全 文 ：书云南猪屎豆属遗传多样性的犐犛犛犚分析
刘忠辉１，刘国道２，黄必志３，罗富成１
（１．云南农业大学草业科学系，云南 昆明６５０２０１；２．中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，
海南 儋州５７１７３７；３．云南省草地动物科学研究院，云南 小哨６５０２１２）
摘要：以云南４１份野生猪屎豆属种质为材料，用ＩＳＳＲ进行分析，结果表明，１００个ＩＳＳＲ引物中共筛选出１６个多
态性明显、反应稳定的引物，４１份材料ＤＮＡ共扩增出１６４条条带，平均每个引物的扩增条带数为１０．３条，其中多
态性条带总数为１５９条，多态性比率为９９．３％。材料间遗传相似系数范围在０．４８１７～１．００００，表现出丰富的遗传
多样性；通过正交设计优化，得出适合猪屎豆属野生植物的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系为：４０ｎｇ模板ＤＮＡ、引物０．２
μｍｏｌ／Ｌ、２００μｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ、１×Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ
２＋ ｐｌｕｓ）、０．５ＵＴａｑ酶（ＴａＫａＲａ）；ＩＳＳＲ引物最佳退火温度为５０或
５３℃；通过聚类分析，可将４１份猪屎豆属种质分为５大类，同一种的种质可以很好的聚成一类；通过对思茅猪屎豆
ＩＳＳＲ鉴定，得出它与猪屎豆属的遗传相似系数接近，然而确定该物种属于猪屎豆属需要做更多的鉴定。
关键词：猪屎豆属；ＩＳＳＲ；遗传多样性分析
中图分类号：Ｑ９４３　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２００９）０５０１８４０８
　 猪屎豆属（犆狉狅狋犪犾犪狉犻犪）是蝶形花科中的一个大属，草本，亚灌木或灌木。约５５０种，分布于美洲、非洲、大洋洲
及亚洲热带、亚热带地区，我国产４０种３变种［１］，云南有２７种（包括外来４种）［２］。猪屎豆植物可用来做纤维原
料［３］，固氮绿肥和覆盖植物［４］及装饰物［５］，不少种类可供药用和工业应用［６］；一些猪屎豆属植物还可做牛，马，兔
的饲料［７，８］，用于公路（矿山、堤坝）边坡水土保持及生态恢复工程［９］。但是直到现在人们对这个属植物的潜在的
经济价值、进化分类学上的重要意义和种间的关系还是知之甚少。
ＩＳＳＲ（ｉｎｔｅｒｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔｓ，简单序列重复区间扩增多态性）是由Ｚｉｅｔｋｉｅｗｉｃｚ等［１０］于１９９４年提出
的一种以ＰＣＲ（多聚酶链反应，ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）扩增为基础的分子标记技术，采用１７～２２碱基的重
复锚定引物扩增重复序列之间的片段。ＩＳＳＲ标记使用比 ＲＡＰＤ（随机扩增多态性 ＤＮＡ ，ｒａｎｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ）引物更长的引物，克服了ＲＡＰＤ标记稳定性和重复性差等缺点，操作简单，重复性好，多态性
丰富。目前，ＩＳＳＲ标记技术已被广泛应用于品种鉴定［１１］、多样性分析［１２，１３］、指纹图谱的构建［１４］等研究中。
在国内外猪屎豆属植物分子研究很少，它的ＩＳＳＲ研究还未见报道。Ｗａｎｇ等［１５］运用ＥＳＴ－ＳＳＲ（表达序列
标签－简单重复序列，ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇ－ｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ）分子标记结合形态学对从美国农业部、
植物基因资源保存所等４个机构得到的２６份猪屎豆属材料进行了研究，发现了３个材料在分类上出现了严重的
错误。本研究应用ＩＳＳＲ标记，从分子水平上探讨了４１份云南野生猪屎豆属资源的遗传多样性与亲缘关系，为
有效利用ＤＮＡ标记评价猪屎豆属种质资源亲缘关系，合理保护利用资源提供理论依据，也为猪屎豆属指纹图谱
的构建奠定了基础。
１　材料与方法
１．１　材料
材料均由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所收集和提供（表１）。
１．２　ＤＮＡ提取
先将试验种子用６０℃水浴处理５ｍｉｎ，然后把这些处理过的种子种在热带作物品种资源研究所牧草基地的
温室中，待其长出３～４片叶时，取叶放入冰盒带回实验室备用。ＤＮＡ用ＴａＫａＲａ的 ＵｎｉｖｅｒｓａｌｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ
ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔｖｅｒ．３．０提取。
１８４－１９１
２００９年１０月
　　　草　业　学　报　　　
　　　ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ　　　
第１８卷　第５期
Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．５
 收稿日期：２００８１２０８；改回日期：２００８１２２９
作者简介：刘忠辉（１９８３），男，河北邯郸人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：ｈｅｒｏｚｅｒｒｏ２００２＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｈｂｚ＠ｙｎｂｐ．ｃｎ
表１　云南猪屎豆属材料编号及来源
犜犪犫犾犲１　犛犪犿狆犾犲犱犾狅犮犪狋犻狅狀狊犪狀犱犺犪犫犻狋犪狀狋狅犳犆狉狅狋犪犾犪狉犻犪犻狀犢狌狀狀犪狀
序号
Ｎｏ．
编号
Ｃｏｄｅ
种名
Ｌａｔｉｎｎａｍｅ
采集地点
Ｃｏｌｅｃｔｉｏｎｌｏｃａｔｉｏｎ
海拔
Ａｌｔｉｔｕｄｅ（ｍ）
１ ０５０２２７３２５ 猪屎豆犆．犿狌犮狉狅狀犪狋犪 云南勐海县勐遮乡 ＭｅｎｇｚｈｅｔｏｗｎＭｅｎｇｈａｉｃｏｕｎｔｙＹｕｎｎａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ １１９２．０
２ ０４０３０１０２７ 猪屎豆犆．犿狌犮狉狅狀犪狋犪 云南保山龙陵ＬｏｎｇｌｉｎｇｃｏｕｎｔｙＢａｏｓｈａｎｃｉｔｙＹｕｎｎａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ ７９９．０
３ ０５０２１７０２７ 猪屎豆犆．犿狌犮狉狅狀犪狋犪 云南保山潞江坝ＬｕｊｉａｎｇｂａＢａｏｓｈａｎｃｉｔｙＹｕｎｎａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ ８８５．２
