全 文 ：第 19 卷 第 1 期
Vol. 19 No. 1
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2011 年 1 月
Jan. 2011
海滨雀稗栽培品种的形态特征与 AFLP分子标记分析
贺小霞 , 刘一明, 王兆龙*
(上海交通大学农业与生物学院, 上海 200240)
摘要 : 为解决海滨雀稗( Paspalum vaginatum)大面积营养扩繁过程中品种纯度问题, 本研究利用 AFLP 分子标记
技术,结合形态学特征, 对海滨雀稗品种 Salam , SeaSpray , SeaDw arf , SeaIsle 2000和一个 SeaDw arf粗茎变
异株系进行遗传差异分析,旨在探讨海滨雀稗品种的快速鉴别方法。结果表明 : 海滨雀稗的形态学遗传距离与
AFLP分子标记相似系数的聚类结果一致,均表明 Salam 和 SeaSpray 之间的遗传差异较小, 可以聚为一类, SeaD-
w arf 和 SeaIsle2000 的亲缘关系较近, 可以聚为另一类。另外, SeaDwar f粗茎变异株系与 SeaDw arf 之间的 AFLP
分子标记的遗传相似系数为 0. 5281,形态学遗传距离是 4. 8570,均表明二者之间遗传差异较大, 无论是形态特征、
还是AFLP 分子标记均证实 SeaDwar f粗茎株系确实已经变异。因此, AFLP分子标记的方法可用于海滨雀稗品种
或者突变体的辅助鉴定。
关键词:海滨雀稗; 粗茎变异株系;形态学差异; AFLP分子标记
中图分类号: Q944-33; Q751 文献标识码: A 文章编号: 1007-0435( 2011) 01-0164-07
Morphological Characteristics and AFLP Analysis in Seashore
Paspalum (Paspalum vaginatum) Varieties
HE Xiao-xia, LIU Y-i m ing , WANG Zhao- long
*
( Sch ool of Agriculture & Biology, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200240)
Abstract: Ensuring var iety purity is the key issue for vegetat iv e propagat ion in seashore paspalum ( Pas-
palum v aginatum ) . Varietes Salam, SeaSpr ay, SeaDw arf, SeaIsle 2000 and SeaDw arf mutant
were analyzed by mor pholog ical and AFLP differences. Results show that AFLP analysis is sim ilar to their
morpholog ical characteristics. Bo th indicate that Salam and SeaSpray are genet ically closer and could
be clustered in one gr oup; SeaDw arf and SeaIsle 2000 are in another group. AFLP analy sis show s ge-
netic similarity coef f icients( GSCs) betw een SeaDw arf and SeaDw arf mutant is 0. 5281; their morpho-
logical tax onomic dissimilarity( T D) is as high as 4. 8570. A ll indicated that SeaDw arf mutant is a com-
plete mutat ion f rom SeaDw ar f. T ho se results indicate that AFLP analy sis could be used to assist the -i
dent ificat ion o f seashore paspalum variet ies or their mutants.
