全 文 ：海滨雀稗液泡膜犎＋犘犘犪狊犲（犘狏犞犘１）
５′端的克隆和序列分析
宋辉１，南志标１，蔡小宁２，钟小仙３，顾洪如３
（１．草地农业生态系统国家重点实验室 兰州大学草地农业科技学院，甘肃 兰州７３００２０；２．南京晓庄学院生物化工与
环境工程学院，江苏 南京２１１１７１；３．江苏省农业科学院畜牧研究所，江苏 南京２１００１４）
摘要：根据已公布液泡膜 Ｈ＋ＰＰａｓｅ基因家族同源序列保守区设计简并引物，克隆出海滨雀稗中犘狏犞犘１基因的中
间序列，然后用快速扩增ｃＤＮＡ末端（ｒａｐｉｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡｅｎｄ，ＲＡＣＥ）方法，从海滨雀稗中克隆到犘狏犞犘１
５′ｃＤＮＡ序列。该序列ＯＲＦ长１６０５ｂｐ，编码５３５个氨基酸，其编码序列、氨基酸序列与玉米相应基因的同源性分
别为９３％和９９％。
关键词：海滨雀稗；液泡膜 Ｈ＋ＰＰａｓｅ；ＲＡＣＥ；耐盐
中图分类号：Ｑ９４３．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１４）０５０１６８０７
犇犗犐：１０．１１６８６／ｃｙｘｂ２０１４０５１９
焦磷酸酶（ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ＰＰａｓｅ，ＥＣ３．６．１．１）是以焦磷酸为底物的水解酶，该酶广泛地存在于自然界中，
参与合成糖类、核酸和蛋白质等多种代谢途径中所形成的焦磷酸的水解。ＰＰａｓｅ通常分为２类，一类是存在于细
胞质和细胞器基质中的可溶性酶类，即无机焦磷酸酶（ｉｎｏｒｇａｎｉｃｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）；另一类是与膜结合的不可溶
性酶类，也就是膜结合焦磷酸酶（ＶＰＰａｓｅ）［１］。植物中主要存在３种质子泵（Ｈ＋ＡＴＰａｓｅ），即位于细胞质膜上的
Ｐ型质子泵（ＰＡＴＰａｓｅ）、液泡膜上的Ｖ型质子泵（ＶＡＴＰａｓｅ）和Ｈ＋转运无机焦磷酸酶（Ｈ＋ＰＰａｓｅ）［２］。在盐胁
迫条件下，植物 ＶＨ＋ＡＴＰａｓｅ和ＶＨ＋ＰＰａｓｅ一起为液泡膜Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白提供质子驱动力，将细胞
质中过多的Ｎａ＋区域化于液泡中，从而减轻Ｎａ＋的毒害［３］。
２０世纪５０年代，Ｋｕｎｉｔｚ［４］首次从酵母中纯化到无机焦磷酸酶，随后，Ｋａｒｌｓｓｏｎ［５］从甜菜（犅犲狋犪狏狌犾犵犪狉犻狊）根的
膜制剂中分离到钾激活的ＶＰＰａｓｅ。但是，直到１９９２年，Ｓａｒａｆｉａｎ等［６］才从拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）的ｃＤ
ＮＡ文库中第一次克隆出完整的液泡膜Ｈ＋ＰＰａｓｅ的ｃＤＮＡ序列，命名为犃犞犘１（Ｍ８１８９２）。随后，研究者发现，
大多数陆生植物 Ｈ＋ＰＰａｓｅｃＤＮＡ含有２２８３～２３１９个核苷酸的开放阅读框架（ＯＲＦ），编码大约７６１～７２２个氨
基酸残基，计算出的分子量约为８０～８１ｋＤａ。另外，研究者比较了１１种不同陆生植物的液泡膜 Ｈ＋ＰＰａｓｅ氨基
酸序列发现，它们的同源性高达８６％～９１％［７８］。现在普遍认为，液泡膜 Ｈ＋ＰＰａｓｅ是由单基因编码，它的过量
表达很有可能会增加质子力而提高植物的耐盐性。异源表达拟南芥液泡膜Ｈ＋ＰＰａｓｅ恢复了盐敏感酵母突变体
的耐盐性，盐芥的液泡膜犜狊犞犘 转入陆地棉（犌狅狊狊狔狆犻狌犿犺犻狉狊狌狋狌犿）后使其比同型野生型植株在１５０和２５０
ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ处理下耐受性增强［９１０］。席杰军等［１１］和 Ｗｕ等［１２］成功地从多浆旱生霸王（犣狔犵狅狆犺狔犾犾狌犿狓犪狀
狋犺狅狓狔犾狌犿）中克隆了液泡膜Ｈ＋ＰＰａｓｅ并证实该基因对霸王响应盐碱和干旱胁迫具有重要作用。
海滨雀稗（犘犪狊狆犪犾狌犿狏犪犵犻狀犪狋狌犿）又名夏威夷草，隶属于禾本科雀稗属植物，原产于热带和亚热带滨海地带。
海滨雀稗分蘖密度高，生长旺盛，具有较强的抗逆性和广泛适应性，耐盐碱的性能尤为出众，可以使用海水浇灌。