４ ０５０２２５２７２ 猪屎豆犆．犿狌犮狉狅狀犪狋犪 云南沧源县２１４国道小黑江Ｘｉａｏｈｅｉｒｉｖｅｒｎａｔｉｏｎａｌｒｏａｄ２１４ＣａｎｇｙｕａｎｃｏｕｎｔｙＹｕｎ
ｎａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ
８５３．０
５ ０５０２２２１７２ 猪屎豆犆．犿狌犮狉狅狀犪狋犪 云南德宏潞西市ＬｕｘｉｃｉｔｙＤｅｈｏｎｇｓｔａｔｅＹｕｎｎａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ ８６２．９
６ ０７０３１２０３９ 猪屎豆犆．犿狌犮狉狅狀犪狋犪 云南隆林县旧州城ＪｉｕｚｈｏｕｔｏｗｎＬｏｎｇｌｉｎｃｏｕｎｔｙＹｕｎｎａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ ５３８．１
７ ０５０２１９１１０ 猪屎豆犆．犿狌犮狉狅狀犪狋犪 云南芒市旧城镇ＪｉｕｔｏｗｎＭａｎｇｃｉｔｙＹｕｎｎａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ ９０２．６
８ ０６０４０２００７ 猪屎豆犆．犿狌犮狉狅狀犪狋犪 云南思茅地区２１３国道Ｎａｔｉｏｎａｌｒｏａｄ２１３ＳｉｍａｏｃｉｔｙＹｕｎｎａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ １５２０．０
９ ０５０２２１１４５ 猪屎豆犆．犿狌犮狉狅狀犪狋犪 云南盈江县姐冒乡ＪｉｅｍａｏｔｏｗｎＹｉｎｇｊｉａｎｇｃｏｕｎｔｙＹｕｎｎａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ ８１５．１
１０ ０５０２２２１７７ 针状野百合犆．犪犮犻犮犻犾犪狉犻狊 云南德宏潞西市ＬｕｘｉｃｉｔｙＤｅｈｏｎｇｓｔａｔｅＹｕｎｎａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ ９４４．６
１１ ０６０４０３０１２ 响铃豆犆．犪犾犫犻犱犪 云南元江ＹｕａｎｊｉａｎｇｃｏｕｎｔｙＹｕｎｎａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ １５８７．０
１２ ０５０２２３１９９ 假地蓝犆．犳犲狉狉狌犵犻狀犲犪 云南龙陵县苏帕河ＳｕｐａｒｉｖｅｒＬｏｎｇｌｉｎｇｃｏｕｎｔｙＹｕｎｎａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ １１９７．０
１３ ０５０２２３２０８ 四棱猪屎豆犆．狋犲狋狉犪犵狅狀犪 云南保山龙陵勐糯 ＭｅｎｇｒｕｔｏｗｎＬｏｎｇｌｉｎｇｃｏｕｎｔｙＢａｏｓｈａｎｃｉｔｙＹｕｎｎａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ ６０４．８
１４ ０６０３３００４２ 四棱猪屎豆犆．狋犲狋狉犪犵狅狀犪 云南景洪勐腊县 ＭｅｎｇｌａｃｏｕｎｔｙＪｉｎｇｈｏｎｇｃｉｔｙＹｕｎｎａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ ９７３．０
１５ ０５０２２７３５４ 四棱猪屎豆犆．狋犲狋狉犪犵狅狀犪 云南景洪市ＪｉｎｇｈｏｎｇｃｉｔｙＹｕｎｎａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ ５８４．７
１６ ０５０３０３４６０ 四棱猪屎豆犆．狋犲狋狉犪犵狅狀犪 云南玉元高速２１３国道Ｎａｔｉｏｎａｌｒｏａｄ２１３ＹｕｙｕａｎｈｉｇｈｗａｙＪｉｎｇｈｏｎｇｃｉｔｙＹｕｎｎａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ１２２２．０
１７ ０５０３０１４２０ 响铃豆犆．犪犾犫犻犱犪 云南景洪普文ＰｕｗｅｎｃｏｕｎｔｙＪｉｎｇｈｏｎｇｃｉｔｙＹｕｎｎａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ ９０４．０
１８ ０６０３２６０１９ 三尖叶猪屎豆犆．犪狀犪犵狔狉狅犻犱犲狊 云南思茅ＳｉｍａｏｃｉｔｙＹｕｎｎａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ １４２８．０
１９ ０６０３３００２８ 毛果猪屎豆犆．犫狉犪犮狋犪犲犪狋犪 云南景洪县勐腊镇 ＭｅｎｇｌａｔｏｗｎＪｉｎｇｈｏｎｇｃｏｕｎｔｙＹｕｎｎａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ ８１７．９
２０ ０５０２２７３３９ 假地蓝犆．犳犲狉狉狌犵犻狀犲犪 云南勐海县 ＭｅｎｇｈａｉｃｏｕｎｔｙＹｕｎｎａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ １１６８．０
２１ ０５０２１６０２１ 假地蓝犆．犳犲狉狉狌犵犻狀犲犪 云南保山市ＢａｏｓｈａｎｃｉｔｙＹｕｎｎａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ １７４７．０
２２ ０７０３０３０２７ 假地蓝犆．犳犲狉狉狌犵犻狀犲犪 云南河口瑶族自治县 ＨｅｋｏｕＹａｏａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｃｏｕｎｔｙＹｕｎｎａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ １２１．６
２３ ０６０４０１０２６ 假地蓝犆．犳犲狉狉狌犵犻狀犲犪 云南景洪普文镇ＰｕｗｅｎｔｏｗｎＪｉｎｇｈｏｎｇｃｉｔｙＹｕｎｎａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ ９０９．０
２４ ０５０２２３１９７ 假地蓝犆．犳犲狉狉狌犵犻狀犲犪 云南龙陵县苏帕河ＳｕｐａｒｉｖｅｒＬｏｎｇｌｉｎｇｃｏｕｎｔｙＹｕｎｎａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ １１９７．０
２５ ０５０２１９１１５ 三尖叶猪屎豆犆．犪狀犪犵狔狉狅犻犱犲狊 云南芒市旧城镇ＪｉｕｔｏｗｎＭａｎｇｃｉｔｙＹｕｎｎａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ ９０２．６
２６ ０５０２２３２４４ 假地蓝犆．犳犲狉狉狌犵犻狀犲犪 云南镇康勐棒镇 ＭｅｎｇｂａｎｇｔｏｗｎＺｈｅｎｋａｎｇｃｏｕｎｔｙＹｕｎｎａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ １２７７．０
２７ ０５０２２８３８５ 光萼猪屎豆犆．狌狊犪狉犪犿狅犲狀狊犻狊 云南西双版纳勐仑镇 ＭｅｎｇｌｕｎｔｏｗｎＸｉｓｈｕａｎｇｂａｎｎａＹｕｎｎａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ ５４０．３