Key words: Seashore Paspalum; Thick-stem mutant; M orpho logical dif ferences; AFLP M ar kers
海滨雀稗( Paspalum vag inatum )是目前耐盐
能力最强的草坪草种,且叶色翠绿,景观效果优于狗
牙根( Cynodon spp. )和结缕草( Zoy sia spp. ) , 已成
为最具发展潜力的暖季型草坪草种。目前在我国长
江以南地区的应用面积仅次于狗牙根, 位居第二, 南
方地区约有 30%以上的高尔夫球场已采用海滨雀
稗作为发球台、球道和长草区草坪。海滨雀稗草坪
品种的育种单位主要是美国乔治亚大学, 我国的海
滨雀稗品种都是从美国引进。 Salam(也称夏威
夷草)是我国第一个应用的海滨雀稗品种, 但由于
其随意扩繁,目前已出现了严重的变异和退化,一些
草坪公司供应的夏威夷草中已经混杂了许多不同质
地的变异, 与纯正的 Salam品种差异较大。我国
已陆续引进了 Salam, SeaDw ar f, SeaSpray和
SeaIsle2000等海滨雀稗品种。为了保证这些草坪
品种的纯度和品质, 我国的一些草坪公司也已开始
应用国际草坪草基因保证体系 ( IT GAP, Interna-
t ional Turfgrass Genet ic Assurance Program) 保证
草坪品种的基因纯度, 并与海滨雀稗的育种与推广
中心 美国乔治亚大学合作, 逐步建立了 Salam,
SeaDw arf和 SeaIsle2000等品种的认证草圃。
然而, 由于海滨雀稗主要是通过营养繁殖来进行大
收稿日期: 2010-10-11;修回日期: 2010- 12-17
基金项目:国家科技支撑计划( 2006BAD01A19- 3)资助
作者简介:贺小霞( 1984- ) ,女,河南郑州人,硕士研究生,研究方向为草坪种质资源的分子检测, E-mail: x iami8262@ s jtu. edu. cn; * 通讯作
者 Author for correspondence, E-m ail: turf@ sjtu. edu. cn
第 1期 贺小霞等:海滨雀稗栽培品种的形态特征与 AFLP 分子标记分析
面积的扩繁和草坪生产, 在此过程中很容易出现混
杂和芽变现象, 目前在 SeaDw arf的认证草圃中已
发现明显变粗的匍匐茎,疑似已发生变异。由于植
株的形态特征容易受栽培条件的影响, 因此建立草
坪品种基因纯度的分子鉴别体系是非常有必要的。
扩增片段长度多态性( AFLP, Amplified Frag-
ment Leng th Po lymor phism)是 1993年荷兰科学家
Zabeau和 Vos发展起来的一种新的检测 DNA 多
态性的分子标记技术[ 1] , 具有可靠性高、重复性好、
多态性丰富和 DNA 用量少等优点, 在动物植物微
生物中已被广泛应用。目前的研究主要集中在水稻
( Or y z a S at iv a )、小麦 ( Tr it i cum aest iv um )、玉米
( Zea may s ) [ 2] 、大豆( Gly cine max ) [ 3]、番茄( L y co-
p er sicon esculentum )
[ 4]、假俭草( Er emochloa ophi-
ur oides) [ 5] 、披碱草 ( E lymus dahuricus ) [ 6]、燕麦
( A vena sat iv a)
[ 7]等农作物及蔬菜的遗传多样性分
析、亲缘关系鉴定及分子遗传图谱构建上。近几年
在狗牙根 ( Cynodon dacty lon ) [ 8]、结缕草 ( Zoy sia
j aponica) [ 9]等草坪植物上也有了一些研究报道, 但
并没有用于植物品种分子鉴别的研究报道。姚家岭
等[ 10] 利用 AFLP 标记对不同居群的龙须草( Eu-
laliop si s binata )进行了生态型划分和遗传差异分
析,结果表明 AFLP 标记能区分出遗传差异极小的
无融合生殖居群,可用于鉴别无融合生殖种以下的
分类等级,展示了 AFLP 标记技术在植物品种差异
分析上的应用前景。
本文利用 AFLP分子标记, 结合形态学特征指
标的分析,对 4个海滨雀稗栽培品种及 SeaDw arf
粗茎变异株系进行遗传变异研究, 通过 AFLP 指纹
图谱来分析海滨雀稗栽培品种的特异性分子标记特
证,探讨 AFLP 分子标记技术应用于海滨雀稗品种
鉴定的可行性。
1 材料与方法
1. 1 植物材料
供试材料为海滨雀稗 Salam, SeaSpray,
SeaIsle2000, SeaDw arf及 SeaDw arf的粗茎变
异株系,取自上海美侬高尔夫工程有限公司的海滨
雀稗 ITGAP 认证草圃, 各品种或变异株均取自认
证草圃中的 1个匍匐茎, 先生长形成盆栽,再分别种
植在上海交通大学农业与生物学院实验农场草坪试
验地形成品种小区。
1. 2 形态特征观察
1. 2. 1 匍匐茎生长速率 供试材料分别随机抽取
具有多条匍匐茎的较长匍匐枝, 以 2 次观测值之差
除以生长天数计算其平均生长速率;
1. 2. 2 匍匐茎节间长 相对较长的匍匐茎中部的
节间长度;
1. 2. 3 匍匐茎节间直径 相对较长的匍匐茎中部
节间的直径;
1. 2. 4 叶舌长度 随机量取10个叶片叶舌的长度;
1. 2. 5 叶片长度 第 2个展开叶叶片长度,各个材
