板做３管重复。反应体系：在２００μＬＰＣＲ管中加入无菌
去离子水７．４μＬ、２×ｑＰＣＲｍｉｘ１０μＬ、正、反向引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）０．８μＬ、ｃＤＮＡ１μＬ，总体积为２０μＬ。反应程
序：９５℃预变性３ｍｉｎ；９５℃变性１５ｓ、６０℃退火３０ｓ、７２℃延伸３０ｓ，４０个循环。荧光采集时间在７２℃延伸步骤，
扩增完成后利用ＰＣＲ仪自带的程序进行熔点曲线测定。求取３个平行管的平均Ｃｔ值，采用２－△△Ｃｔ分析方法对
犘犃犔进行相对定量表达分析。
１．８　统计与分析
图１　叶片总犚犖犃非变性琼脂糖凝胶电泳
犉犻犵．１　犖狅狀犱犲狀犪狋狌狉犻狀犵犪犵狉狅狊犲犵犲犾犲犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊
狅犳狋狅狋犪犾犚犖犃犳狉狅犿犾犲犪狏犲狊
Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；ＲＮＡ：叶片总ＲＮＡＴｏｔａｌＲＮＡｆｒｏｍｌｅａｖｅｓ．　
所有数据采用ＳＰＳＳ１６．０进行统计和分析。根、
茎、叶间ＰＡＬ相对表达量差异性利用ＡＮＯＶＡ分析，
采用ＬＳＤ检验。
２　结果与分析
２．１　总ＲＮＡ的提取及检测
采用非变性琼脂糖凝胶电泳法对当归不同组织总
ＲＮＡ进行检测，结果显示，２８ＳｒＲＮＡ 和１８ＳｒＲＮＡ
条带清晰，没有其他杂质条带（图１），说明本试验提取
的叶片总 ＲＮＡ 的完整性较好；经分光光度计测定
Ａ２６０／Ａ２８０平均值为１．９８，表明总ＲＮＡ的纯度较高，可
用于ＲＴ－ＰＣＲ扩增。
２３１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．４
２．２　ＲＴ－ＰＣＲ扩增
图２　犚犜－犘犆犚产物琼脂糖凝胶电泳
犉犻犵．２　犃犵狉狅狊犲犵犲犾犲犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊狅犳犚犜－犘犆犚狆狉狅犱狌犮狋狊
Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；１：ＲＴ－ＰＣＲ产物ＲＴ－ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓ．
　
图３　阳性克隆的犘犆犚鉴定
犉犻犵．３　犘犆犚犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳狆狅狊犻狋犻狏犲犮犾狅狀犲狊
Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；１～５：克隆的ＰＣＲ产物Ｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｃｌｏｎｅｓ．
　
以当归叶片总 ＲＮＡ 反转录所得到的第一链
ｃＤＮＡ为模板，用犘犃犔扩增引物Ｐ１ 和Ｐ２ 进行ＰＣＲ
扩增。经检测，扩增产物约在７００ｂｐ处有１条亮带
（图２），与理论目的片段大小一致，推测为犘犃犔片段，
需要进一步测序鉴定。
２．３　阳性克隆的筛选、鉴定及测序
将回收纯化的目的片段连接到ｐＧＥＭＴＥａｓｙ克
隆载体上，转化大肠杆菌ＤＨ５α，从转化的平板上随机
挑取５个克隆并进行菌落ＰＣＲ扩增，经检测１号和２
号克隆扩增出大小约为７００ｂｐ的条带（图３），与ＲＴ
－ＰＣＲ结果一致，可能为阳性克隆，然后将阳性克隆
进行菌液培养并进行测序，测得一段长度为７０６ｂｐ的
序列，将该基因序列在ＮＣＢＩ网站的ＧｅｎＢａｎｋ数据库
中注册 （登录号：ＫＪ０００２５８）。
２．４　序列分析
对克隆得到的基因片段进行序列分析，其编码
２３２个氨基酸（图４）。Ｂｌａｓｔ比对结果显示，该序列与
ＮＣＢＩ基因库中６个物种的犘犃犔核苷酸序列的相似
性在８０％以上，与珊瑚菜（犌犾犲犺狀犻犪犾犻狋狋狅狉犪犾犻狊）犌犾犘犃犔
犅基因的相似性最高，为９７％，与朝鲜当归犘犃犔的相
似性为８８％ （表１），表明本研究克隆到的基因片段为
当归犘犃犔片段，将其命名为犃狊犘犃犔。将推测的当归
犘犃犔片段氨基酸序列和其他植物犘犃犔 氨基酸序列进
行多重比较（图５），结果发现完全一致的氨基酸多达
１７９个，占总氨基酸数的７７％，与珊瑚菜、皱波天竺葵、
胡萝卜、朝鲜当归、野山茶（犆犪犿犲犾犾犻犪狊犻狀犲狀狊犻狊）和金银
花氨基酸序列相似性分别达 ９９．１４％，９８．７１％，
９７．４２％，９５．２８％，８６．７０％和８４．９８％，表明克隆片段
所编码的肽段为ＰＡＬ保守区域，并将其命名为 Ａｓ
ＰＡＬ。进一步对 ＡｓＰＡＬ进行保守结构域分析，结果
显示，其包含裂解酶Ｉ类超家族 （Ｌｙａｓｅ＿ｌｉｋｅＳｕｐｅｒ
ｆａｍｉｌｙ）保守结构域（１４４）、ＰＬＮ０２４５７ 结构域（１
２２３）、ＴＩＧＲ０１２２６结构域（１２２４）和ｐｆａｍ００２２１结构
域（１７１），它们均是苯丙氨酸解氨酶的相关结构域，说
明ＡｓＰＡＬ为当归ＰＡＬ的功能区域。
表１　当归与部分植物犘犃犔片段核苷酸序列相似性比对
犜犪犫犾犲１　犛犻犿犻犾犪狉犻狋狔犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犘犃犔犳狉犪犵犿犲狀狋狀狌犮犾犲犻犮犪犮犻犱