因此，笔者认为，从海滨雀稗中克隆出相应的耐盐基因，然后将目的基因转入非盐生牧草中以提高其耐盐性是可
行的。
１６８－１７４
２０１４年１０月
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
第２３卷 第５期
Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．５
收稿日期：２０１２０８３０；改回日期：２０１３０１１４
基金项目：国家“９７３”项目（２０１４ＣＢ１３８７０２）资助。
作者简介：宋辉（１９８５），男，山东鱼台人，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｓｏｎｇｈ１２＠ｌｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｚｈｉｂｉａｏ＠ｌｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
１ 材料与方法
１．１ 材料
海滨雀稗于２０１１年６月份在温室中培养；大肠杆菌（犈狊犮犺犲狉犻犪犮犺犻犪犮狅犾犻）ＤＨ５α；ＢＵＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＲＴＫＩＴ、
ＩＰＴＧ和ＸＧａｌ购自Ｂｉｏｕｎｉｑｕｅｒ；ｐＭＤＴＭ１８ＴＶｅｃｔｏｒ购自ＴａＫａＲａ；ＰｈｕｓｉｏｎＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ购
自ＮＥＢ（北京）有限公司；胶回收试剂盒，Ｍａｒｋｅｒ购自北京天根生化；ＲＮＡ提取试剂盒，加Ａ反应液购自盖宁生
物科技（北京）有限公司，引物合成和序列测定由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。
１．２ 海滨雀稗总ＲＮＡ的提取
依据ＲＮＡｐｕｒｅ超纯总ＲＮＡ快速提取试剂盒的说明书进行。
１．３ 海滨雀稗中间片段的克隆
将提取的总ＲＮＡ使用ＢＵＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＲＴＫＩＴ试剂盒反转录成ｃＤＮＡ。以反转录的ｃＤＮＡ为模板，Ｐ１：
ＧＧＹＧＧＤＴＣＢＴＣＨＡＴＧＧＣＹＣＴ，Ｐ２：ＡＹＴＴＣＴＴＤＧＣＲＴＴＲＴＣＣＣ为引物进行ＰＣＲ。将目的片段回收纯化，送
南京金斯瑞生物科技有限公司进行序列测定。
１．４ 海滨雀稗犘狏犞犘１５′ＲＡＣＥ的克隆
按照Ｂｉｏｕｎｉｑｕｅｒ的反转录试剂盒说明书操作步骤进行，略加修改，先合成５′ＲＡＣＥＲｅａｄｙｃＤＮＡ。根据所
获得的海滨雀稗液泡膜 Ｈ＋ＰＰａｓｅ基因部分ｃＤＮＡ序列信息，利用ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５．０软件设计特异性引物
ＧＳＰ１：５′ＡＧＡＧＡＣＣＡＡＣＣＧＣＣＡＣＡＣＡＣＡＡＧＡＡＣＡ３′；再设计１个５′端巢式ＰＣＲ引物ＧＳＰ２：５′ＧＡＧＣＡＧ
ＣＡＣＡＡＧＡＣＧＡＴＴＣＡＧＣＡ３′。通过２次ＰＣＲ获得５′ＲＡＣＥ扩增产物，通过２％琼脂糖凝胶电泳分离ＰＣＲ产
物，切下条带提取纯化，用于后续实验。
１．５ 序列分析
将５′ＲＡＣＥ扩增得到的片段连接到ｐＭＤ１８Ｔ载体上，转入大肠杆菌ＤＨ５α，挑取阳性克隆子，提交南京金斯
瑞生物科技有限公司进行序列测定。测序结果应用ＤＮＡｓｔａｒ、ＣｏｎｔｉｇＥｘｐｒｅｓｓ、Ｃｌｕｓｔａｌｘ、ＭＥＧＡ４．０和ＮＣＢＩ网
站上的ＢＬＡＳＴ比对工具分析。
２ 结果与分析
图１ 海滨雀稗总犚犖犃的提取与鉴定
犉犻犵．１ 犈狓狋狉犪犮狋犻狅狀犪狀犱犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犘．狏犪犵犻狀犪狋狌犿犚犖犃
１－３：总ＲＮＡ。ＴｏｔａｌＲＮＡ．
２．１ 海滨雀稗ＲＮＡ的提取和鉴定
提取海滨雀稗叶片的总ＲＮＡ，经过１．５％琼脂糖
凝胶电泳分离，可清晰观察到，２８ＳｒＲＮＡ 与１８Ｓ
ｒＲＮＡ的条带亮度基本呈１∶１。结果显示，提取的海
滨雀稗总ＲＮＡ符合实验要求（图１）。