料分别随机抽取 10片成熟的叶测定其长度;
1. 2. 6 叶片宽度 所测定叶长的叶片宽度;
1. 2. 7 叶片长宽比 供试材料 10次随机所测叶片
长度和宽度对应的比值求平均值;
1. 2. 8 匍匐茎长粗比 所测匍匐茎中部的节间长
和直径对应的比值求平均值。
在每个供试材料的小区中随机选取 10 个植株
用游标卡尺测量, 每次测量重复 3次取其平均值,对
所得数据采用NTSYS- PC ver 2. 1软件进行聚类分析。
1. 3 AFLP分析
AFLP体系参考 Vos 等[ 1] 的方法, 并加以改
进。程序如下:
1. 3. 1 DNA 提取 剪取各供试材料完全展开的幼
嫩叶片(每个材料随机取 5~ 10个腋芽单茎的叶片
等量混合后用改进的 CTAB法提取 DNA)。用 1%
的琼脂糖凝胶电泳进行检测, 同时用 ND-1000紫外
分光光度计测定 DNA 浓度,最后将各材料的 DNA
浓度稀释至 200 ng L- 1。
1. 3. 2 限制性内切酶酶切与接头连接 用EcoR
和 M se 限制性内切酶组合对供试材料基因组
DNA 进行双酶切,采用分步酶切法。合成的单链人
工接头(表 1)稀释至 50 M , 98 退火 5 min,自然
冷却合成接头, 然后用 T4 DNA 连接酶将 EcoR
和 M se I 接头与酶切片段连接起来, 作为预扩增的
模板。
酶切反应体系: DNA ( 200 ng L - 1 ) 4. 0 L,
10 buf fer2. 0 L, EcoR I( 20 U L - 1 ) 0. 5 L,
M se I( 10 U L - 1 ) 0. 4 L, BSA ( 2. 5 ng L- 1 )
0. 2 L, ddH2O12. 9 L。共 20 L 反应体系, 在
37 放置 7 h, 65 水浴 4 h,立即置于冰上,稍离心
收集酶切产物。
连接反应体系:酶切产物 DNA 10. 0 L, EcoR
I adapter ( 50 pmo l L- 1 ) 0. 5 L, M se I adapter
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草 地 学 报 第 19卷
( 5 pmol L - 1 ) 0. 5 L, 10 ligat ion buf fer 2. 0
L, T4 DN A lig ase ( 5 U L - 1 ) 0. 2 L, ddH 2O
2. 9 L。共 20 L 反应体系, 在 22 反应 10 h,
65 水浴 20 min, 置于冰上,稍离心收集连接产物,
将其稀释一倍作为预扩增模板。
表 1 酶切连接接头序列及预扩增引物序列
Table 1 Nucleot ide sequences of adapters and
pre-amplification primers used in AFLP analy sis
接头 Adapter 序列 Sequ ences
Ead5 5-CT C GT A GAC TGC GTA CC- 3
Ead3 5-AAT TGG T AC GCA GTC T AC-3
Md5 5-GAC GAT GAG T CC TGA G-3
Md3 5-T AC TCA GGA CT C AT- 3
E00 5- GAC T GC GTA CCA ATT CN-3
M00 5-GAT GAG TCC TGA GTA AN-3
1. 3. 3 预扩增和选择性扩增 以酶切连接产物为
DNA 模板,用核心引物 E00和M00进行预扩增(表
1)。选择性引物带有 3 个碱基, 在本试验中选用
EcoR 引物6个和 M se I引物5个, 随机组合 30个
引物对进行筛选(表 2)。
表 2 AFLP 分析所用的引物及其碱基序列
T able 2 P rimers and their nucleot ide
sequences used in AFLP analy sis
引物 Prim ers 序列 Sequen ces
EcoR - 33 5-GAC TGC GTA CCA ATT CAA G-3
EcoR - 34 5-GAC TGC GTA CCA ATT CAA T-3
EcoR - 44 5-GAC T GC GT A CCA AT T CAT C-3
EcoR - 60 5-GAC TGC GTA CCA ATT CCT C-3
EcoR - 63 5-GAC TGC GTA CCA ATT CGA A-3
EcoR - 65 5-GAC T GC GTA CCA ATT CGA G-3
Mse- 31 5-GAT GAG T CC TGA GT A AAA A- 3
Mse- 44 5- GAT GAG TCC T GA GT A AAT C-3
Mse- 47 5-GAT GAG TCC T GA GTA ACA A-3
Mse- 60 5-GAT GAG T CC TGA GT A ACT C- 3
Mse- 63 5-GAT GAG T CC TGA GT A AGA A- 3
注:试验中的所有接头和引物由上海生工生物有限公司合成
Note: All the adapers an d primers w ere provided b y Shanghai
S an gon Biological Engineerin g T echnology& Service Co. , Ltd.