２８ ０６０４０１０１１ 光萼猪屎豆犆．狌狊犪狉犪犿狅犲狀狊犻狊 云南景洪勐养镇 ＭｅｎｇｙａｎｇｔｏｗｎＪｉｎｇｈｏｎｇｃｉｔｙＹｕｎｎａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ ７８５．８
２９ ０５０２２４２５４ 光萼猪屎豆犆．狌狊犪狉犪犿狅犲狀狊犻狊 云南永德县勐永镇 ＭｅｎｇｙｏｎｇｔｏｗｎＹｏｎｇｄｅｃｏｕｎｔｙＹｕｎｎａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ ９９７．５
３０ ０６０４０１０４８ 大猪屎豆犆．犪狊狊犪犿犻犮犪 云南思茅ＳｉｍａｏｃｉｔｙＹｕｎｎａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ １００１．０
３１ ０５０２２１１５８ 大猪屎豆犆．犪狊狊犪犿犻犮犪 云南陇川县章风镇ＺｈａｎｇｆｅｎｇｔｏｗｎＬｏｎｇｃｈｕａｎｃｏｕｎｔｙＹｕｎｎａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ ９６８．１
３２ ０５０２２７３３０ 大猪屎豆犆．犪狊狊犪犿犻犮犪 云南勐海县城 ＭｅｎｇｈａｉｃｏｕｎｔｙＹｕｎｎａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ １１７０．０
３３ ０５０３０３４６２ 大猪屎豆犆．犪狊狊犪犿犻犮犪 云南玉元高速２１３国道Ｎａｔｉｏｎａｌｒｏａｄ２１３ＹｕｙｕａｎｈｉｇｈｗａｙＪｉｎｇｈｏｎｇｃｉｔｙＹｕｎｎａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ１２４６．０
３４ ０５０２２０１４１ 大猪屎豆犆．犪狊狊犪犿犻犮犪 云南盈江县榕树王景区ＲｏｎｇｓｈｕｗａｎｇｓｃｅｎｉｃｓｐｏｔＹｕｎｎａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ ９１８．３
３５ ０６０３３００２４ 大猪屎豆犆．犪狊狊犪犿犻犮犪 云南景洪县勐腊镇 ＭｅｎｇｌａｔｏｗｎＪｉｎｇｈｏｎｇｃｏｕｎｔｙＹｕｎｎａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ ８１７．９
３６ ０５０２２４２５７ 大猪屎豆犆．犪狊狊犪犿犻犮犪 云南永德县勐永镇 ＭｅｎｇｙｏｎｇｔｏｗｎＹｏｎｇｄｅｃｏｕｎｔｙＹｕｎｎａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ ９９７．５
３７ ０５０２２３２１３ 翅托叶猪屎豆犆．犪犾犪狋犪 云南镇康怒江大桥ＴｈｅｂｒｉｄｇｅｏｆＮｕｊｉａｎｇｒｉｖｅｒＺｈｅｎｋａｎｇｃｏｕｎｔｙＹｕｎｎａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ ６８９．３
３８ ０５０２２２１７３ 长果猪屎豆犆．犾犪狀犮犲狅犾犪狋犪 云南德宏潞西市ＬｕｘｉｃｉｔｙＤｅｈｏｎｇｓｔａｔｅＹｕｎｎａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ ８６２．９
３９ ０５０２２８３８０ 长萼猪屎豆犆．犮犪犾狔犮犻狀犪 云南２１３国道Ｎａｔｉｏｎａｌｒｏａｄ２１３Ｙｕｎｎａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ ７４６．３
４０ ０５０２２４２５５ 头花猪屎豆犆狉狅狋犪犾犪狉犻犪ｓｐｐ． 云南永德县勐永镇 ＭｅｎｇｙｏｎｇｔｏｗｎＹｏｎｇｄｅｃｏｕｎｔｙＹｕｎｎａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ ９９７．５
４１ ０５０２２６２９９ 思茅猪屎豆犆．狊狕犲犿狅犲狀狊犻狊 云南勐海２１４国道Ｎａｔｉｏｎａｌｒｏａｄ２１４ＭｅｎｇｈａｉｃｏｕｎｔｙＹｕｎｎａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ １０５２．０
５８１第１８卷第５期 草业学报２００９年
１．３　ＩＳＳＲ反应体系的建立及优化
试验采用２０μＬ体系，对影响ＩＳＳＲ的因素进行了正交设计研究
［１６，１７］。ＤＮＡ模板量为１０，４０，７０，１００ｎｇ；
Ｔａｑ酶为０．５，１．０，１．５，２．０Ｕ；ｄＮＴＰ浓度为１００，１５０，２００，２５０μｍｏｌ／Ｌ；引物浓度０．０５，０．２０，０．３５，０．５０
μｍｏｌ／Ｌ；１０×ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ
２＋ｐｌｕｓ，１５ｍｍｏｌ／Ｌ）２μＬ。Ｔａｑ酶、ｄＮＴＰ、１０×ｂｕｆｆｅｒ均购自大连宝生物公司（ＴａＫａ
Ｒａ）。
ＰＣＲ反应程序如下。第１步：９４℃，５ｍｉｎ，１个循环。第２步：９４℃，４５ｓ，一个特定退火温度１ｍｉｎ，７２℃，
９０ｓ共３８个循环。第３步：７２℃，７ｍｉｎ，然后在４℃保存。
１．４　猪屎豆属ＩＳＳＲ引物的筛选和引物退火温度的梯度优化
引物参照加拿大哥伦比亚大学（ＵＢＣ）公布的１００条ＩＳＳＲ引物序列，由上海英俊生物有限公司合成。每个
引物取少量稀释成１０ｐｍｏｌ／μＬ，用６，１４，３５号３份材料的ＤＮＡ作为模板，在１００个引物中筛选出多态性高的引
物，再对全部材料进行ＰＣＲ扩增。
用５０，５３，５７，６０℃４个温度梯度对筛选的引物进行引物退火温度的优化。
１．５　ＰＣＲ扩增及电泳
ＰＣＲ扩增在ＴａＫａＲａＰＣＲｔｈｅｒｍａｌｃｙｃｌｅｒｄｉｃｅ上进行。ＰＣＲ反应结束后向扩增产物中加入４μＬ的６×
ｌｏａｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ（６倍的上样缓冲液），用１．５％的琼脂糖凝胶电泳，凝胶中溴化乙锭浓度为０．５μｇ／ｍＬ，用１２０Ｖ电
压电泳１ｈ后，用Ｕｖｉｄｏｃ凝胶成像系统对凝胶板检测并照相分析。
１．６　数据统计
对ＩＳＳＲ引物在４１份猪屎豆材料中扩增的多态性条带，在相同迁移位置有带记为１，无带记为０，依此构成原
始数据矩阵。参照Ｎｅｉ－Ｌｉ相似系数公式［１８］，犛狀＝２犖犪犫／（犖犪＋犖犫），其中，犛狀指相似性系数，犖犪表示样品犃 具
有的总带数，犖犫表示样品犅 具有的总带数，犖犪犫表示样品Ａ和Ｂ共有的条带数。利用ＮＴＳＹＳ－ＰＣ２．１０软件
计算Ｄｉｃｅ遗传相似系数，根据ＵＰＧＭＡ法 （ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄｐａｉｒｇｒｏｕｐｍｅｔｈｏｄａｒｉｔｈｍｅｔｉｃａｖｅｒａｇｅｓ）进行聚类分析。
２　结果与分析
２．１　猪屎豆属ＩＳＳＲ体系的优化
通过正交设计，得出适合猪屎豆ＩＳＳＲ扩增的反应体系。ＰＣＲ反应体系为２０μＬ，其中包含４０ｎｇ模板
ＤＮＡ、引物０．２μｍｏｌ／Ｌ、２００μｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ、１×Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ
