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Storage Condition and Viability Change of Camellia japonica Pollen

耐冬山茶花粉储藏条件及其活力的动态变化



全 文 :林业科学研究!"#$%!"&"#$,) ,*
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!!文章编号!$##$($)*&""#$%##(#,)(#+
耐冬山茶花粉储藏条件及其活力的动态变化
贾文庆$!"! 王少平"! 范正琪$! 李纪元$!
"$8中国林业科学研究院亚热带林业研究所!浙江 杭州!$$)##( "8河南科技学院园艺园林学院!河南 新乡!)%###
收稿日期$ "#$)(#,("&
基金项目$ %十二五&国家科技支撑计划项目""#$".BE#$.#,#(国家国际科技合作专项项目""#$$EUB#)*##
作者简介$ 贾文庆"$*,*#!男!河南淮阳人!在读博士研究生!副教授!主要研究方向为观赏植物生物技术8
!
通讯作者$李纪元"$*+)#!男!研究员!博士生导师!主要研究方向为观赏植物80(1234$ V35=267$"+89:1
摘要!以山东青岛耐冬山茶花粉为试验材料!采用离体培养基法研究了花粉的萌发特性!并探讨了不同贮藏温度与
贮藏时间对花粉萌发率和超氧化物歧化酶"C\E#.过氧化物酶"F\E#.过氧化氢酶"-BD#活性的影响+ 结果表明$
耐冬山茶花粉萌发的最适宜培养基为$$%# R0N/$蔗糖 y#8#% R0N/$硼酸 y$## 1R0N/$ PB

y*## R0N
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-2
"J
#
"
(花粉最佳贮藏温度为/&#b(/&#b贮藏 +# Q后!花粉萌发率仍达到原来的 %&8$*I! 种保护酶活性较
高!花粉抗氧化.衰老能力较强(贮藏过程中! 种保护酶活性出现最高峰值前后花粉萌发率出现大幅度下降(不同
贮藏温度下! 种保护酶的作用不同!室温下 F\E.-BD为敏感性保护酶!)b下 C\E为敏感性保护酶! /"#b.
/&#b下-BD为敏感性保护酶( 种保护酶活性对花粉萌发率的影响依次为$C\EvF\Ev-BD+
关键词!耐冬山茶(花粉(萌发(贮藏(超氧化物歧化酶"C\E#(过氧化物酶"F\E#(过氧化氢酶"-BD#
中图分类号!C+&%L$) 文献标识码!B
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A,1 B#3)"$ -(B$J6( W(D"76)(( H:4?6( R?O1362@3:6( <@:O2R?( C\E( F\E( -BD
耐冬山茶 "-(B$J6( W(D"76)( N8# 为山茶科
"DA?29?29#山茶属"-(B$J6( N8#常绿阔叶小乔木!
在山东青岛近海岛屿和崂山等地有相当数量的野生
分布!是我国山茶科植物自然分布的最北缘种,$ /- +
隆冬季节!雪飘冰封!绿树红花!红白相映!分外妖
娆!故被当地人称为%耐冬&!花期从 $" 月到翌年 %
第 期 贾文庆等$耐冬山茶花粉储藏条件及其活力的动态变化
月!长达半年之久,$ /- + 耐冬山茶是我国北方地区
唯一室外冬春季开花的常绿阔叶植物!具有极高的
观赏价值和经济价值,$ /- +
花粉是种子植物自然条件下遗传信息交流的载
体,) /+- !花粉受精过程能否顺利完成及结实量的多
少!也是植物杂交育种成败的关键+ 杂交育种是培
育新品种最有效.最常用的手段之一!杂交经常遇到
花期不遇.远距离杂交的实际问题!这就需要采集和
保存花粉!花粉活力是评价贮藏成败的主要标志+
有关耐冬山茶花粉活力仅王翔等,"- .杨成利等,-采
用DD-染色法进行过报道!关于其贮藏特性的研究
尚为空白+ 染色法测定花粉活力容易出现假阳性
等!不能准确直观的反应花粉活力,) /+- !而离体培养
能模拟自然条件下开花时柱头的状态!故能真实地
反应植物花粉的活力,) /,- + 当前!有关花粉保存的
研究多集中在不同贮藏方法"温度.湿度等#和萌发
率的关系!赵文飞等,&- .谭健晖,*- .刘艳萍等,,-研究
发现!花粉保存期间!内部发生一系列的生理代谢反
应!活力逐渐下降!而花粉中的保护酶类能够清除氧
自由基!延缓衰老!因此保护酶活性的高低也是反映
花粉活力的重要指标+ 作者以山东青岛耐冬山茶花
粉为试验材料!研究其萌发特性以及不同贮藏方法
对保护酶活性和萌发率的影响!以期为耐冬山茶花
粉的科学贮藏.耐冬山茶生殖生物学研究和杂交育
种提供依据+
$!材料与方法
C8CD试验材料
花粉采自山东青岛东都实业有限公司的耐冬山
茶5长柱耐冬/!树龄为 $# 2+ 于 "#$ 年 ) 月 & 日至
$% 日!采取盛花期微开花朵!带回实验室后!将花药
剪下放到硫酸纸上!避光在 "% t$b的培养箱散粉!
真空干燥 + A!花粉含水量降至 $+8##I左右时!收
集花粉转入离心管密封保存!备用+
C8FD花粉萌发培养基筛选
在预备试验基础上!采用 N
*
"
)
#正交试验设
计!研究蔗糖"B#.硼酸".#.PB