1. 3. 4 聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测 6%的变
性聚丙烯酰胺凝胶恒功率 50 W、预电泳 30 min后,
取 5 L 变性后的选择性扩增产物上样,恒功率 50
W电泳至溴酚兰距胶板底部约 10 cm 时停止电泳,
电泳结束后按标准的银染程序对凝胶进行染色。
1. 4 数据处理
根据玻璃板上条带的有无确定多态性带, 对应
每个个体的带型,将电泳图上清晰且可重复出现的
条带赋值为 1, 同一位置无带的赋值为 0。采用
NT SYS 2. 1软件计算 Jaccards相似系数[ 11]和遗传
距离( Taxonomic dissimilarity, T D) [ 12] ,即G si j = a/
( a+ b+ c) , Gsi j 是品种 i 和 j 的遗传相似系数, a为
2品种的共享片段数, b和 c 为 i 品种和 j 品种各自
拥有的多态片段数, 根据相似性系数进行聚类分析
建立 UPGMA系统树。
2 结果与分析
2. 1 形态特征
供试 5份海滨雀稗材料的生物学习性相似,其
茎节颜色均为红褐色, 叶片深绿色, 质地细腻,形成
的草坪致密、整齐、均一, 以匍匐生长为主,侵占性、
扩展性很强,匍匐茎特征见图 1。
图 1 供试海滨雀稗材料的匍匐茎形态照片
Fig . 1 Characteristics o f 5 seasho re paspalum mater ials
供试材料的匍匐茎生长速率、匍匐茎节间长、匍
匐茎节间直径、叶舌长度、叶片长度和宽度等特征见
表 3。不同材料的匍匐茎生长速率为 0. 34~ 0. 88
cm d- 1之间不等, 其排序为 Salam < SeaSpray<
SeaDw ar f< SeaIsle2000< SeaDw arf 粗茎变异; 供试
材料的匍匐茎节间长为 20. 02~ 30. 84 mm 不等,其
排序为 SeaDw ar f< SeaSpray< Salam< SeaIsle2000
< SeaDw arf粗茎变异; 供试材料的匍匐茎节间直径
为 1. 58~ 2. 24 mm 不等, 其排序为 Salam< SeaS-
pray< SeaDw arf < SeaIsle2000 < SeaDw arf 粗茎变
异;不同材料的叶舌长度为 1. 21~ 1. 33 mm 之间不
等, 其排序为 Salam < SeaSpray < SeaIsle2000 <
SeaDw ar f < SeaDw arf 粗茎变异; 供试材料的叶片
长度为 35. 83~ 42. 57 mm 不等, 排序为 Salam<
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第 1期 贺小霞等:海滨雀稗栽培品种的形态特征与 AFLP 分子标记分析
SeaSpray < SeaDw arf 粗茎变异 < SeaIsle2000 <
SeaDw arf; 供试材料的叶片宽度为 2. 52~ 3. 17 mm
不等, 其排序为 SeaIsle2000 < Salam < SeaSpray<
SeaDw arf< SeaDw arf 粗茎变异。SeaIsle2000 的匍
匐茎节间长粗比最小, 为 10. 64, SeaDw arf 粗茎变
异的节间长粗比最大,为 13. 74。SeaDw arf 粗茎变
异的叶片长宽比最小, 为 12. 40, SeaIsle2000的叶片
长宽比最大,为 16. 29。SeaDw arf 粗茎变异的匍匐
茎生长速率、匍匐茎节间长、茎节间直径、叶片宽度
及匍匐茎节间长粗比均显著大于 SeaDw arf及其他
品种( P< 0. 05) , 仅叶片长度及叶片长宽比之间无
显著差异。
表 3 供试材料的形态学特征
Table 3 M orpholog ical character s o f the invest igat ed samples
品种
Varieties
匍匐茎生长速率
Growth rate of creeping
s tem, cm d- 1
匍匐茎节间长
Internode length
mm
匍匐茎节间直径
Internode diameter
mm
叶舌长度
Ligule length
mm
叶片长度
Leaf
Length, mm
叶片宽度
Leaf
Width, mm
匍匐茎长粗比
Ratio of internode
length to diameter
叶片长宽比
Ratio of leaf length
to width