２＋ｐｌｕｓ）、０．５ＵＴａｑ酶（ＴａＫａＲａ）。
２．２　筛选引物和引物退火温度优化
从１００条引物中共筛选出１６条多态性好、条带清晰的引物，这１６条引物的最佳退火温度是５０或５３℃（表
２）。
表２　用于猪屎豆属犐犛犛犚分析的引物序列及退火温度
犜犪犫犾犲２　犘狉犻犿犲狉狊犲狇狌犲狀犮犲狊犪狀犱犪狀狀犲犪犾犻狀犵狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲狌狊犲犱犻狀犐犛犛犚犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犆狉狅狋犪犾犪狉犻犪
引物代号
Ｐｒｉｍｅｒｃｏｄｅ
引物序列（５′３′）
Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ
退火温度
Ａｎｎｅａｌｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（℃）
引物代号
Ｐｒｉｍｅｒｃｏｄｅ
引物序列（５′３′）
Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ
退火温度
Ａｎｎｅａｌｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（℃）
８０８ （ＡＧ）８Ｃ ５３ ８４８ （ＣＡ）８ＲＧ ５０
８１１ （ＧＡ）８Ｃ ５０ ８４９ （ＧＴ）８ＹＡ ５３
８１４ （ＣＴ）８Ａ ５０ ８５０ （ＧＴ）８ＹＣ ５０
８２７ （ＡＣ）８Ｇ ５０ ８５３ （ＴＣ）８ＲＴ ５０
８３４ （ＡＧ）８ＹＴ ５３ ８５５ （ＡＣ）８ＹＴ ５３
８３５ （ＡＧ）８ＹＣ ５０ ８５６ （ＡＣ）８ＹＡ ５０
８４６ （ＣＡ）８ＲＴ ５０ ８５７ （ＡＣ）８ＹＧ ５０
８４７ （ＣＡ）８ＲＣ ５３ ８６４ （ＡＴＧ）６ ５０
　Ｒ＝（Ａ，Ｇ）；Ｙ＝（Ｃ，Ｔ）
６８１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．５
２．３　ＩＳＳＲ扩增结果及多态性分析
筛选出的１６条引物都能对４１份猪屎豆属材料扩增出很好的条带（图１）。１６个引物共扩增出１６４条带，平
均每个引物的扩增条带数为１０．３条，其中多态性条带总数为１５９条，平均每个引物能扩增出９．９条，引物的平均
多态性比率为９９．３％（表３）。扩增片段大小主要在２５０～２０００ｂｐ。不同引物扩增出来的片段数不同，其中最多
能得到１４条清晰带（８０８），最少有７条（８５３）；这１６条引物全部是二核苷酸重复序列类型的引物，其中（ＡＧ）ｎ有
３条，（ＡＣ）ｎ有４条，（ＣＡ）ｎ有３条，（ＧＴ）ｎ有２条，说明猪屎豆属基因组中存在大量的（ＡＧ）、（ＡＣ）、（ＣＡ）二核
苷酸重复序列。结果表明猪屎豆属种质间的遗传多样性十分丰富，利用ＩＳＳＲ分子标记可以检测猪屎豆属种质
间的亲缘关系，其引物最好选二核苷酸重复序列类型的引物。
图１　８６４号引物对４１份猪屎豆属材料犇犖犃的犐犛犛犚扩增图谱
犉犻犵．１　犐犛犛犚犳犻狀犵犲狉狆狉犻狀狋犪犿狆犾犻犳犻犲犱狑犻狋犺狆狉犻犿犲狉犖狅．８６４犻狀４１犇犖犃狅犳犆狉狅狋犪犾犪狉犻犪
Ｍ：ＤＬ２０００ＤＮＡ标记ＤＮＡｍａｒｋｅｒ
２．４　遗传相似性分析
利用ＮＴＳＹＳ软件计算出４１份猪屎豆属材料间
Ｎｅｉ－Ｌｉ相似系数（ＧＳ），得到供试材料相似性矩阵（表
４，５）。猪屎豆属的ＧＳ值在０．４８１７～１．００００，平均
ＧＳ值为０．６５３。由相似系数矩阵可以看出，在４１份
猪屎豆属材料中，１９号与所有其他猪屎豆属材料的遗
传相似系数均小于平均值０．６５３，其遗传距离均较大，
遗传相似性较小，而遗传系数最小的是１５号与４１号，
为０．４８１７，即１５号与４１号的亲缘关系最小。遗传相
似性分析可知，种间有较大的遗传差异性和种内遗传
相似性，再次表明，云南野生猪屎豆属植物有非常丰富
的遗传多样性。
２．５　聚类分析
进一步采用 ＵＰＧＭＡ法对猪屎豆属材料进行聚
类分析（图２）。在ＧＳ＝０．６０处，可把４１份猪屎豆属
植物聚为５个类。其中１９号（毛果猪屎豆）与其余材
料差异非常明显，单独聚为一类（Ⅳ类）；１号（猪屎
豆）、３号（猪屎豆）、５号（猪屎豆）、６号（猪屎豆）、７号
（猪屎豆）、８号（猪屎豆）、４号（猪屎豆）、９号（猪屎
豆）、２号（猪屎豆）、１０号（针状野百合）聚为一类（Ⅴ
类）；第Ⅲ类是包含种质资源最多的，有２２份，包括１２
表３　猪屎豆属犐犛犛犚标记的多态性分析
犜犪犫犾犲３　犘狅犾狔犿狅狉狆犺犻狊犿犪狀犪犾狔狊犻狊犳狅狉犫犪狀犱犻狀犵狆犪狋狋犲狉狀狊犪犿狆犾犻犳犻犲犱
狅犳犆狉狅狋犪犾犪狉犻犪犫狔犱犻犳犳犲狉犲狀狋犐犛犛犚狆狉犻犿犲狉狊
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
扩增总条带
Ｔｏｔａｌｎｕｍｂｅｒｓｏｆ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ
ｂａｎｄｓ
多态性条带数
Ｎｕｍｂｅｒｓｏｆ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ
ｂａｎｄｓ
多态性比率
Ｔｈｅｐｅｒｃｅｎｔｏｆ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ
ｂａｎｄｓ（％）
８０８ １４ １４ １００．０
８１１ １１ １１ １００．０
８１４ ９ ８ ８８．９
８２７ ９ ９ １００．０
８３４ １０ １０ １００．０
８３５ １０ １０ １００．０
８４６ １１ １１ １００．０
８４７ ９ ８ ８８．９
８４８ １０ １０ １００．０
８４９ １１ １１ １００．０
８５０ ８ ８ １００．０
８５３ ７ ６ ８５．７
８５５ １２ １２ １００．０
８５６ ９ ７ ７７．８
８５７ １２ １２ １００．０
８６４ １２ １２ １００．０
合计Ｓｕｍ １６４ １５９
平均 Ｍｅａｎ １０．３ ９．９ ９９．３
７８１第１８卷第５期 草业学报２００９年
表４　４１份猪屎豆属种质的遗传相似系数矩阵－１
犜犪犫犾犲４　犌犲狀犲狋犻犮狊犻犿犻犾犪狉犻狋狔犿犪狋狉犻狓犫犪狊犲犱狅狀犐犛犛犚狆狅犾狔犿狅狉狆犺犻狊犿犪犿狅狀犵４１犆狉狅狋犪犾犪狉犻犪犵犲狉犿狆犾犪狊犿狊－１
　号Ｎｏ．１ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０ １１ １２ １３ １４ １５ １６ １７ １８ １９ ２０
１ １．００００
２ ０．８５９８１．００００
３ １．０００００．８５９８１．００００
４ ０．９９３９０．８５３７０．９９３９１．００００
５ １．０００００．８５９８１．０００００．９９３９１．００００
６ １．０００００．８５９８１．０００００．９９３９１．００００１．００００