２．２ 海滨雀稗犘狏犞犘１中间片段的扩增
以海滨雀稗ｃＤＮＡ 为模板，Ｐ１，Ｐ２ 为引物进行
ＲＴ－ＰＣＲ扩增。电泳显示在１３９１ｂｐ存在一条明显
的亮带，命名为犘狏犞犘１（图２）。
２．３ 海滨雀稗犘狏犞犘１５′ＲＡＣＥ的扩增
使用５′ＲＡＣＥ巢式ＰＣＲ，扩增产物于２％琼脂糖
凝胶电泳进行检测。由图３可知，在５００和７５０ｂｐ之
间有一条明亮的条带。经测序可知，目标条带序列长
６９７ｂｐ。
２．４ 海滨雀稗犘狏犞犘１５′ＲＡＣＥ序列的分析
通过对海滨雀稗犘狏犞犘１中间片段和５′ＲＡＣＥ扩增产物序列的测定，经序列拼接（图４），该片段ＯＲＦ核苷酸
序列长１６０５ｂｐ，共编码５３５个氨基酸残基。通过ＢＬＡＳＴ对比发现：海滨雀稗犘狏犞犘１的核苷酸序列与玉米（犣犲犪
犿犪狔狊）相应基因的核苷酸序列同源性达到９３％，而与其他植物的相关序列同源性也达到７９％以上，与玉米氨基
酸的同源性高达９９％。
９６１第２３卷第５期 草业学报２０１４年
图２ 海滨雀稗犘狏犞犘１中间片段犘犆犚扩增结果
犉犻犵．２ 犘犆犚犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狉犲狊狌犾狋狅犳犘．狏犪犵犻狀犪狋狌犿犿犻犱犱犾犲犳狉犪犵犿犲狀狋
图３ 巢式犘犆犚电泳结果
犉犻犵．３ 犜犺犲狀犲狊狋犲犱犘犆犚狆狉狅犱狌犮狋狊
Ｍ：分子量标准ＤＬ２０００，ＭａｒｋｅｒＤＬ２０００；１－３：ＰＣＲ产物，ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔ．
图４ 核苷酸序列及所编码的氨基酸序列
犉犻犵．４ 犖狌犮犾犲狅狋犻犱犲狊犲狇狌犲狀犮犲犪狀犱狋犺犲犱犲犱狌犮犲犱犪犿犻狀狅犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲
阴影部分为液泡膜 Ｈ＋ＰＰａｓｅ的活性部位。ＡｍｉｎｏａｃｉｄｓｉｎｓｈａｄｅｓｈｏｗｔｈｅＰＰｉｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｓａｎｄａｃｔｉｖｉｔｙｄｏｍａｉｎｓｏｆＨ＋ＰＰａｓｅ．
０７１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．５
将通过推测得到的犘狏犞犘１氨基酸序列与其他植物的氨基酸进行多重比对发现（图５），它与其他植物的氨基
酸的保守区域多达４９５个，而不保守区域为４０个。其中，与大麦（犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲）和水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）的相
似性为９８％，与小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿）的相似性为９７％，与卡拉草（犔犲狆狋狅犮犺犾狅犪犳狌狊犮犪）和高粱（犛狅狉犵犺狌犿犫犻犮狅犾
狅狉）的相似性为９５％。
通过使用 ＭＥＧＡ４．０构建犘狏犞犘１的系统发育树显示（图６），海滨雀稗犘狏犞犘１与玉米的亲缘关系最近，与
水稻的亲缘关系次之，与莱茵衣藻（犆犺犾犪犿狔犱狅犿狅狀犪狊狉犲犻狀犺犪狉犱狋犻犻）和盐藻（犇狌狀犪犾犻犲犾犾犪狏犻狉犻犱犻狊）的亲缘关系较远。
图５ 犘狏犞犘１氨基酸序列与其他植物犎＋犘犘犪狊犲氨基酸序列的多重比对
犉犻犵．５ 犜犺犲犪犾犻犵狀犿犲狀狋狅犳狋犺犲犪犿犻狀狅犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲狅犳犘狏犞犘１犪狀犱犎＋犘犘犪狊犲犳狉狅犿狅狋犺犲狉狆犾犪狀狋狊
３ 讨论
植物在漫长的进化过程中，逐渐形成了通过减少盐分的摄入、增强盐分的外排或使Ｎａ＋区域化进入液泡而
避免盐害的胁迫［１３］。目前，研究者主要利用以上３种机制来增强陆地棉［１０］、水稻［１４］、烟草［１５］（犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪
犮狌犿）等经济作物的耐盐性，而在牧草方面的研究鲜见报道。近年来，随着草地退化的趋势日益严重，生态环境的