Salam 0. 34 0. 16b 20. 23 1. 94b 1. 58 0. 11c 1. 21 0. 16 b 35. 83 6. 87b 2. 67 0. 24c 12. 82 1. 25b 13. 48 2. 68bc
SeaSpray 0. 41 0. 17b 20. 13 2. 28b 1. 66 0. 26c 1. 22 0. 19 b 37. 08 5. 4b 2. 74 0. 20c 12. 34 1. 88b 13. 72 2. 96bc
SeaDwarf 0. 52 0. 25ab 20. 02 2. 76b 1. 87 0. 17b 1. 26 0. 16 ab 42. 57 11. 06a 2. 87 0. 21b 10. 76 1. 31c 15. 04 4. 54ab
SeaDwarf mutant 0. 88 0. 61a 30. 84 4. 67a 2. 24 0. 10a 1. 33 0. 15 a 39. 04 14. 66ab 3. 17 0. 24a 13. 74 1. 97a 12. 40 4. 73c
Sea Isle2000 0. 60 0. 32ab 20. 30 2. 88b 1. 91 0. 13b 1. 25 0. 22 ab 40. 55 6. 39ab 2. 52 0. 23d 10. 64 1. 37c 16. 29 3. 16a
注:所有数据均为 3次重复,每重复为 10个样本观测数据的平均值;同一列数据不同字母表示差异显著( P < 0. 05)
Note: Al l th e data calculated f rom three duplicates of ten samples in each. Data ( mean SD) in each column follow ed by different let ter are
signif icant ly dif f erent ( P < 0. 05)
2. 2 AFLP分析
2. 2. 1 供试材料的 DNA 质量检测 供试材料的
基因组 DNA 纯度高, 无降解, 无拖尾, OD260 / OD280
均在 1. 9~ 2. 0, 表明所提取的基因组 DNA 完全符
合 AFLP 检测要求(图 2)。
图 2 供试材料的基因组 DNA 电泳检测
Fig . 2 DNA electrophor esis test of investig ated samples
注: 1: Salam 品种; 2: SeaSpray 品种; 3: SeaDwarf 品种;
4: S eaDw arf粗茎变异株系; 5: SeaIsle2000品种
Note: 1- Salam; 2- SeaSpray; 3- SeaDwarf ;
4- SeaDwarf m utant ; 5- SeaIsle2000
2. 2. 2 AFLP 扩增结果 从 30对随机组合引物对
中筛选出 11对带型稳定、清晰均匀、多态性好的引
物对, 对供试材料的总 DNA 进行扩增分析,共扩增
出 369条带, 平均每个引物组合扩增出 33. 55条带
(表 4)。其中多态性标记 89个,多态性位点比率为
24. 11%, 单态性带(某个居群特有的带) 280条, 平
均每个引物组合可扩增出 25. 45条单态性带。以引
物组合E44/ M47扩增的位点最多,为 46条, 多态性
位点比率为 28. 26% ;引物组合 E60/ M44扩增的位
点最少,为 24个, 多态性位点比率为 33. 33% ;引物
组合 E44/ M44 扩增位点的多态性比率最高, 达
46. 67%。各供试材料的 AFLP 指纹图谱存在着明
显差异(图 3) ,说明 AFLP 技术可以从分子水平上
检测出海滨雀稗不同栽培品种之间的遗传差异。
表 4 供试材料所选用引物组合及其扩增结果
Table 4 AFLP amplification r esults of primer
combinat ions of investig ated samples
引物组合
Primer
combination
扩增位点数
No. of
amplified loci
共同位点数
No. of
common loci
多态性位点数
No. of
polymorghic loci
多态性位点比率
Ratio o f
polymorphic loci, %
E63/ M31 30 27 9 30. 00
E63/ M60 28 23 5 17. 86
E44/ M44 30 16 14 46. 67
E60/ M44 24 16 8 33. 33
E44/ M47 46 33 13 28. 26
E60/ M47 32 26 6 18. 75
E63/ M47 27 20 7 25. 93