"-#和 -2"J
#
"
"E#) 个因素不同水平对耐冬山茶花粉萌发的影响!
上述培养基均添加 & R0N/$琼脂!H_值调至 +8#+
用毛笔蘸取花粉播于载玻片培养基上!放入培养皿
里浸湿的吸水纸上!加盖+ 培养条件为 "% t$b!全
光照培养+ 每处理设置 重复!培养 $" A 后在显微
镜下观察拍照!每重复观察 视野!总计观察花粉数
大于 "## 粒+
花粉萌发率"I# l花粉管长度大于花粉直径
的花粉数K观察花粉数f$## I+
C8HD花粉储藏方法优化
设置室温.)b"低温#. /"#b. /&#b"超低
温#) 种贮藏温度!将真空干燥的耐冬山茶花粉装入
放有硅胶干燥剂 , 1N试管中!用棉花封口!每个贮
藏温度放置 $# $% 支+ 花粉贮藏 ").)#.,".$"#.
$&)."+).$##.+# Q后!从 ) 种贮藏条件中各取出 $
管花粉!用少许上述最佳培养基测定花粉萌发率!其
余用于 种保护酶活性测定+
C8ID花粉保护酶活性测定
酶液的提取$准确称取 $8### R耐冬山茶花粉!
放入 )b预冷玻璃研钵中!加人少许FeF.石英砂!然
后加入 $# 1N#8#% 1:40N/$磷酸缓冲"H_l,8##!
匀速研磨 # )# $# ### O冷冻离心机里离心 "# 136+ 上清液即为
酶液+
超氧化物岐化酶" C\E#活性采用氮蓝四唑法
"J.D#测定,$#- (过氧化氢酶"-BD#活性采用紫外吸
收法,$$-测定(过氧化物酶"F\E#活性采用愈创木酚
显色法,$#-进行测定+
采用 CFCC $$8# 软件进行数据统计分析!利用
0;9?4"## 软件制图+
"!结果与分析
F8CD不同因素对耐冬山茶花粉萌发的影响
从表 $ 可以看出!在不同培养条件下!耐冬山茶
花粉均能萌发+ 处理 ) 花粉萌发率最高!平均为
&#L%#I(对照花粉萌发率最低!平均仅 ""8$I+ 极
差数据"表 $#表明!蔗糖是影响花粉萌发率的主要
因素!其它依次是硼酸.-2"J
#
"
和 PB

+ 耐冬山
茶花粉萌发需要的蔗糖浓度低于许林等,$"-对川鄂
连蕊茶"-F#"%&*"#76(7( _26Q8(`2ZZ8#花粉研究得
出的 "## R0N/$!高于杨盛美等,$-对茶组" C?9@8
DA?2"N8# E5?O#植物花粉.许林等,$)-对茶树"-(0
B$J6( 等,$%-对油茶"-(B$J6( 表 $ 结果可知!适宜耐冬山茶花粉萌发的最优组合
为$$%# R0N/$蔗糖 y#8#% R0N/$硼酸 y$## 1R0
N
/$
PB

y*## 1R0 N
/$
-2"J
#
"
"处理 )$
B
"
.
$
-
"
E

#+
%,
林!业!科!学!研!究 第 "& 卷
表 CD不同因素对耐冬山茶花粉萌发的影响
处理
蔗糖K
"R0N
/$
#
硼酸K
"R0N
/$
#
PB

K
"1R0N
/$
#
-2"J
#
"
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"1R0N
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#
萌发率KI
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+
M
"
,#8+" +$8") ++8%) +"8,$
+
M