狊犲狇狌犲狀犮犲狊犫犲狋狑犲犲狀犃．狊犻狀犲狀狊犻狊犪狀犱狅狋犺犲狉狆犾犪狀狋狊狆犲犮犻犲狊
物种名
Ｓｐｅｃｉｅｓ
相似度
Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ（％）
登录号
Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ
珊瑚菜犌犾犲犺狀犻犪犾犻狋狋狅狉犪犾犻狊 ９７ ＡＢ３７４２５８
皱波天竺葵犘犲犾犪狉犵狅狀犻狌犮狉犻狊狆狌犿 ９５ Ｘ８１１５９
胡萝卜犇犪狌犮狌狊犮犪狉狅狋犪 ９２ ＡＢ４３５６４０
朝鲜当归犃狀犵犲犾犻犮犪犵犻犵犪狊 ８８ ＨＭ１１４２１５
野山茶犆犪犿犲犾犾犻犪狊犻狀犲狀狊犻狊 ８２ ＡＹ６９４１８８
金银花犔狅狀犻犮犲狉犪犼犪狆狅狀犻犮犪 ８０ ＪＸ０６８６０１
２．５　犘犃犔在当归植株组织中的特异表达
由总ＲＮＡ的非变性琼脂糖凝胶电泳结果看出，当归根、茎及叶组织中总ＲＮＡ的２８Ｓ条带和１８Ｓ条带亮度
相当（图６），说明反转录总ＲＮＡ浓度基本相同。实时荧光定量ＰＣＲ扩增曲线显示，犃犮狋犻狀和犘犃犔 的扩增效果良
好，Ｃｔ值在２１～２８之间循环；熔点曲线分析也表明扩增曲线具有良好的特异性，表现为单一峰，没有非特异性荧
光峰，犃犮狋犻狀和犘犃犔 的熔点曲线峰值分别出现在８６℃和８５℃。将荧光定量ＰＣＲ的产物进行琼脂糖凝胶电泳检
测，结果显示扩增条带大小约为１１０ｂｐ，与目的大小一致，无引物二聚体条带（图７）。
３３１第２３卷第４期 草业学报２０１４年
图４　当归犘犃犔片段的核苷酸序列及推测的氨基酸序列
犉犻犵．４　犖狌犮犾犲犻犮犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲犪狀犱犱犲犱狌犮犲犱犪犿犻狀狅犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲狅犳犘犃犔犳狉犪犵犿犲狀狋犳狉狅犿犃．狊犻狀犲狀狊犻狊
　
图５　当归与部分植物犘犃犔片段氨基酸序列相似性多重比较
犉犻犵．５　犕狌犾狋犻狆犾犲犮狅犿狆犪狉犻狊狅狀狊狅狀犪犿犻狀狅犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲狅犳犘犃犔犳狉犪犵犿犲狀狋犫犲狋狑犲犲狀犃．狊犻狀犲狀狊犻狊犪狀犱狅狋犺犲狉狆犾犪狀狋狊狆犲犮犻犲狊
４３１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．４
　　采用２－△△Ｃｔ方法分析当归根、茎、叶组织中犘犃犔
图６　当归根、茎、叶总犚犖犃非变性琼脂糖凝胶电泳
犉犻犵．６　犖狅狀犱犲狀犪狋狌狉犻狀犵犪犵犪狉狅狊犲犵犲犾犲犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊狅犳
狋狅狋犪犾犚犖犃犳狉狅犿狉狅狅狋，狊狋犲犿犪狀犱犾犲犪犳狅犳犃．狊犻狀犲狀狊犻狊
　　　Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；１：根Ｒｏｏｔ；２：茎Ｓｔｅｍ；３：叶Ｌｅａｆ．
图７　荧光定量犘犆犚产物非变性琼脂糖凝胶电泳
犉犻犵．７　犖狅狀犱犲狀犪狋狌狉犻狀犵犪犵犪狉狅狊犲犵犲犾犲犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊狅犳
狆狉狅犱狌犮狋狊狅犳犳犾狌狅狉犲狊犮犲狀犮犲狇狌犪狀狋犻狋犪狋犻狏犲犚犜－犘犆犚
　　　Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；１～３：分别为根、茎和叶的犘犃犔产物犘犃犔ｐｒｏｄ
ｕｃｔｓｏｆｒｏｏｔ，ｓｔｅｍａｎｄｌｅａｆ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；４～６：分别为根、茎和叶的
犃犆犜产物犃犆犜ｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｒｏｏｔ，ｓｔｅｍａｎｄｌｅａｆ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
图８　犘犃犔在当归根、茎和叶中的相对表达量
犉犻犵．８　犚犲犾犪狋犻狏犲犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀犾犲狏犲犾狊狅犳犘犃犔犻狀狉狅狅狋，
狊狋犲犿犪狀犱犾犲犪犳狅犳犃．狊犻狀犲狀狊犻狊
　　　图中数值为平均值±标准差（狀＝３），不同小写字母代表显著性差异
（犘＜０．０５）。Ｖａｌｕｅｓｒｅｐｒｅｓｅｎｔｍｅａｎｓ±ＳＤ（狀＝３），ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｏｗｅｒｃａｓｅ
ｌｅｔｔｅｒｓｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（犘＜０．０５）．
相对表达量，结果显示犘犃犔在各组织中均有表达，叶
片中表达量最高，其次是茎和根，叶片和茎中表达量分
别是根表达量的７．５和２．７倍，三者间差异性显著
（犘＜０．０５）（图８）。
