全 文 ：书添加外源纤维水解酶对羊草体外瘤胃
发酵酶活性及特性的影响
庄苏，丁立人，周建国，王恬
（南京农业大学动物科技学院，江苏 南京２１００９５）
摘要：试验通过分别添加纤维素酶与木聚糖酶０，１０．０与５０．０ｍｇ水平，０与２４ｈ两个预处理时间，每个处理３个
重复，体外法评价纤维素酶与木聚糖酶复合处理羊草后与瘤胃液共培养对木聚糖酶与葡聚糖酶活性及发酵特性的
影响。结果表明，添加纤维水解酶能提高０与８ｈ培养液中木聚糖酶和内切葡聚糖酶活性以及０ｈ培养液中外切
葡聚糖酶活性，且具有添加剂量效应。当培养至２４及４８ｈ，添加外源酶制剂并不能提高培养液中相关酶活性。外
源酶制剂显著增加培养２４与４８ｈ发酵液中乙酸含量，８，２４与４８ｈ总挥发性脂肪酸产量 （犘＜０．０５）以及４８ｈ累
积产气量（犘＜０．０５），但对培养期内戊酸与异戊酸含量没有影响（犘＞０．０５）。结果提示添加外源酶制剂能提高早
期培养液中木聚糖酶和葡聚糖酶活性、增加ＶＦＡ产量和改善体外瘤胃发酵特性。
关键词：纤维素酶；木聚糖酶；挥发性脂肪酸；体外试验
中图分类号：Ｓ８２６ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１３）０１０３１５０８
在反刍动物生产中，有关外源酶制剂应用一直存在着不少争议。因为瘤胃内蛋白质水解菌能分解外源酶（如
植物细胞壁水解酶类）而使之失活［１］，同时瘤胃微生物能分泌蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等多种酶类，并且各种酶
活性很高［２］，因此无需额外添加外源酶制剂。但是，随着酶制剂技术的发展，人们除了重视外源酶在单胃动物生
产中应用研究外也开始关注外源酶制剂在反刍动物生产中的应用研究。研究表明，某些纤维素酶、半纤维酶与蛋
白酶一起培养时能保持稳定酶活，并在瘤胃内稳定生存［３］；外源酶制剂能够增加瘤胃微生物在饲料颗粒上的附着
并增加饲料降解率［４］；Ｍｏｒｇａｖｉ等［５］发现由长梗木霉（犜狉犻犮犺狅犱犲狉犿犪犾狅狀犵犻犫狉犪犮犺犻犪狋狌犿）产生的酶能与瘤胃内酶一
起协同地从玉米（犣犲犪犿犪狔狊）青贮中释放更多的还原糖；同样外源纤维水解酶能改善动物生产性能［６，７］。即便如
此，外源酶制剂在反刍动物生产应用研究还不够深入，对其作用机理认识还不够全面。就目前研究现状而言，更
多研究集中在外源酶制剂如何处理粗饲料（如作为青贮饲料添加剂）上［８，９］，有关外源酶制剂的处理时间、添加剂
量以及外源酶对内源酶活性的影响研究相对较少，国内在这方面研究仅处于起步阶段。本试验以羊草为底物，利
用体外法研究不同剂量纤维酶与木聚糖酶、不同处理时间与瘤胃液共培养对发酵液中纤维素酶与葡聚糖酶活性
与发酵特性的影响，旨在为丰富外源纤维水解酶在反刍动物中的应用提供一些理论依据。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料与时间
酶制剂为国产纤维素酶（４００００Ｕ／ｇ）与木聚糖酶（４２０００Ｕ／ｇ）产品。使用时，用去离子水配制成各含１０与
５０ｍｇ／ｍＬ纤维素酶与木聚糖酶混合酶液。发酵底物为羊草（犃狀犲狌狉狅犾犲狆犻犱犻狌犿犮犺犻狀犲狀狊犲）草粉。试验于２００９年
１０月在南京农业大学动物科技学院反刍动物营养研究室进行。
１．２ 瘤胃液采集
选取５只体况良好、体重３５～４０ｋｇ装有永久瘤胃瘘管的本地阉割山羊用于瘤胃液供体。试验羊圈养，适量
补饲精料（玉米∶豆粕＝７∶３），自由采食青干草与饮水。瘤胃液采集当日，在饲喂后２ｈ，经瘤胃瘘管分别从５头
山羊的瘤胃腹囊下部抽取含内容物的瘤胃液，放入经３９℃预热并充满ＣＯ２ 的保温瓶中，立即返回实验室，用４层
第２２卷 第１期
Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．１
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
３１５－３２２
２０１３年２月