E33/ M63 36 29 7 19. 44
E60/ M63 36 29 7 19. 44
E63/ M63 43 36 7 16. 28
E65/ M63 44 36 8 18. 18
合计 T ot al 369 280 89 24. 11
2. 2. 3 AFLP 品种标记特征谱带 从品种标记特
征谱看,供试的海滨雀稗品种可以通过表 5列出的
一些特征条带加以快速鉴定。E65M 63-1800 bp 片
段为 Salam, SeaDw arf 粗茎变异和 SeaIsle2000 所
共有,而 SeaSpray 和 SeaDw arf则缺失; E44M44-1700
bp片段为 Salam, SeaSpray, SeaDwarf和 SeaDw arf 粗
167
草 地 学 报 第 19卷
图 3 供试材料的部分引物 AFLP 扩增结果
Fig . 3 AFLP amplification r esults o f the pr imers o f investig ated samples
注: 1: Salam 品种; 2: SeaSpray 品种; 3: SeaDw arf 品种; 4: S eaDw arf粗茎变异株系;
5: SeaIsle2000品种;右图为明显差异片段, M ark er 自上向下分别为 2000, 1000, 750, 500, 250, 100 bp
Note: 1- Salam; 2- S eaSpray; 3- S eaDw arf; 4- S eaDw arf mutant ;
5- SeaIsle2000; M-m ark er( f rom up to down are2000, 1000, 750, 500, 250 and 100 bp)
表 5 供试材料的 AFLP 特征指纹谱带
Table 5 AFLP fingerprint bands of inv est igat ed samples
引物组合
Primer
combination
片段大小, bp
DNA
frangment
Salam SeaSpray SeaDwarf
SeaDwa rf
mut ant
SeaIsle
2000
E65M63 1800 1 0 0 1 1
E44M44 1700 1 1 1 1 0
E33M63 1200 0 1 1 1 1
E44M44 525 0 1 0 1 0
E44M47 333 0 0 1 0 1
E60M44 275 0 0 1 1 1
E65M63 175 0 1 1 0 1
E60M63 135 0 0 1 1 1
注:表中 1表示有该特征指纹谱带, 0表示无该特征指纹谱带
Note: 1 indicates f inger print band presen ted and 0 in dicates
n o f ingerprint b and
茎变异所共有, 只有 SeaIsle2000 缺失; E33M63-
1200 bp 片段为 SeaSpray, SeaDw arf 和 SeaDw ar f
粗茎变异和 SeaIsle2000 所共有, 只有 Salam 缺失;
E44M 44-525 bp片段为 SeaSpr ay , SeaDw arf 粗茎变
异所共有, 而 Salam, SeaDw arf 和 SeaIsle2000 则缺
失; E44M47-333 bp 片段为 SeaDw arf 和 SeaIsle2000
所共有,而 Salam, SeaSpr ay 和 SeaDw arf 粗茎变异
则缺失; E60M 44-275 bp 片段为 SeaDw arf , SeaD-
w arf 粗茎变异和 SeaIsle2000 所共有, 而 Salam 和
SeaSpray 则缺失; E65M 63-175 bp 片段为 SeaS-
pray , SeaDw arf 和 SeaIsle2000所共有, 而 Salam 和
SeaDw ar f粗茎变异则缺失; E60M 63-135 bp片段为
SeaDw ar f, SeaDw arf 粗茎变异和 SeaIsle2000所共
有,而 Salam 和 SeaSpray 则缺失。
为了更好地利用 AFLP 特征谱带检索供试材
料,特编制下列检索表:
1. 无 E60M 63( E+ CT C/ M + GAA)-135 bp片
段 ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯
2. 有 E65M 63( E+ GAG/ M+ GAA)-175 bp片
段 Salam⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯
2. 无 E65M 63( E+ GAG/ M+ GAA)-175 bp片
段 SeaSpr ay⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯
1. 有 E60M 63( E+ CT C/ M + GAA)-135 bp片
段 ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯
2. 有 E65M 63 ( E+ GAG/ M + GAA )-175 bp
片段 ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯
3.有 E44M 47( E+ ATC/ M + CAA)-333 bp片
段 SeaDw arf⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯
3.无 E44M 47( E+ ATC/ M + CAA)-333 bp片
段 SeaIsle2000⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯
168
第 1期 贺小霞等:海滨雀稗栽培品种的形态特征与 AFLP 分子标记分析
2.无 E65M63( E+ GAG/ M+ GAA)-175 bp片段
SeaDw arf mutant⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯
2. 2. 4 供试材料的遗传距离和聚类分析 分别以
89条多态性带计算得到品种间的 Jaccards相似系
数(表 6)和系统树聚类图(图 4) ;另外以草坪草匍匐
茎生长速率、匍匐茎节间长、节间直径、叶长、叶宽等
重要形态特征指标计算得到品种间的遗传距离(表
7)和系统树聚类图(图 5)。
表 6 供试 5 个材料的 AFLP 谱带 Jaccards相似系数
T able 6 Jacca rd s coefficent similar ity based on
AFLP data o f the invest igated samples
Salam SeaSp ray SeaDwarf
S eaDw arf
mutan t
Sea
Is le2000
S alam 1. 0000
S eaSpray 0. 6292 1. 0000
S eaDw arf 0. 4607 0. 3371 1. 0000
S eaDw arf mutant 0. 4382 0. 5393 0. 5281 1. 0000
S ea Is le2000 0. 3933 0. 3146 0. 6629 0. 5506 1. 0000
各供试材料的 AFLP 相似系数在 0. 3146 ~
0. 6629 之间(表 6)。SeaDw ar f品种与 SeaIsle2000
品种的遗传差异较小,相似系数为 0. 6629, 可以聚
为一类; Salam 品种与 SeaSpray 品种之间遗传差异
也较小,相似系数为 0. 6292,可以聚为另一类。这 2
类品种之间的相似系数较小, 说明它们之间的遗传
差异较大。SeaDw arf粗茎变异株系与 SeaDw arf 品
种的遗传相似系数只有 0. 5281,与其他品种间的遗
传相似系数也在 0. 4382~ 0. 5506 不等,证明 SeaD-
w arf粗茎变异株系确实已完全变异。
图 4 供试 5个材料的 AFLP 聚类分析
Fig. 4 Dendrog ram gener ated by cluster analysis
for the investig ated samples
供试材料的形态学特征遗传距离 ( TD) 在
0. 8395~ 5. 5830 之间变动(表 7)。Salam 与 SeaS-
pray 之间遗传差异最小, 遗传距离只有 0. 8395, 可
以聚为一类; SeaDw arf 和 SeaIsle2000之间遗传距
离也较小,为 1. 8756,可以聚为另一类;而这 2类品
种的遗传距离相对较大。这些形态学特征与 AFLP
分子分析所得到的结果基本一致。由于 SeaDw arf
粗茎变异株系在形态学特征上明显不同于其他供试
品种,与 Salam, SeaSpr ay , SeaDw ar f和 SeaIsle2000
之间遗传距离分别为 5. 5830, 5. 1015, 4. 8570 和
5. 5266。
表 7 供试材料的形态学特征的遗传距离
Table 7 Taxonomic dissimilarity analy sis of