７ １．０００００．８５９８１．０００００．９９３９１．００００１．００００１．００００
８ １．０００００．８５９８１．０００００．９９３９１．００００１．００００１．００００１．００００
９ ０．９７５６０．８５９８０．９７５６０．９６９５０．９７５６０．９７５６０．９７５６０．９７５６１．００００
１００．６２８００．６２２００．６２８００．６２２００．６２８００．６２８００．６２８００．６２８００．６１５９１．００００
１１０．５７９３０．５７３２０．５７９３０．５７３２０．５７９３０．５７９３０．５７９３０．５７９３０．５７９３０．６０９８１．００００
１２０．５４２７０．５４８８０．５４２７０．５３６６０．５４２７０．５４２７０．５４２７０．５４２７０．５３０５０．５８５４０．６２２０１．００００
１３０．５６７１０．５８５４０．５６７１０．５７３２０．５６７１０．５６７１０．５６７１０．５６７１０．５５４９０．５７３２０．６３４１０．６０９８１．００００
１４０．５６１００．５９１５０．５６１００．５６７１０．５６１００．５６１００．５６１００．５６１００．５４８８０．５６７１０．６２８００．６０３７０．９９３９１．００００
１５０．５６７１０．５９１５０．５６７１０．５７３２０．５６７１０．５６７１０．５６７１０．５６７１０．５５４９０．５６７１０．６１５９０．５９１５０．９８１７０．９８７８１．００００
１６０．５６１００．５９１５０．５６１００．５６７１０．５６１００．５６１００．５６１００．５６１００．５４８８０．５６７１０．６２８００．６０３７０．９８１７０．９８７８０．９８７８１．００００
１７０．５７９３０．５６１００．５７９３０．５８５４０．５７９３０．５７９３０．５７９３０．５７９３０．５９１５０．５７３２０．９２６８０．６０９８０．６５８５０．６５２４０．６４０２０．６５２４１．００００
１８０．５８５４０．５９１５０．５８５４０．５９１５０．５８５４０．５８５４０．５８５４０．５８５４０．５９７６０．６０３７０．６１５９０．５６７１０．５９１５０．５８５４０．５９１５０．５８５４０．６５２４１．００００
１９０．５４８８０．５６７１０．５４８８０．５５４９０．５４８８０．５４８８０．５４８８０．５４８８０．５３６６０．６０３７０．５５４９０．６０３７０．５９１５０．５９７６０．５９１５０．５８５４０．５７９３０．５９７６１．００００
２００．５６１００．５５４９０．５６１００．５５４９０．５６１００．５６１００．５６１００．５６１００．５４８８０．５４２７０．５７９３０．８５９８０．６４０２０．６３４１０．６２２００．６３４１０．５７９３０．５９７６０．５８５４１．００００
２１０．５５４９０．５４８８０．５５４９０．５４８８０．５５４９０．５５４９０．５５４９０．５５４９０．５４２７０．５３６６０．５８５４０．８５３７０．６３４１０．６２８００．６１５９０．６２８００．５８５４０．５９１５０．５７９３０．９９３９
２２０．５４８８０．５６７１０．５４８８０．５４２７０．５４８８０．５４８８０．５４８８０．５４８８０．５３６６０．５３０５０．５７９３０．７９８８０．６０３７０．５９７６０．５９７６０．６０９８０．５７９３０．５８５４０．５７３２０．９３９０
２３０．５４２７０．５６１００．５４２７０．５３６６０．５４２７０．５４２７０．５４２７０．５４２７０．５３０５０．５２４４０．５８５４０．８０４９０．５９７６０．５９１５０．５９１５０．６０３７０．５８５４０．５７９３０．５６７１０．９３２９
２４０．５５４９０．５４８８０．５５４９０．５４８８０．５５４９０．５５４９０．５５４９０．５５４９０．５４２７０．５２４４０．５９７６０．８５３７０．６２２００．６１５９０．６０３７０．６１５９０．５９７６０．５６７１０．５７９３０．９６９５
２５０．５８５４０．５６７１０．５８５４０．５７９３０．５８５４０．５８５４０．５８５４０．５８５４０．５９７６０．５６７１０．５７９３０．６１５９０．５５４９０．５４８８０．５４８８０．５４８８０．６０３７０．９１４６０．５４８８０．６７０７
２６０．５８５４０．５６７１０．５８５４０．５７９３０．５８５４０．５８５４０．５８５４０．５８５４０．５７３２０．５１８３０．６０３７０．８２３２０．６２８００．６２２００．６０９８０．６２２００．６０３７０．５９７６０．５８５４０．９５１２
２７０．６０９８０．５９１５０．６０９８０．６１５９０．６０９８０．６０９８０．６０９８０．６０９８０．５９７６０．５７９３０．５９１５０．６６４６０．６２８００．６２２００．６２２００．６３４１０．６５２４０．６２２００．６０９８０．６８２９
２８０．５９１５０．５７３２０．５９１５０．５９７６０．５９１５０．５９１５０．５９１５０．５９１５０．５７９３０．５８５４０．５８５４０．６７０７０．６２２００．６１５９０．６１５９０．６２８００．６４６３０．６１５９０．６２８００．６７６８
２９０．７２５６０．６７０７０．７２５６０．７３１７０．７２５６０．７２５６０．７２５６０．７２５６０．７１３４０．５８５４０．６０９８０．５９７６０．６２２００．６１５９０．６１５９０．６２８００．６５８５０．６０３７０．５７９３０．６１５９
３００．５９１５０．６２２００．５９１５０．５８５４０．５９１５０．５９１５０．５９１５０．５９１５０．５６７１０．５９７６０．６３４１０．６３４１０．５９７６０．５９１５０．５７９３０．５７９３０．６４６３０．５９１５０．５５４９０．６２８０
３１０．５７９３０．６０９８０．５７９３０．５７３２０．５７９３０．５７９３０．５７９３０．５７９３０．５５４９０．５８５４０．６２２００．６４６３０．５９７６０．５９１５０．５７９３０．５７９３０．６３４１０．５７９３０．５４２７０．６４０２
３２０．５７９３０．６０９８０．５７９３０．５７３２０．５７９３０．５７９３０．５７９３０．５７９３０．５５４９０．５８５４０．６２２００．６４６３０．５９７６０．５９１５０．５７９３０．５７９３０．６３４１０．５７９３０．５４２７０．６４０２
３３０．５７３２０．５９１５０．５７３２０．５６７１０．５７３２０．５７３２０．５７３２０．５７３２０．５４８８０．５７９３０．６１５９０．６５２４０．６０３７０．５９７６０．５８５４０．５８５４０．６２８００．５８５４０．５６１００．６４６３
３４０．５７９３０．６０９８０．５７９３０．５７３２０．５７９３０．５７９３０．５７９３０．５７９３０．５５４９０．５８５４０．６２２００．６４６３０．５９７６０．５９１５０．５７９３０．５７９３０．６３４１０．５７９３０．５４２７０．６４０２
３５０．５８５４０．６１５９０．５８５４０．５７９３０．５８５４０．５８５４０．５８５４０．５８５４０．５６１００．５９１５０．６１５９０．６５２４０．５９１５０．５８５４０．５７３２０．５７３２０．６２８００．５８５４０．５４８８０．６３４１