收稿日期：２０１２０７０３；改回日期：２０１２１０１５
基金项目：农业部结构调整重大技术研究专项（２００８０９０１Ｂ）资助。
作者简介：庄苏（１９６１），男，江苏江都人，副教授，博士。Ｅｍａｉｌ：ｚｈｕａｎｇｓｕ＠ｎｊａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｔｉａｎｗａｎｇ＠ｎｊａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
纱布分离内容物，滤液作为混合瘤胃微生物接种物，整个过程在厌氧条件下进行。
１．３ 缓冲液制备
缓冲液参照Ｒｕｓｓｅｌ和 Ｍａｒｔｉｎ［１０］的配方制备。将缓冲液装入广口瓶中，加入１％刃天青数滴，通ＣＯ２ 直至缓
冲液呈无色为止，此时表示已达到厌氧条件。
１．４ 接种液配制
将缓冲液预热至３９℃，在厌氧条件下按缓冲液与瘤胃液为４∶１（Ｖ／Ｖ）制备接种液。制备完成后立即使用。
１．５ 试验设计
试验共设６组。分组如下：２４ｈ酶处理组，分别称取２．０ｇ羊草装入１５０ｍＬ发酵瓶内，然后用注射器在羊草
上均匀地喷洒含酶剂量为０，１０．０与５０．０ｍｇ／ｍＬ酶液１ｍＬ，３组分别标记为２４０，２４１０与２４５０，并置于２０℃
培养箱中处理２４ｈ后，向瓶内注入ＣＯ２ 排除空气，接着向瓶内加入预热至３９℃接种液５０ｍＬ，整个过程伴随
ＣＯ２ 通入以维持厌氧条件，分装完毕后迅速盖上异丁基橡胶塞密封，并以铝盖固定封口，最后置于３９℃下培养。
另３组为０ｈ酶处理组：在装入２．０ｇ羊草瓶内均匀地喷洒酶剂量为０，１０．０与５０．０ｍｇ／ｍＬ酶液１ｍＬ，３组分
别标记为００，０１０与０５０，通入ＣＯ２ 后直接加入接种液，余下操作同２４ｈ处理组。每组设３个重复。
１．６ 样本采集与处理
在４，６，８，１２，２４，３６，４８ｈ培养时间点分别从每组中取出３个发酵瓶用气压转换仪测定产气量并计算累积产
气量，同时对其他发酵瓶进行放气处理，所有操作过程均在３９℃条件下进行。在０（接种后立即采样），８，２４，４８ｈ
培养时间点分别从每组中取出３个发酵瓶，打开瓶盖立即测定发酵液ｐＨ值，然后将发酵瓶内全部内容物倒入尼
龙袋（２００目，孔径０．０７４ｍｍ）分离发酵液与内容物。发酵液分装于３个１０ｍＬ离心管中，置于－２０℃冰柜中用
于后期酶活性与挥发性脂肪酸（ＶＦＡ，ｖｏｌａｔｉｌｅｆａｔｔｙａｃｉｄ）测定。每次取样后该时间点发酵瓶弃用。
１．７ 样品测定与方法
分别以浓度为２０ｍｇ／ｍＬ的燕麦木聚糖（Ｘ０６２７购自Ｓｉｇｍａ）、羧甲基纤维素钠（国产）与ＡｖｉｃｅｌＰＨ１０１（购
自Ｆｌｕｋａ）溶液用于木聚糖酶、内切葡聚糖酶与外切葡
聚糖酶酶活测定底物。在ｐＨ６．０和５０℃条件下反应
３０ｍｉｎ测定酶活力［１１］。酶活（Ｕ）定义为此测定条件
下１ｍｉｎ内释放１ｎｍｏｌ的木糖或葡萄糖所需的酶量
为１个酶活单位。
岛津ＧＣ１４Ｂ气相色谱仪测定ＶＦＡ含量［１２］并略
作改进。
１．８ 数据处理
试验数据经Ｅｘｃｅｌ２００３初步整理后，采用ＳＰＳＳ
１３．０统计软件中ＧＬＭ模块中 Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ进行方差
分析，检验预处理时间、酶剂量、预处理时间与酶剂量
间的互作效应。对同一时间点数据采用 Ｏｎｅｗａｙ
ＡＮＯＶＡ中Ｄｕｎｃａｎ’ｓ法进行多重比较，显著水平置
于０．０５。结果用平均数与平均标准误表示。
２ 结果与分析
２．１ 纤维水解酶对体外发酵液木聚糖酶活性的影响
在０ｈ，酶量、处理时间显著影响木聚糖酶酶活
（犘＜０．０５）；两者互作效应为０．０９２（表１）。在８ｈ，酶
量显著影响木聚糖酶活性（犘＜０．０５）；高剂量酶组酶
活均显著高于其他处理组（犘＜０．０５），而处理时间对
酶活的影响不显著（犘＝０．１２７），酶量与处理时间无互
表１ 纤维水解酶对体外发酵液中木聚糖酶活性的影响
犜犪犫犾犲１ 犈犳犳犲犮狋狅犳狋犺犲犳犻犫狉狅犾狔狋犻犮犲狀狕狔犿犲狊狅狀狓狔犾犪狀犪狊犲