恶化日渐突出，为了改善生态条件和提高盐碱地区城乡的绿化以及选育优良的牧草显得越来越重要［１６１７］。我国
的研究者在此方面做出了巨大的贡献，尤其是在结缕草［１８］（犣狅狔狊犻犪犼犪狆狅狀犻犮犪）、象草［１９］（犘犲狀狀犻狊犲狋狌犿狆狌狉狆狌狉犲
狌犿）、狗牙根［２０］（犆狔狀狅犱狅狀犱犪犮狋狔犾狅狀）等方面的研究已具有一定的影响力，但是利用基因工程的手段研究海滨雀稗
的报道较少。２００９年，邹轶等［２１］通过研究海盐胁迫对海滨雀稗生长的影响表明，海滨雀稗对盐胁迫有较强的抗
性。正是基于此研究，笔者认为，海滨雀稗的较强耐盐性很有可能是由体内的某些基因的上调表达造成的。因
此，本实验室试图利用分子生物学技术对海滨雀稗的耐盐基因进行挖掘，以期通过转基因技术将海滨雀稗良好的
耐盐基因转化耐盐性较差的牧草中，最终培育出适合在盐碱地生长的牧草。
１７１第２３卷第５期 草业学报２０１４年
图６ 海滨雀稗犘狏犞犘１的系统发育树
犉犻犵．６ 犜犺犲狆犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮狋狉犲犲狅犳犘狏犞犘１
Ｈ＋ＰＰａｓｅ基因的来源和ＧｅｎＢａｎｋ登录号ＴｈｅｏｒｉｇｉｎｓａｎｄＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎｏｆＨ＋ＰＰａｓｅｇｅｎｅ：拟南芥犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪，ＢＡＡ３２２１０．１；轮
藻犆犺犪狉犪犮狅狉犪犾犾犻狀犲，ＢＡＡ３６８４１．１；莱茵衣藻犆犺犾犪犿狔犱狅犿狅狀犪狊狉犲犻狀犺犪狉犱狋犻犻，ＸＰ＿００１６９４６８２．１；盐藻犇狌狀犪犾犻犲犾犾犪狏犻狉犻犱犻狊，ＡＤＫ３６６２９．１；山#菜犈狌
狋狉犲犿犪狊犪犾狊狌犵犻狀犲狌犿，ＡＡＲ０８９１３．２；大麦犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲，ＢＡＢ１８６８１．１；卡拉草犔犲狆狋狅犮犺犾狅犪犳狌狊犮犪，ＡＣＴ９８６１０．１；蒺藜苜蓿犕犲犱犻犮犪犵狅狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪，
ＡＣＩ２２３７７．１；水稻犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪，ＢＡＡ０８２３２．１；眼子菜犘狅狋犪犿狅犵犲狋狅狀犱犻狊狋犻狀犮狋狌狊，ＢＡＦ６３４７０．１；高粱犛狅狉犵犺狌犿犫犻犮狅犾狅狉，ＡＤＪ６７２５８．１；小麦犜狉犻狋犻犮
狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿，ＡＢＸ１００１４．１；玉米犣犲犪犿犪狔狊，ＣＡＧ２９３７０．１．
目前普遍将液泡膜Ｈ＋ＰＰａｓｅ基因分为２种类型，即Ｉ型和ＩＩ型［２２２３］。在拟南芥中的研究发现，这２种类型
的相似性只有３６％，而且这２种类型的Ｈ＋ＰＰａｓｅ基因不是简单的同工酶关系，它们分布在液泡膜的不同部位，
发挥不同的生理功能［２４］。目前的研究表明，Ｉ型基因在植物的耐盐性中发挥重要的作用。本研究利用５′ＲＡＣＥ
技术快速克隆了海滨雀稗液泡膜Ｈ＋ＰＰａｓｅ基因，通过氨基酸比对发现，该基因与其他植物Ｉ型基因的氨基酸序
列非常相似，说明所得到的克隆是液泡膜Ｈ＋ＰＰａｓｅ基因家族Ｉ类型。
在绿色植物和藻类植物的液泡膜Ｈ＋ＰＰａｓｅ基因中保守的ＧＧＧ、ＫＡＡＤＶＧＡＤＬＶＧＫＶＥ、ＤＮＶＧＤＮＶＧＤ、
ＹＹＴＳ等基序在漫长的进化中一直未丢失，这被认为是液泡膜 Ｈ＋ＰＰａｓｅ酶的催化位点［７，２５２６］。由于 ＤＶ
ＧＡＤＬＶＧＫＶＥ和ＤＮＶＧＤＮＶＧＤ具有Ｇｌｙ（Ｇ）、Ａｌａ（Ａ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｖａｌ（Ｖ）四种保守的氨基酸，因此这２种保守
的基序不仅在进化上具有重要的意义；而且在液泡膜Ｈ＋ＰＰａｓｅ酶发挥生理功能时，也起着非常重要的作用［２６］。
本试验已成功地克隆到了上述４个保守的基序（图４），这表明海滨雀稗犘狏犞犘１具有液泡膜质子泵的功能。由前