３６０．５８５４０．６１５９０．５８５４０．５７９３０．５８５４０．５８５４０．５８５４０．５８５４０．５６１００．５９１５０．６２８００．６５２４０．５９１５０．５８５４０．５７３２０．５７３２０．６４０２０．５８５４０．５４８８０．６４６３
３７０．５６１００．６０３７０．５６１００．５５４９０．５６１００．５６１００．５６１００．５６１００．５６１００．６１５９０．５７９３０．６７６８０．５４２７０．５３６６０．５３６６０．５３６６０．５７９３０．５８５４０．６３４１０．６７０７
３８０．５９１５０．６３４１０．５９１５０．５８５４０．５９１５０．５９１５０．５９１５０．５９１５０．５９１５０．６７０７０．６０９８０．６４６３０．５６１００．５６７１０．５６７１０．５７９３０．６０９８０．６２８００．６２８００．６４０２
３９０．５６７１０．５７３２０．５６７１０．５６１００．５６７１０．５６７１０．５６７１０．５６７１０．５４２７０．５４８８０．６０９８０．６４６３０．５４８８０．５４２７０．５３０５０．５４２７０．５９７６０．５５４９０．５９１５０．６４０２
４００．５６７１０．５６１００．５６７１０．５６１００．５６７１０．５６７１０．５６７１０．５６７１０．５５４９０．５２４４０．５９７６０．５８５４０．５４８８０．５４２７０．５３０５０．５３０５０．５６１００．５７９３０．５５４９０．６５２４
４１０．５７９３０．５４８８０．５７９３０．５７３２０．５７９３０．５７９３０．５７９３０．５７９３０．５６７１０．５７３２０．５８５４０．６８２９０．５００００．４９３９０．４８１７０．４９３９０．５４８８０．５４２７０．５７９３０．６７６８
８８１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．５
表５　４１份猪屎豆属种质的遗传相似系数矩阵－２
犜犪犫犾犲５　犵犲狀犲狋犻犮狊犻犿犻犾犪狉犻狋狔犿犪狋狉犻狓犫犪狊犲犱狅狀犐犛犛犚狆狅犾狔犿狅狉狆犺犻狊犿犪犿狅狀犵４１犆狉狅狋犪犾犪狉犻犪犵犲狉犿狆犾犪狊犿狊－２
　号Ｎｏ．　２１ ２２ ２３ ２４ ２５ ２６ ２７ ２８ ２９ ３０ ３１ ３２ ３３ ３４ ３５ ３６ ３７ ３８ ３９ ４０ ４１
２１１．００００
２２０．９４５１１．００００
２３０．９３９００．９９３９１．００００
２４０．９７５６０．９３２９０．９３９０１．００００
２５０．６６４６０．６５８５０．６５２４０．６４０２１．００００
２６０．９５７３０．９０２４０．８９６３０．９５７３０．６５８５１．００００
２７０．６７６８０．６７０７０．６６４６０．６７６８０．６３４１０．６７０７１．００００
２８０．６７０７０．６５２４０．６５８５０．６８２９０．６２８００．６５２４０．９６９５１．００００
２９０．６０９８０．６４０２０．６３４１０．６２２００．６１５９０．６２８００．８４７６０．８２９３１．００００
３００．６２２００．６２８００．６３４１０．６２２００．５６７１０．６２８００．５１８３０．５３６６０．５７３２１．００００
３１０．６３４１０．６４０２０．６４６３０．６３４１０．５６７１０．６４０２０．５３０５０．５４８８０．５８５４０．９８７８１．００００
３２０．６３４１０．６４０２０．６４６３０．６３４１０．５６７１０．６４０２０．５３０５０．５４８８０．５８５４０．９８７８１．００００１．００００
３３０．６４０２０．６２２００．６２８００．６２８００．５７３２０．６４６３０．５３６６０．５５４９０．５７９３０．９６９５０．９８１７０．９８１７１．００００
３４０．６３４１０．６４０２０．６４６３０．６３４１０．５６７１０．６４０２０．５３０５０．５４８８０．５８５４０．９８７８１．００００１．０００００．９８１７１．００００
３５０．６２８００．６３４１０．６４０２０．６２８００．５７３２０．６３４１０．５３６６０．５５４９０．５９１５０．９８１７０．９９３９０．９９３９０．９７５６０．９９３９１．００００
３６０．６４０２０．６４６３０．６５２４０．６４０２０．５７３２０．６４６３０．５３６６０．５５４９０．５９１５０．９８１７０．９９３９０．９９３９０．９７５６０．９９３９０．９８７８１．００００
３７０．６６４６０．６７０７０．６７６８０．６６４６０．５９７６０．６４６３０．６４６３０．６６４６０．６１５９０．６２８００．６４０２０．６４０２０．６４６３０．６４０２０．６４６３０．６４６３１．００００
３８０．６３４１０．６４０２０．６３４１０．６２２００．６０３７０．６２８００．６６４６０．６８２９０．６５８５０．６２２００．６３４１０．６３４１０．６２８００．６３４１０．６４０２０．６４０２０．７８６６１．００００
３９０．６３４１０．６２８００．６３４１０．６３４１０．５４２７０．６５２４０．５４２７０．５７３２０．５７３２０．６８２９０．６８２９０．６８２９０．６８９００．６８２９０．６７６８０．６７６８０．６５２４０．６５８５１．００００
４００．６４６３０．６１５９０．６２２００．６４６３０．５９１５０．６５２４０．５９１５０．６０９８０．５８５４０．６４６３０．６５８５０．６５８５０．６６４６０．６５８５０．６６４６０．６５２４０．６５２４０．６４６３０．７１９５１．００００
４１０．６７０７０．６７６８０．６７０７０．６５８５０．５５４９０．６５２４０．５７９３０．５８５４０．５９７６０．６３４１０．６３４１０．６３４１０．６１５９０．６３４１０．６４０２０．６２８００．６７６８０．６７０７０．７０７３０．６９５１１．００００
号（假地蓝）、２０号（假地蓝）、２１号（假地蓝）、２４号（假地蓝）、２６号（假地蓝）、２２号（假地蓝）、２３号（假地蓝）、２７
号（光萼猪屎豆）、２８号（光萼猪屎豆）、２９号（光萼猪屎豆）、３０号（大猪屎豆）、３１号（大猪屎豆）、３２号（大猪屎
豆）、３４号（大猪屎豆）、３５号（大猪屎豆）、３６号（大猪屎豆）、３３号（大猪屎豆）、３７号（翅托叶猪屎豆）、３８号（长果
猪屎豆）、３９号（长萼猪屎豆）、４０号（头花猪屎豆）、４１号（思茅猪屎豆）；第Ⅱ类有２份种质，包括１８号（三尖叶猪
屎豆）、２５号（三尖叶猪屎豆）；第Ⅰ类含有６份种质，１１号（响铃豆）、１７号（响铃豆）、１３号（四棱猪屎豆）、１４号
（四棱猪屎豆）、１５号（四棱猪屎豆）、１６号（四棱猪屎豆）。从中可以看出猪屎豆的同一个种可以很好的聚成一类。
３　结论
３．１　猪屎豆属ＩＳＳＲ－ＰＣＲ体系的建立
在ＰＣＲ扩增中模板ＤＮＡ、引物、ｄＮＴＰ浓度、Ｔａｑ酶、Ｍｇ２＋浓度都会影响ＰＣＲ扩增的条带。本研究对模板
ＤＮＡ含量、引物含量、ｄＮＴＰ浓度、Ｔａｑ酶含量４个因素进行了４个水平的优化分析，建立了适合猪屎豆ＩＳＳＲ扩
增的反应体系并对引物的退火温度进行了梯度筛选，最后得出比较适合猪屎豆属野生植物的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ体系