犪犮狋犻狏犻狋狔犻狀狏犻狋狉狅 ｎｍｏｌ／（ｍｉｎ·ｍＬ）
处理时间
Ｔｒｅａｔｅｄｔｉｍｅ
（ｈ）
剂量
Ｄｏｓａｇｅ
（ｍｇ／ｍＬ）
发酵时间
Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｉｍｅ（ｈ）
０ ８ ２４ ４８
０ ０ １５５．０５ｆ ６６．２６ｂ １０７．３６ａｂ１０１．０６ａｂ
１０ ２３４．４２ｄ ７２．４７ｂ １１４．９９ａｂ１１２．６６ａ
５０ ３４９．３９ｂ １１０．３６ａ １０２．００ｂ １０２．１４ａｂ
２４ ０ １８０．００ｅ ７０．００ｂ １０４．１３ｂ １００．４３ａｂ
１０ ２９６．６３ｃ ７５．８４ｂ １１５．９６ａｂ１０２．４１ａｂ
５０ ３８６．７５ａ １１５．７９ａ １２４．６６ａ ９５．７７ｂ
ＳＥＭ ７．８６ ３．１３ ５．７１ ４．２６
剂量Ｄｏｓａｇｅ（犘值Ｖａｌｕｅ）０．０００ ０．０００ ０．２４４ ０．１４７
时间Ｔｉｍｅ（犘值Ｖａｌｕｅ）０．０００ ０．１２７ ０．１７２ ０．１２４
剂量×时间 Ｄｏｓａｇｅ×
Ｔｉｍｅ（犘值Ｖａｌｕｅ）
０．０９２ ０．９４１ ０．０９２ ０．５４２
注：同列字母不同者差异显著（犘＜０．０５）。ＳＥＭ：平均标准误。下
同。
Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｔｔｅｒｓｉｎｔｈｅｓａｍｅｃｏｌｕｍｎ ｍｅａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔ０．０５．ＳＥＭ：Ｓｔａｎｄａｒｄｅｒｒｏｒｏｆｔｈｅｍｅａｎ．Ｔｈｅｓａｍｅｂｅ
ｌｏｗ．
６１３ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．１
作效应。在２４与４８ｈ，酶量与处理时间效应、酶量与处理时间互作效应均不显著（犘＞０．０５）；但在２４ｈ，２４ｈ处
理的高剂量组酶活高于无酶组与０ｈ处理的高剂量组（犘＜０．０５）。
２．２ 纤维水解酶对体外发酵液内切、外切葡聚糖酶活性的影响
在０与８ｈ，酶量与处理时间均显著影响内切葡聚糖酶活性（犘＜０．０５）（表２）；其中０ｈ时间点，两者存在互
作效应（犘＜０．０５）；高剂量显著增加内切葡聚糖酶活性（犘＜０．０５）。与０ｈ比较，８ｈ内切葡聚糖酶活性大幅下
降，下降幅度在６５．５２％～７３．１２％。当发酵至２４与４８ｈ，酶量、预处理时间效应以及两者间的互作效应均不显
著（犘＞０．０５）。
在０ｈ，酶量、处理时间显著影响发酵液中外切葡聚糖酶活性 （犘＜０．０５）；剂量与处理时间具有一定的互作
效应（犘＝０．０６）；２４ｈ酶处理组发酵液中外切葡聚糖酶活性显著高于其他各组（犘＜０．０５）。在发酵８ｈ，仅处理
时间对酶活性产生显著影响（犘＜０．０５）。发酵２４与４８ｈ，酶量、处理时间及两者间互作效应均不显著 （犘＞
０．０５）。
表２ 纤维水解酶对体外发酵液中葡聚糖酶活性的影响
犜犪犫犾犲２ 犈犳犳犲犮狋狅犳狋犺犲犳犻犫狉狅犾狔狋犻犮犲狀狕狔犿犲狊狅狀犵犾狌犮犪狀犪狊犲犪犮狋犻狏犻狋狔犻狀狏犻狋狉狅 ｎｍｏｌ／（ｍｉｎ·ｍＬ）
处理时间
Ｔｒｅａｔｅｄｔｉｍｅ（ｈ）
剂量Ｄｏｓａｇｅ
（ｍｇ／ｍＬ）
内切葡聚糖酶Ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ
０ｈ ８ｈ ２４ｈ ４８ｈ
外切葡聚糖酶Ｅｘｏｇｌｕｃａｎａｓｅ
０ｈ ８ｈ ２４ｈ ４８ｈ
０ ０ ２９４．２５ｅ １０７．５９ｃ １０６．６７ａ １０３．６８ａｂ ３１０．７０ｃ １０７．３３ａ ９５．９２ａ ９４．０４ｂ
１０ ３５９．５２ｃ １０４．８０ｃ １０５．４１ａ １０３．８９ａｂ ３１７．４９ｃ １０１．１９ｂ ９８．９１ａ ９５．８２ａｂ
５０ ３８８．５５ｂ １３３．９８ａ １０５．２５ａ １０３．９４ａｂ ３５５．８７ｂ １１０．８９ａ ９５．５１ａ ９６．４２ａｂ