mo rpholog ical characters fo r investigated samples
Salam S eaSpray S eaDw arf
SeaDw arf
mutant
S eaIs le
2000
Salam 0. 0000
SeaS pray 0. 8395 0. 0000
SeaDw arf 3. 6772 2. 8762 0. 0000
SeaDw arf mutan t 5. 5830 5. 1015 4. 8570 0. 0000
SeaIsle2000 3. 6726 3. 0274 1. 8756 5. 5266 0. 0000
图 5 供试材料的形态学特征聚类分析
F ig . 5 Dendrogr am generated by cluster
analysis fo r investig ated samples
3 讨论与结论
由于形态学特征具有直观、简便、易测等优点,
目前仍是植物遗传多样性分析的主要方法。金洪
等[ 1 3]对我国结缕草种质资源典型分布区的居群间
和居群内形态变异的研究表明, 表型性状的变异与
材料的地理分布基本一致。张小艾等[ 14] 及刘建秀
等[ 1 5]也用营养器官特征分别对我国华东地区和西
南区野生狗牙根材料的遗传多样性进行了研究, 张
小艾等[ 14] 发现其中 4个野生种与 T ifw ay 综合形态
指标相似,亲缘关系较近。然而,由于形态学特征受
光、温、水肥等环境条件或栽培条件的影响极大, 而
植物栽培品种在形态学特征上的差异一般均较小,
单纯依靠植物的形态学特征来鉴别植物的栽培品种
存在很大的不确定性, 也容易引起一些争议。近年
169
草 地 学 报 第 19卷
来,一些分子标记方法逐步引入了植物的遗传多样
性分析, L iu等[ 16, 17] 分别用 SSR标记和 RA PD标记
分析了 46份野生海滨雀稗的遗传多样性,并将其聚
为3个生态类型。Rogria等[ 18]也利用RAPD标记
对 15个居群共 75份毛花雀稗( P. di latatum)种质
资源进行了研究,证实了 RAPD技术可以准确侦测
到其种内和种间的遗传多态性。
AFLP 技术结合了 RFLP 及 RA PD的优点, 具
有很高的多态性检测率, 因此,一些研究已尝试利用
AFLP 来鉴别植物的栽培品种的质量和纯度, 贾建
航等[ 19] 利用分子标记技术找到了 3个玉米自交系
的特异 AFLP 产物,它们可应用于玉米自交系基因
型的鉴定。
由于海滨雀稗耐盐能力特强, 而且草坪色泽深
绿,修剪后草纹明显,南方许多新建的高质量运动草
坪几乎都采用了海滨雀稗,应用面积逐年扩大。我
国目前已引进了 Salam, SeaDwarf, SeaIsle
2000和 SeaSpray等海滨雀稗品种,但这些海滨雀
稗品种基本上都需要依靠匍匐茎进行营养扩繁, 在
大面积营养扩繁过程中品种纯度的保持是目前海滨
雀稗草坪质量控制中面临的最大问题。由于海滨雀
稗草圃生产每年的扩繁比例一般都要达到 1 100
左右,若在草圃生产中有 1株混杂或 1个芽变,几年
扩繁后就会导致整个品种的完全混杂和退化。目前
的方法主要是根据匍匐茎的形态特征对海滨雀稗品
种的纯度进行监控, 一旦发现品种混杂或突变株, 立
即清除。然而由于匍匐茎形态容易受到温、光、水、
肥等环境条件的影响, 对品种混杂与突变的鉴别有
一定的不确定性。
本文分别利用形态学特征和 AFLP 分子标记
技术对海滨雀稗 4个栽培品种和一个粗茎变异材料
进行了遗传多样性分析, 海滨雀稗 4个栽培品种的
形态学遗传距离与 AFLP 分子标记相似系数的聚
类结果一致,均表明 Salam 和 SeaSpr ay 之间的遗传
差异较小,可以聚为一类, SeaDw ar f和 SeaIsle2000
的亲缘关系较近,可以聚为另一类,而 2类品种之间
的遗传差异相对较大, 这些结果表明 AFLP 分子标
记技术可以应用于海滨雀稗栽培品种的鉴定。另
外, SeaDw arf粗茎变异株系与 SeaDw arf之间的形
态学遗传距离是 4. 8570, AFLP 分子标记的遗传相
似系数为 0. 5281, 均表明二者之间遗传差异较大,
无论是形态特征, 还是 AFLP 分子标记均证实了
SeaDw arf粗茎株系确实已经变异。这些研究结果
表明, AFLP 分子标记技术可以应用于海滨雀稗品
种的鉴别,为海滨雀稗大面积营养扩繁过程中的品
种纯度保证提供服务。
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(责任编辑 李美娟)
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