为：４０ｎｇ模板ＤＮＡ、引物０．２μｍｏｌ／Ｌ、２００μｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ、１×Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ
２＋ｐｌｕｓ）、０．５ＵＴａｑ酶（ＴａＫａＲａ）；ＩＳ
ＳＲ引物最佳退火温度为５０或５３℃。
３．２　遗传相似性和多样性
对４１份猪屎豆属野生材料用筛选出的１６条引物进行ＩＳＳＲ分子标记遗传多样性分析，结果表明，平均每个
引物扩增的多态条带数为９．９条，多态性条带比率为９９．３％；材料间遗传相似系数范围在０．４８１７～１．００００，平
均ＧＳ值为０．６５３。不同种间的遗传相似系数差异很大，即使是在同一种内不同海拔的种质之间的遗传相似系数
也出现了差异，这可能是猪屎豆属植物对环境的适应造成了基因的表达差异，这在ＤＮＡ分子水平上说明了不同
猪屎豆属植物材料之间的遗传差异较大，遗传多样性较丰富。
９８１第１８卷第５期 草业学报２００９年
图２　猪屎豆属植物的犝犘犌犕犃聚类图
犉犻犵．２　犝犘犌犕犃犱犲狀犱狉狅犵狉犪犿犳狅狉犆狉狅狋犪犾犪狉犻犪犫犪狊犲犱狅狀犇犻犮犲犮狅犲犳犳犻犮犻犲狀狋
３．３　亲缘关系分析
从构建的分子树状图及遗传相似系数矩阵可以看出，１９号与所有其他猪屎豆属材料的亲缘关系最远；种内
遗传既有相似性又有差异性，种间遗传差异性极其显著，表明猪屎豆属野生种质间的遗传关系复杂，这个情况的
出现可能是由于环境的适应性和差异性所造成的。聚类分析结果显示物种之间的亲缘关系和形态学分类上有些
不一致性，在Ⅴ类中猪屎豆和针状野百合在形态上分属于长果组和唇萼组；第Ⅲ类中除了长果猪屎豆和光萼猪屎
豆是长果组外，其他的都是唇萼组；毛果组的毛果猪屎豆和三尖叶猪屎豆被分别分成了２类；第Ⅰ类中的响铃豆
和四棱猪屎豆都属于唇萼组，这又是ＩＳＳＲ的一致性，这些原因可能和基因表达的多样性有关，还有待于进一步
研究。
３．４　物种的鉴定
本试验所用的４１号材料思茅猪屎豆在中国植物志和云南植物志上都未有记载，从树状图及遗传相似系数矩
阵可以看出，４１号（思茅猪屎豆）材料和其他猪屎豆属资源有很大的相似性，相似系数在０．４８１７～０．６９５１，并且
把４１号归于第Ⅲ大类，但该物种是否属于猪屎豆属需要做进一步的工作。可以看出ＩＳＳＲ为形态上的鉴定提供
了一定的依据，这说明利用ＩＳＳＲ鉴定物种是一种有效的方法。
３．５　ＩＳＳＲ的扩增反应
猪屎豆属植物作为一种重要的资源，从本研究的结果来看，利用ＩＳＳＲ标记技术可以获得清晰且多态性高的
猪屎豆属ＤＮＡ电泳图谱，利用单独一个多态性好的引物基本上能将４１份材料分开，且各材料特征带明显，而且
操作简单，耗时少，说明ＩＳＳＲ标记用于猪屎豆属种质遗传多样性研究及不同材料的ＤＮＡ水平识别是可靠的，这
为利用ＩＳＳＲ技术构建猪屎豆属种质的指纹图谱，品种的识别，杂交育种组合亲本的选择及种质的开发利用都有
很大的应用价值。
０９１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．５
参考文献：
［１］　中国科学院植物所．中国植物志（４２卷第２分册）［Ｍ］．北京：科学出版社，２００７．３４１．
［２］　李建强．云南猪屎豆属植物订正（续）－植物地理学讨论［Ｊ］．武汉植物学研究，１９９１，９（２）：１４１１４７．
［３］　ＤｅｍｐｓｅｙＪＭ．ＦｉｂｅｒＣｒｏｐｓ［Ｍ］．Ｇａｉｎｅｓｖｉｌｅ，Ｆｌｏｒｉｄａ：ＴｈｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓｏｆＦｌｏｒｉｄａ，１９７５．
［４］　ＲａｍｏｓＭＧ，ＶｉｌａｔｏｒｏＭＡＡ，ＡｌｖｅｓＢＪＲ，犲狋犪犾．Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘｔｉｏｎｔｏｔｒｏｐｉｃａｌ
ｇｒｅｅｎｍａｎｕｒｅｃｒｏｐｓａｎｄｒｅｓｉｄｕａｌｂｅｎｅｆｉｔｔｏａｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｍａｉｚｅｃｒｏｐｕｓｉｎｇ１５Ｎｉｓｏｔｏｐｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
２００１，９１：１０５１１５．
［５］　ＭｉｌｅｒＲＨ．ＣｒｏｔａｌａｒｉａＳｅｅｄＭｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，Ａｎａｔｏｍｙ，ａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ［Ｃ］．ＡｇｒｉｃｕｌｔｒｕｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈＳｅｒｖｉｃｅ，ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｄｅ
ｐａｒｔｍｅｎｔｏｆａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌｂｕｌｅｔｉｎ，１９６７．Ｎｏ．１３７３．
［６］　李林珍，朱海燕，石京山，等．猪屎豆属植物化学成分及药理活性研究概况［Ｊ］．天然产物研究与开发，２００７，１９：７２４７３０，６７０．
［７］　陈成立，庄卫民，沈诵秩，等．光滑猪屎豆在侵蚀赤红壤旱地的生长特性以及栽培利用［Ｊ］．福建水土保持，１９９２，２：５２５７．
［８］　邹知明，邓玲姣，蒋建生，等．猪屎豆生产性能测定及其饲喂家兔的效果研究［Ｊ］．饲料与营养，２００８，３：１０１２．
［９］　邓辅唐，喻正富，杨自全，等．山毛豆、木豆、猪屎豆在高速公路边坡生态恢复工程中的应用［Ｊ］．中国水土保持，２００６，４：２１２３．
［１０］　ＺｉｅｔｋｉｅｗｉｃｚＥ，ＲａｆａｌｓｋｉＡ，ＬａｂｕｄａＤ．Ｇｅｎｏｍｅｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇｂｙｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ（ＳＳＲ）ａｎｃｈｏｒｅｄｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅ
ａｃｔｉｏｎａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９９４，２０：１７６１８３．
［１１］　李延龙，张明，曹秀敏，等．ＩＳＳＲ分子标记技术在金叶女贞品种鉴定中的应用［Ｊ］．安徽农学通报，２００８，（２２）：３９，３４．
［１２］　赵杨，陈晓阳，王秀荣，等．二色胡枝子遗传多样性ＩＳＳＲ分析［Ｊ］．植物遗传资源学报，２００７，８（２）：１９５１９９．
［１３］　范彦，李芳，张新全，等．扁穗牛鞭草种质遗传多样性的ＩＳＳＲ分析［Ｊ］．草业学报，２００７，１６（４）：７６８１．