２４ ０ ３２０．７１ｄ １１６．２２ｂ １０５．４１ａ １００．０７ｂ ３１７．４５ｃ １１４．９０ａ １０１．７５ａ ９６．５１ａｂ
１０ ４０９．８７ｂ １１０．１８ｂｃ １０６．８８ａ １０５．００ａ ４０１．６４ａ １１６．０７ａ １０２．０１ａ ９８．００ａ
５０ ４９４．８３ａ １３７．１８ａ １１１．２４ａ １０３．３３ａｂ ４２９．６６ａ １１２．８７ａ １０１．６５ａ ９５．５６ａｂ
ＳＥＭ ８．２３ ２．５４ ２．６５ １．３４ １０．５０ ２．８４ １．９４ ０．９２
剂量 Ｄｏｓａｇｅ（犘值Ｖａｌｕｅ） ０．０００ ０．０００ ０．６７３ ０．１８７ ０．０００ ０．５０９ ０．５９０ ０．２４６
时间 Ｔｉｍｅ（犘值Ｖａｌｕｅ） ０．０００ ０．０１７ ０．３３５ ０．３６１ ０．０００ ０．００４ ０．０８０ ０．１１８
剂量×时间Ｄｏｓａｇｅ×Ｔｉｍｅ（犘值Ｖａｌｕｅ） ０．００１ ０．５７５ ０．４４０ ０．２４１ ０．０６０ ０．１１６ ０．６９７ ０．１７７
２．３ 纤维水解酶对体外发酵液挥发性脂肪酸含量的影响
在０ｈ点，发酵液中乙酸含量在２２．１９～２２．６１ｍｍｏｌ／Ｌ（表３），酶量、处理时间效应、酶量与处理时间互作效
应对乙酸含量均无显著影响（犘＞０．０５）。当发酵至８ｈ，外源酶具有增加乙酸含量作用的趋势（犘＝０．０９１）；而处
理时间效应、酶剂量与处理时间互作效应不显著（犘＞０．０５）。在２４与４８ｈ，添加酶剂量显著增加发酵液中乙酸
含量（犘＜０．０５），５０ｍｇ酶处理组均显著高于无酶组（犘＜０．０５）；处理时间对乙酸产量没有影响并且酶剂量与处
理时间之间没有互作效应（犘＞０．０５）。
丙酸含量显示，在０ｈ，酶剂量、处理时间效应、酶剂量与处理时间互作效应均不显著影响丙酸含量（犘＞
０．０５）。在８与２４ｈ，外源酶有增加发酵液中丙酸含量的趋势并有剂量效应 （犘＝０．０５５与犘＝０．０５２）。发酵４８
ｈ，各组丙酸含量无显著性差异（犘＞０．０５）。
在８ｈ，添加酶制剂显著提高丁酸含量 （犘＜０．０５）。在其他各时间点，酶剂量、处理时间效应及两者的互作
效应均不显著（犘＞０．０５）。
除０ｈ外，添加外源酶显著地增加总ＶＦＡ含量（犘＜０．０５），而处理时间效应、酶剂量与处理时间的互作效应
不显著（犘＞０．０５）。
外源酶添加量与预处理时间并不影响发酵液中戊酸与异戊酸含量 （犘＞０．０５）。
７１３第２２卷第１期 草业学报２０１３年
表３ 纤维素水解酶对体外发酵液中犞犉犃含量的影响
犜犪犫犾犲３ 犈犳犳犲犮狋狅犳狋犺犲犳犻犫狉狅犾狔狋犻犮犲狀狕狔犿犲狊狅狀犞犉犃犮狅狀狋犲狀狋犻狀狏犻狋狉狅 ｍｍｏｌ／Ｌ
处理时间
Ｔｒｅａｔｅｄｔｉｍｅ（ｈ）
剂量Ｄｏｓａｇｅ
（ｍｇ／ｍＬ）
乙酸 Ａｃｅｔａｔｅ
０ｈ ８ｈ ２４ｈ ４８ｈ
丙酸Ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ
０ｈ ８ｈ ２４ｈ ４８ｈ
０ ０ ２２．１９ ３７．６４ｂ ４９．７８ｃ ５３．９４ｃ ６．４６ １６．３７ｂ ２８．２４ ３２．０４
１０ ２２．３９ ３９．８０ａｂ ５９．２１ａｂ ６７．３７ａ ６．２５ １９．１０ａｂ ２９．８０ ３３．７９
５０ ２１．３９ ３９．６８ａｂ ６１．５４ａｂ ６３．３４ａ ６．２４ １９．１２ａｂ ３２．５６ ３３．２５
２４ ０ ２２．６１ ３８．１７ｂ ５１．６１ｂｃ ５５．１１ｂｃ ６．４４ １６．７１ａｂ ２７．３４ ３１．８５
１０ ２２．３６ ３９．８０ａｂ ５８．１７ａｂ ６１．７８ａｂ ６．６２ １８．４５ａｂ ３０．４７ ３１．６９
５０ ２２．４５ ４６．１７ａ ６４．２５ａ ６７．２７ａ ６．４０ ２０．８３ａ ３３．５６ ３３．８５
ＳＥＭ １．４６ ２．０９ ３．２８ ２．２４ ０．５５ １．２７ １．９１ １．７８
剂量Ｄｏｓａｇｅ（犘值Ｖａｌｕｅ） ０．９３５ ０．０９１ ０．００９ ０．００１ ０．９６７ ０．０５５ ０．０５２ ０．６７６