３　讨论
苯丙氨酸解氨酶（ＰＡＬ）催化的反应是苯丙烷类代
谢的第一步反应，其将初生代谢产物苯丙氨酸纳入到
次生代谢中，成为很多次生代谢产物的前体物质。该
酶分布比较广泛，在所有绿色植物、真菌、细菌、酵母以
及藻类中都有［２３］。本研究虽然仅扩增的是当归犘犃犔
３′端的保守区片段，但经与 ＧｅｎＢａｎｋ中的其他物种
犘犃犔序列比对发现，犃狊犘犃犔与朝鲜当归及皱波天竺
葵犘犃犔 序列同源性非常高，相似性达９２％。而与珊
瑚菜、皱波天竺葵、胡萝卜、朝鲜当归、野山茶和金银花
的同源性也达８０％以上，初步推断犃狊犘犃犔可能是当
归ＰＡＬ酶的ｃＤＮＡ片段。由 ＡｓＰＡＬ保守结构域分
析结果初步证实该序列为ＰＡＬ的保守区域，可能包含
着裂解酶Ｉ类超家族（Ｌｙａｓｅ＿Ｉ＿ｌｉｋｅＳｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）保守
结构域序列。该超家族有裂解酶Ｉ家族、组氨酸裂解
酶和苯丙氨酸裂解酶，它们催化类似的β消除反应。
这些分析结果预示着 ＡｓＰＡＬ可能是高等植物ＰＡＬ
家族的新成员，它具有较高的结构和功能保守性，这为
进一步从基因的组成成分、理化特性、亚细胞定位、功
能结构域等方面更全面而准确地揭示当归阿魏酸生物
合成的分子机理奠定了基础。
苯丙氨酸解氨酶在调控代谢途径方面具有复杂的
作用，Ｈｏｗｌｅｓ等［２４］认为，在转基因烟草（犖犻犮狅狋犻犪狀犪
狋犪犫犪犮狌犿）中犘犃犔过量表达可提高绿原酸等相关次生
代谢产物的含量，而Ｓｅｗａｌｔ等［２５］的研究表明，犘犃犔表
达抑制的转基因烟草中木质素等相关次生代谢产物含
量会减少。本研究首次从当归植株中克隆了犘犃犔，通
过非变性琼脂糖凝胶电泳分析，犘犃犔在当归叶组织中
表达量显著高于根组织，预示着当归中阿魏酸的生物
合成可能是先由叶组织合成，然后由植物传导系统将
其输送至根部积累。
本研究曾比对朝鲜当归及皱波天竺葵犘犃犔序列
设计简并引物并进行当归犘犃犔 全长的扩增，但未能
获得有效的扩增结果，这是否与当归犘犃犔在５′端具
有自身特异性有关，还需进一步研究。本研究成果为
进一步克隆方法获得当归ＰＡＬ全长，以及对阐明其在
５３１第２３卷第４期 草业学报２０１４年
当归阿魏酸生物合成途径中的功能奠定了工作基础，同时也对未来通过基因工程手段调控当归阿魏酸含量提供
理论依据。
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ｌａｓｅａｎｄｇｅｎｅｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｆｌａｖｏｎｅｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎ犛犮狌狋犲犾犾犪狉犻犪犫犪犻犮犪犾犲狀狊犻狊［Ｊ］．ＢｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，１０１（２４）：９７１５
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ｒｅｇｕｌａｔｅｄｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ犔ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅａｍｍｏｎｉａｌｙａｓｅｏｒｃｉｎｎａｍａｔｅ４ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９９７，１１５（１）：
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６３１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．４
犆犾狅狀犻狀犵犪狀犱狋犻狊狊狌犲狊狆犲犮犻犳犻犮犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狆犺犲狀狔犾犪犾犪狀犻狀犲犪犿犿狅狀犻犪犾狔犪狊犲
犵犲狀犲犳狉犪犵犿犲狀狋犻狀犃狀犵犲犾犻犮犪狊犻狀犲狀狊犻狊
ＬＵＯＪｕｎ１，２，ＷＡＮＧＹｉｎｑｕａｎ１，２，ＷＥＮＳｕｉｃｈａｏ１，ＬＩＪｉｎｇ３，ＺＨＡＮＧＪｉｎｌｉｎ３，ＸＩＡＱｉ１，２
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙｏｆＧａｎｓｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００００，Ｃｈｉｎａ；
２．ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＱｕａｌｉｔｙｆｏｒＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅｓｏｆｔｈｅＣｏｌｅｇｅｏｆ
ＧａｎｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００００，Ｃｈｉｎａ；３．ＣｏｌｅｇｅｏｆＰａｓｔｏｒａｌＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ
ａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＬａｎｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００２０，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅａｍｍｏｎｉａｌｙａｓｅ（ＰＡＬ）ｐｌａｙｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｔｈｅｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄｍｅｔａｂｏｌｉｃｐａｔｈ
ｗａｙｉｎｈｉｇｈｅｒｐｌａｎｔｓａｎｄｉｓｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｍａｊｏｒｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ．Ｆｅｒｕｌｉｃａｃｉｄ，ａｍａ
ｊｏｒａｃｔｉｖｅｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｉｎ犃狀犵犲犾犻犮犪狊犻狀犲狀狊犻狊，ｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｐｒｏｄｕｃｔｓｉｎｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄｐａｔｈｗａｙ．Ｉｎ
ｔｈｉｓｐａｐｅｒ，ｔｈｅｃＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｏｆｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅａｍｍｏｎｉａｌｙａｓｅｇｅｎｅ（犘犃犔）ｗａｓｃｌｏｎｅｄａｎｄｉｔｓｔｉｓｓｕｅｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｂｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｆｏｒｅｘｐｌｏｒｉｎｇｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄａｃ
ｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｆｅｒｕｌｉｃａｃｉｄｉｎ犃狀犵犲犾犻犮犪狊犻狀犲狀狊犻狊．Ａｐａｉｒｏｆａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｉｍｅｒｓｗａｓｄｅｓｉｇｎｅｄａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅ
ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅｃｌｏｎｅｄ犘犃犔．ＥｘｔｒａｃｔｉｎｇｔｈｅｔｏｔａｌＲＮＡｆｒｏｍｔｈｅｌｅａｆｔｉｓｓｕｅｏｆ犃．狊犻狀犲狀狊犻狊ａｓａ
ｔｅｍｐｌａｔｅ，犘犃犔ｆｒａｇｍｅｎｔｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ－ＰＣＲ）ａｎｄ
ｃｏｎｎｅｃｔｅｄｔｏｐＧＥＭＴＥａｓｙｖｅｃｔｏｒｔｈｅｎｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏ犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻ＤＨ５α．Ｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｃｌｏｎｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ
ｂｙＰＣＲｗａｓｓｅｑｕｅｎｃｅｄａｎｄ７０６ｂｐｓｅｑｕｅｎｃｅ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ：ＫＪ０００２５８）ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｃｏｄｏｎＴＡＡ
ｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄ，ｗｈｉｃｈｅｎｃｏｄｉｎｇ２３２ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ．Ｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｉｄｅｎｔｉｔｙａｎａｌｙｓｉｓｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｂｏｔｈｔｈｅｎｕｃｌｅｏ
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ＰＣＲ；ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
７３１第２３卷第４期 草业学报２０１４年