人的研究表明，液泡膜Ｈ＋ＰＰａｓｅ基因Ｉ型受 Ｍｇ２＋和Ｋ＋的激活［７］，并且Ａｓｐ（Ｄ）和Ｇｌｕ（Ｇ）被认为是最佳的金
属离子螯合位点［２７］。因此，笔者推测，ＤＶＧＡＤＬＶＧＫＶＥ和ＤＮＶＧＤＮＶＧＤ这２个最为保守的基序最有可能是
海滨雀稗犘狏犞犘１与 Ｍｇ２＋和Ｋ＋的结合位点和发挥生理功能的催化位点。
通过以上对海滨雀稗犘狏犞犘１５′末端序列的分析，笔者认为，海滨雀稗犘狏犞犘１具有良好的耐盐性。本实验
室已准备下一步克隆海滨雀稗犘狏犞犘１的３′末端，从而克隆出犘狏犞犘１的全长序列用于转化优良牧草，以提高其
耐盐性。
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３７１第２３卷第５期 草业学报２０１４年
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ａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＬａｎｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００２０，Ｃｈｉｎａ；２．ＳｃｈｏｏｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄ
ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＮａｎｊｉｎｇＸｉａｏｚｈｕａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１１１７１，Ｃｈｉｎａ；
３．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅ，ＪｉａｎｇｓｕＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００１４，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：ＡｐａｉｒｏｆｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄｂａｓｅｄｏｎｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙｃｌｏｎｅｄｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｃＤＮＡｓｅｇ
ｍｅｎｔｓ．Ｔｈｅｍｉｄｄｌｅｓｅｇｍｅｎｔｏｆ犘狏犞犘１ｗａｓｃｌｏｎｅｄ，ｔｈｅｎｔｈｅ犘狏犞犘１５’ｃＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅａｌｓｏｏｂｔａｉｎｅｄｕｓｉｎｇ５’
ＲＡＣＥ．Ｔｈｅｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）ｏｆｔｈｉｓｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓ１６０５ｂｐ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ５３４ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ．Ｔｈｅｃｏｄｏｎ
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ｔｏｌｅｒａｎｃｅ
《中国种业》征订启事
《中国种业》是由农业部主管，中国农业科学院作物科学研究所和中国种子协会共同主办的全国性、专业性、
技术性种业科技期刊。
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犈犿犪犻犾：ｃｈｉｎａｓｅｅｄｑｋｓ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ ｃｈｉｎａｓｅｅｄｑｋｓ＠１６３．ｃｏｍ
４７１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．５