时间Ｔｉｍｅ（犘值Ｖａｌｕｅ） ０．６９３ ０．２００ ０．６７０ ０．９３２ ０．７０６ ０．６６１ ０．８７２ ０．７０２
剂量×时间Ｄｏｓａｇｅ×Ｔｉｍｅ（犘值Ｖａｌｕｅ） ０．９３１ ０．２５９ ０．８３８ ０．１３３ ０．９３８ ０．６６０ ０．８６９ ０．７４２
处理时间
Ｔｒｅａｔｅｄｔｉｍｅ（ｈ）
剂量Ｄｏｓａｇｅ
（ｍｇ／ｍＬ）
丁酸Ｂｕｔｙｒａｔｅ
０ｈ ８ｈ ２４ｈ ４８ｈ
总挥发性脂肪酸ＴｏｔａｌＶＦＡ
０ｈ ８ｈ ２４ｈ ４８ｈ
０ ０ ２．２６ ５．７９ｂｃ １５．１５ １５．６７ ３０．９０ ５９．８０ｃ ９３．１７ｂ １０１．６６ｂ
１０ ２．３３ ７．６９ａ １５．３８ １６．３７ ３０．９７ ６６．６８ａｂ １０４．３９ａｂ １１７．５４ａ
５０ ２．４０ ６．００ｂ １６．５８ １７．６９ ３０．０３ ６４．８０ａｂ １１０．６７ａｂ １１４．２７ａ
２４ ０ ２．２０ ４．５１ｃ １４．８１ １５．３８ ３１．２５ ５９．３９ｃ ９３．７６ｂ １０２．３４ｂ
１０ ２．１８ ５．８３ｂｃ １５．６１ １５．８６ ３１．１５ ６４．０８ａｂ １０４．２５ａｂ １０９．３３ａｂ
５０ ２．４４ ６．４４ａｂ １６．５１ １６．１３ ３１．２９ ７３．４４ａ １１４．３３ａ １１７．２６ａ
ＳＥＭ ０．１７ ０．４１ ０．９０ ０．７９ ２．１０ ３．３５ ５．３８ ２．８９
剂量Ｄｏｓａｇｅ（犘值Ｖａｌｕｅ） ０．５１９ ０．００７ ０．２４６ ０．２５６ ０．９７５ ０．００４ ０．０１４ ０．００１
时间Ｔｉｍｅ（犘值Ｖａｌｕｅ） ０．７０２ ０．２００ ０．９４０ ０．２４６ ０．７３４ ０．５０５ ０．７６１ ０．５３３
剂量×时间Ｄｏｓａｇｅ×Ｔｉｍｅ（犘值Ｖａｌｕｅ） ０．８５８ ０．０４２ ０．９５１ ０．７０３ ０．９６３ ０．２４６ ０．９３３ ０．７０３
处理时间
Ｔｒｅａｔｅｄｔｉｍｅ（ｈ）
剂量Ｄｏｓａｇｅ
（ｍｇ／ｍＬ）
戊酸Ｖａｌｅｒａｔｅ
０ｈ ８ｈ ２４ｈ ４８ｈ
异戊酸Ｉｓｏｖａｌｅｒａｔｅ
０ｈ ８ｈ ２４ｈ ４８ｈ
０ ０ ０．２５ａｂ ０．４８ａｂ １．０２ １．１９ １．２４ａ １．４３ｂ １．９７ａ ２．２４
１０ ０．２０ａｂ ０．６１ａ ０．９６ １．１４ １．０３ａｂ １．７５ａ ２．１５ａ １．９８
５０ ０．２８ａ ０．５３ａ ０．９１ １．２９ １．０６ａｂ １．４４ｂ １．９２ａ １．４５
２４ ０ ０．２６ａｂ ０．５２ａ ０．８５ １．１７ １．０１ａｂ １．３４ｂｃ １．８９ａ ２．１６
１０ ０．１６ｂ ０．３９ｂ ０．６９ １．０５ ０．５１ｂ １．１０ｃ ０．８１ｂ ２．１８
５０ ０．１９ａｂ ０．５０ａｂ １．０１ １．０５ １．１２ａｂ １．４９ａｂ ２．０３ａ １．９８
ＳＥＭ ０．０３ ０．０４ ０．９０ ０．０８ ０．１８ ０．０９ ０．２７ ０．３６
剂量Ｄｏｓａｇｅ（犘值Ｖａｌｕｅ） ０．１１７ ０．９５６ ０．３８３ ０．４８７ ０．１４０ ０．６９４ ０．１７１ ０．４０７
时间Ｔｉｍｅ（犘值Ｖａｌｕｅ） ０．２０４ ０．０５３ ０．１８４ ０．０８５ ０．１４９ ０．０１２ ０．０７２ ０．４７５
剂量×时间Ｄｏｓａｇｅ×Ｔｉｍｅ（犘值Ｖａｌｕｅ） ０．３５７ ０．０１８ ０．１７８ ０．３６４ ０．３１９ ０．００７ ０．０３９ ０．７０３
２．４ 纤维水解酶对体外发酵体系中ｐＨ值与产气量的影响
在发酵８与２４ｈ，酶剂量效应、酶剂量与处理时间互作效应显著影响发酵液ｐＨ值 （犘＜０．０５）（表４）。发酵
结束时，处理时间显著影响ｐＨ 值（犘＜０．０５）。产气量分析，酶量、处理时间显著影响４８ｈ累积产气量（犘＜
０．０５），但两者没有互作效应（犘＝０．９５４）。
８１３ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．１
表４ 纤维素水解酶对体外发酵体系中狆犎值与总产气量的影响