［１４］　王康，董宽虎，杨青川，等．ＩＳＳＲ分子标记在牧草研究中的应用［Ｊ］．生物技术通报，２００８，（６）：６５６８，７７．
［１５］　ＷａｎｇＭＬ，ＭｏｓｊｉｄｉｓＪＡ，ＭｏｒｒｉｓＪＢ，犲狋犪犾．Ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ犆狉狅狋犪犾犪狉犻犪ｇｅｒｍｐｌａｓｍａｓｓｅｓｓｅｄｔｈｒｏｕｇｈｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙ
ｓｉｓｏｆＥＳＴＳＳＲｍａｒｋｅｒｓ［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｅ，２００６，４９：７０７７１５．
［１６］　隋晓青，王．克氏针茅ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的建立与优化［Ｊ］．草业学报，２００８，１７（３）：７１７８．
［１７］　郑轶琦，王志勇，郭海林，等．正交设计优化假俭草ＳＲＡＰ－ＰＣＲ反应体系及引物筛选［Ｊ］．草业学报，２００８，１７（４）：１１０１１７．
［１８］　ＮｅｉＭ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｇｅｎｅｔｉｃｓ［Ｍ］．ＮｅｗＹｏｒｋ：ＮｅｗＹｏｒｋＣｏｌｕｍｂｉａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，１９８７．１０６１０７．
犌犲狀犲狋犻犮犱犻狏犲狉狊犻狋狔犿犪狉犽犲狉狊犱犲狋犲犮狋犲犱犫狔犻狀狋犲狉－狊犻犿狆犾犲狊犲狇狌犲狀犮犲狉犲狆犲犪狋狊（犐犛犛犚狊）犻狀犆狉狅狋犪犾犪狉犻犪犾犪狋犻犳狅犾犻犪犻狀犢狌狀狀犪狀
ＬＩＵＺｈｏｎｇｈｕｉ１，ＬＩＵＧｕｏｄａｏ２，ＨＵＡＮＧＢｉｚｈｉ３，ＬＵＯＦｕｃｈｅｎｇ１
（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＧｒａｓｓｌａｎｄＳｃｉｅｎｃｅ，ＹｕｎｎａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋｕｎｍｉｎｇ６５０２０１，Ｃｈｉｎａ；
２．ＴｒｏｐｉｃａｌＣｒｏｐＧｅｎｅｔｉｃＲｅｓｏｕｒｃｅｓＩｎｓｉｔｕｔｅ，ＣＡＴＡＳ，Ｄａｎｚｈｏｕ５７１７３７，Ｃｈｉｎａ；３．Ｙｕｎｎａｎ
ＡｃａｄｅｍｙｏｆＧｒａｓｓｌａｎｄａｎｄＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅ，Ｘｉａｏｓｈａｏ６５０２１２，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｆｏｒｔｙｏｎｅ犆狉狅狋犪犾犪狉犻犪犾犪狋犻犳狅犾犻犪ｗｉｌｄｒｅｓｏｕｒｃｅｓｉｎＹｕｎｎａｎｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｕｓｉｎｇｉｎｔｅｒｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｒｅｐｅａｔｓ（ＩＳＳＲ）．Ｓｉｘｔｅｅｎｏｆ１００ｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄ，ａｎｄ１６４ＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｓｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒｏｍ４１ｓａｍｐｌｅｓ
ｔｏｇｉｖｅ１５９ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（９９．３％）ｔｈａｔｗｅｒｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ，ａｎａｖｅｒａｇｅｏｆ１０．３ＤＮＡｂａｎｄｓｐｅｒｐｒｉｍｅｒ．Ｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃ
ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙａｍｏｎｇａｌａｃｃｅｓｓｉｏｎｓｒａｎｇｅｄｆｒｏｍ０．４８１７ｔｏ１．００００，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇａｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｌｙｒｉｃｈｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
ａｍｏｎｇｔｈｅｔｅｓｔｅｄａｃｃｅｓｓｉｏｎｓ．ＡｂｅｔｔｅｒＰＣＲｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｕｓｉｎｇａｎｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｄｅｓｉｇｎ：ＤＮＡ４０
ｎｇ，ｐｒｉｍｅｒ０．２μｍｏｌ／Ｌ，ｄＮＴＰ２００μｍｏｌ／Ｌ，１×Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ
２＋ｐｌｕｓ），Ｔａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ０．５Ｕ（ＴａＫａＲａ）．Ｔｈｅ
ｂｅｓｔａｎｎｅａｌｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｆｏｒＩＳＳＲｐｒｉｍｅｒｓｗａｓ５０ｏｒ５３℃．ＵＰＧＭＡｃｌｕｓｔｅｒｂａｓｅｄｏｎｇｅｎｅｔｉｃｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｄｉｖｉｄ
ｅｄｔｈｅａｃｃｅｓｓｉｏｎｓｉｎｔｏｆｉｖｅｇｒｏｕｐｓ，ｗｉｔｈｃｌｏｓｅｉｎｔｒａｓｐｅｃｉｆｉｃｇｅｒｍｐｌａｓｍ．犆狉狅狋犪犾犪狉犻犪狊狕犲犿狅犲狀狊犻狊ｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙ
ＩＳＳＲａｎｄｉｔｓｇｅｎｅｔｉｃｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｗａｓｃｌｏｓｅｔｏ犆狉狅狋犪犾犪狉犻犪ｂｕｔｍｏｒｅｗｏｒｋｉｓｎｅｅｄｅｄｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｔｈｉｓｓｐｅｃｉｅｓ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犆狉狅狋犪犾犪狉犻犪；ＩＳＳＲ；ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｎａｌｙｓｉｓ
１９１第１８卷第５期 草业学报２００９年