犜犪犫犾犲４ 犈犳犳犲犮狋狅犳狋犺犲犳犻犫狉狅犾狔狋犻犮犲狀狕狔犿犲狊狅狀狆犎狏犪犾狌犲犪狀犱犮狌犿狌犾犪狋犻狏犲犵犪狊狆狉狅犱狌犮狋犻狅狀犻狀狏犻狋狉狅
处理时间
Ｔｒｅａｔｅｄｔｉｍｅ（ｈ）
剂量
Ｄｏｓａｇｅ（ｍｇ／ｍＬ）
ｐＨ值ｐＨｖａｌｕｅ
０ｈ ８ｈ ２４ｈ ４８ｈ
４８ｈ产气量
Ｇａｓｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ４８ｈ（ｍＬ）
０ ０ ６．７５ ６．２４ｂ ５．５６ａ ５．４０ａｂ ２２２．６７ｃ
１０ ６．７６ ６．２１ｂ ５．５４ａｂ ５．４２ａｂ ２４１．６７ａ
５０ ６．７６ ６．２２ｂ ５．５５ａ ５．４３ａ ２３９．３３ａｂ
２４ ０ ６．７６ ６．２４ｂ ５．５６ａ ５．４１ａｂ ２１６．６７ｃ
１０ ６．７６ ６．３１ａ ５．５５ａ ５．３８ｂ ２３４．３３ｂ
５０ ６．７７ ６．１９ｂ ５．５２ｂ ５．３９ｂ ２３３．００ｂ
ＳＥＭ ０．０１ ０．０２ ０．０１ ０．０１ ２．２４
剂量Ｄｏｓａｇｅ（犘值Ｖａｌｕｅ） ０．７８８ ０．０２６ ０．０３５ ０．６９６ ０．０００
时间Ｔｉｍｅ（犘值Ｖａｌｕｅ） ０．３４３ ０．１３３ ０．１３６ ０．０４０ ０．００４
剂量×时间Ｄｏｓａｇｅ×ｔｉｍｅ（犘值Ｖａｌｕｅ） ０．５８１ ０．０１６ ０．０２７ ０．１４３ ０．９５４
３ 讨论
３．１ 外源酶制剂对体外瘤胃发酵酶活的影响
在反刍动物日粮中添加外源酶制剂能够增加饲料消化率和动物生产性能［１３１５］。外源酶制剂作用机理归类为
３个方面：首先，采食前外源酶预处理饲料以增加底物消化率［１６］；其次，在瘤胃内外源酶直接或间接与瘤胃微生物
协同作用分解饲料底物［５］；第三，外源酶增强后段消化道的消化能力［１７］。在反刍动物应用中，外源酶无论通过何
种作用途径产生效果，其关键点是外源酶能否抵抗瘤胃微生物降解。本研究发现，羊草经过０或２４ｈ混合酶处
理后与瘤胃液共培养，在起始点，添加外源酶能显著增加培养液中木聚糖酶、内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶活性，
且效果与酶添加量、处理时间相关（犘＜０．０５）。培养至８ｈ，添加高剂量外源酶分别提高发酵液木聚糖酶与内切
葡聚糖酶活性６５％与２０％，结果与在生长母牛瘤胃中直接投放多糖酶分别提高瘤胃内木聚糖酶与内切葡聚酶活
性６７％与２０％［１８］以及绵羊瘤胃液中内切葡聚酶活性５１％与木聚糖酶活性３４％［１９］结果基本一致。随着发酵时
间延长（２４或４８ｈ），外源酶作用效应消失。试验结果与Ｃｏｌｏｍｂａｔｔｏ等［２０］发现的外源酶能增加早期（前６ｈ）体外
发酵液中木聚糖酶、内切葡聚糖酶及βＤ葡聚糖苷酶活性，但不能提高４８ｈ酶活性结果一致。综合分析认为，在
培养起始阶段，由于添加外源酶，培养体系中葡聚糖酶与木聚糖酶瞬间得到提高；当培养到８ｈ，添加外源酶也能
增加培养体系纤维水解酶活性，这说明本次使用的外源酶制剂在一定时间内能抵抗微生物降解并保持活性。前
人试验证明木聚糖酶能够抵抗蛋白酶的水解［２１］，纤维水解酶不被瘤胃微生物降解失活［２２２４］。因此，本试验结果
与上述研究基本一致。除纤维水解酶外，外源蛋白酶也能增加瘤胃内木聚糖酶与内切葡聚糖酶活性，增加纤维素
在瘤胃中降解［２５］。由此可以得出，外源酶在反刍动物中应用是可行的。
３．２ 外源酶制剂对体外瘤胃发酵挥发性脂肪酸含量的影响
为了获得有效的饲料消化率，在动物采食前将饲料与酶进行预处理是必要的，但并非是必须的。Ｌｅｗｉｓ
等［１６］试验表明，外源纤维水解酶无论是采食前２４ｈ还是０ｈ处理粗饲料，整个消化道干物质、中性洗涤纤维与酸
性洗涤纤维消化率均显著提高。在采食后１６ｈ，酶处理组瘤胃液中总挥发性脂肪酸含量显著高于无酶组，但与
酶处理时间关系不大。有人认为酶与饲料可形成一个稳定的酶－饲料复合体［７］，改变植物纤维结构［２６］，继而释
放更多的还原糖，有利于增加奶牛瘤胃中纤维二糖利用菌、木聚糖水解菌以及淀粉水解菌的数量［２７］，最终影响瘤
胃发酵与产物的生成。Ｋｒｚｙｓｚｔｏｆ和 Ｍａｇｄａｌｅｎａ［２８］报道纤维水解酶能提高奶牛瘤胃液ＴＶＦＡ含量以及不同组分
脂肪含量，但对乙酸丙酸比及各类型脂肪酸占总脂肪酸比例没有影响。Ｇｉｒａｌｄｏ等［２９］体外试验表明外源酶能显
著增加瘤胃中ＶＦＡ产量（犘＜０．０５），其中乙酸占到增加量５０％。而Ｇｉｒａｌｄｏ等［１９］研究发现直接投饲外源纤维素
酶并不影响绵羊瘤胃液中ＴＶＦＡ量，但是显著提高丙酸的摩尔比例，降低乙酸与丙酸比（犘＜０．０５）。综合体内
９１３第２２卷第１期 草业学报２０１３年
试验［１８，３０，３１］与体外试验［３２］研究结果，纤维水解酶对不同类型饲料可产生不同的ＶＦＡ摩尔比例，日粮特性以及外
源酶的类型均能影响瘤胃发酵类型。本研究发现，外源酶添加剂量直接影响培养液中ＶＦＡ生成量，显著影响２４
与４８ｈ发酵液中乙酸生成量及８，２４与４８ｈＴＶＦＡ生成量（犘＜０．０５），而ＶＦＡ产量与酶处理时间关系不大。结
果提示外源酶对乙酸的生成量影响程度远高于对丙酸与丁酸生成程度，而对戊酸与异戊酸的含量没有影响。分
析原因这可能是添加外源酶后，增加前期发酵液中木聚糖酶与内切葡聚糖酶活性，有利于底物中半纤维素与纤维
素的水解，从而增加了乙酸菌生长所需的底物，断而增加乙酸产量。但是能否增加培养体系中乙酸菌数量还需进
一步研究。从培养液ｐＨ值变化情况可知，ｐＨ值下降与培养液中ＶＦＡ含量增加同步。
除酶活性与ＶＦＡ产量等指标外，产气量则是体外发酵程度的另一个重要指标。Ｗａｌａｃｅ等［３３］评价了２种商
业纤维水解酶与瘤胃液共培养对玉米青贮与牧草青贮发酵特性的影响，结果显示，在前８ｈ发酵期，外源酶线性
地增加产气量。Ｔａｎｇ等［３４］试验表明纤维水解酶与酵母发酵物能够改善谷物秸秆的发酵过程，酵母培养物显著
地增加累积产气量，纤维水解酶则倾向增加累积产气量。本试验结果也表明，添加外源酶能够显著地提高最终累
积产气量，且产气量与外源酶添加剂量呈显著相关。结合酶活性与ＶＦＡ产量结果分析，可以推测由于外源纤维
水解酶添加增加培养液中纤维水解酶活性，从而加速底物的水解速度，继而增加培养液中还原糖生成量，这为瘤
胃微生物提供更好营养源，最终结果是增加了培养体系中总ＶＦＡ产量。
４ 结论
用外源纤维水解酶处理羊草后与瘤胃液共培养能够显著地提高发酵早期（前８ｈ）反应体系中木聚糖酶、内
切葡聚糖酶与外切葡聚糖酶活性，提高反应体系中ＶＦＡ产量以及改善瘤胃发酵特性。
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犮犺狅犱犲狉犿犪犾狅狀犵犻犫狉犪犮犺犻犪狋狌犿［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＤａｉｒｙＳｃｉｅｎｃｅ，２０００，８３（６）：１３１０１３２１．
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ｌｏｓｅａｎｄｘｙｌａｎｍｉｘｅｄｒｕｍｉｎａｌｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ犻狀狏犻狋狉狅［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅ，２００３，８１（４）：１０４０１０５０．
［２１］ ＦｏｎｔｅｓＣＭ，ＨａｌＪＧＡ，ＨｉｒｓｔＢＨ，犲狋犪犾．Ｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｃｅｌｕｌａｓｅｓａｎｄｘｙｌａｎａｓｅｓｔｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ
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犮犺犻犪狋狌犿ｏｎｔｈｅｒｕｍｅｎｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｏｆｄａｉｒｙｃｏｗｓ［Ｊ］．ＣａｎａｄｉａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，４８（１）：１４２０．
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ｄｉｇｅｓｔｉｂｉｌｉｔｙｏｆａｌｆａｌｆａａｎｄｒｙｅｇｒａｓｓｈａｙｆｅｄｔｏｌａｍｂｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅ，２００２，８０（１１）：３０１６３０２０．
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３２５３３２．
［３３］ ＷａｌａｃｅＲＪ，ＷａｌａｃｅＳＪＡ，ＭｃＫａｉｎＮ，犲狋犪犾．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙｆｉｂｒｏｌｙｔｉｃｅｎｚｙｍｅｓｏｎｔｈｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｆｃｏｒｎａｎｄ
ｇｒａｓｓｓｉｌａｇｅｓｂｙｍｉｘｅｄｒｕｍｉｎａｌｍｉｃｒｉｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ犻狀狏犻狋狉狅［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅ，２００１，７９（７）：１９０５１９１６．
［３４］ ＴａｎｇＳＸ，ＹａｙｏＧＯ，ＴａｍＺＬ，犲狋犪犾．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｙｅａｓｔｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｆｉｂｒｏｌｙｔｉｃｅｎｚｙｍｅｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｎ犻狀狏犻狋狉狅ｆｅｒｍｅｎｔａ
ｔｉｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｏｆｌｏｗｑｕａｌｉｔｙｃｅｒｅａｌｓｔｒａｗｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅ，２００８，８６（５）：１１６４１１７２．
１２３第２２卷第１期 草业学报２０１３年
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ＺＨＵＡＮＧＳｕ，ＤＩＮＧＬｉｒｅｎ，ＺＨＯＵＪｉａｎｇｕｏ，ＷＡＮＧＴｉａｎ
（ＣｏｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＮａｎｊｉｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００９５，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｔｈｒｅｅｌｅｖｅｌｓｏｆｍｉｘｔｕｒｅｏｆｃｅｌｕｌａｓｅａｎｄｘｙｌａｎａｓｅｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ（０，１０．０ａｎｄ５０．０ｍｇ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅ
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犓犲狔狑狅狉犱狊：ｃｅｌｕｌａｓｅ；ｘｙｌａｎａｓｅ；ｖｏｌａｔｉｌｅｆａｔｔｙａｃｉｄｓ；犻狀狏犻狋狉狅
２２３ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．１