+8+$ %*8, +$8,& +,8&#
$8%+ &8"# )8%+ ,8+,
!!注$不同大写字母分别表示在 #8#$ 水平上存在差异!下同+
F8FD不同贮藏温度$贮藏时间下花粉萌发情况
从图 $ 可以看出!不同贮藏方法对耐冬山茶花
粉萌发率影响显著!贮藏后花粉萌发率差异较大+
室温贮藏的花粉随贮藏时间的延长花粉萌发率迅速
降低!贮藏 $"# Q后花粉失去生活力!不再萌发()b
贮藏 "+) Q 时花粉萌发率降为 #+ 贮藏 # $"# Q
时!/"#b./&#b贮藏温度花粉活力出现较快的下
降趋势(贮藏 $"# +# Q时!/"#b./&#b贮藏温
度花粉活力下降速度较慢!至 +# Q 时! /&#b贮藏
的花粉仍保持较高的萌发率!达 )+8,#I!为贮藏前
花粉萌发率 "%I的 %&8$*I!/"#b贮藏的花粉
萌发率也达到 "+8$#I+ 这与许林等,$)-研究所得
/,#b最适于茶树花粉的长期贮藏的结果基本一致+
综合来看!耐冬山茶花粉适宜的贮藏温度为/&#b+
图 $!不同贮藏方法对耐冬山茶花粉萌发的影响
F8HD不同贮藏温度$贮藏时间对花粉保护酶活性的
影响
"88$!对花粉 C\E活性的影响!从表 " 和图 " 可
以看出!不同贮藏时间和贮藏温度对耐冬山茶花粉
超氧化物歧化酶 " C\E# 活性有显著影响 "/m
#L#$#+ 由表 " 可知!耐冬山茶花粉 C\E活性在室
温条件下!随贮藏时间的延长呈先降低后升高再迅
速下降趋势!说明花粉室温贮藏后超氧自由基不断
增加!诱导 C\E活性增强!随着贮藏时间的延长!花
粉 C\E活性随萌发率的下降而迅速下降+ )b贮藏
温度下!耐冬山茶花粉 C\E活性呈升高后迅速下降
的变化趋势!最高峰出现在贮藏后 ") Q!贮藏 "+) Q
花粉萌发率降为 # 时的 C\E活性仅为最高峰的
)L#I+ /"#b./&#b贮藏温度下!贮藏 # )# Q!
/"#b下花粉 C\E活性呈缓慢下降的趋势! /&#b
下 C\E活性呈先下降后上升的趋势(而后随着贮藏
时间的延长!" 种贮藏温度下 C\E活性均呈下降的
变化趋势!比较而言! /&#b贮藏的耐冬山茶花粉
C\E活性下降幅度曲线明显较 /"#b平缓! /&#b
贮藏 +# Q后!C\E活性为 "%" =0R/$!达到原来的
%*8$%I!说明耐冬山茶花粉仍保持较高的活性+
表 FD不同贮藏温度$贮藏时间对花粉保护酶活性的影响
贮藏
时间
KQ
超氧化物歧化酶"C\E#活性
K"=0R
/$
#
室温 )b /"#b /&#b
过氧化物酶"F\E#活性
K"=0R
/$
#
室温 )b /"#b /&#b
过氧化氢酶"-BD#活性
K"=0R
/$
#
室温 )b /"#b /&#b
# )"+. )"+. )"+B )"+. "+- "+E "+0 "+0 %8- %8E %8U %8U
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+,
第 期 贾文庆等$耐冬山茶花粉储藏条件及其活力的动态变化
图 "!不同贮藏时间.贮藏温度对花粉 C\E活性的影响
"88"!对花粉F\E活性的影响!从表 " 和图 可
以看出!耐冬山茶花粉经过不同低温和贮藏时间处
理后!过氧化物酶"F\E#活性变化显著"/m#8#%#+
室温.)b贮藏温度下!耐冬山茶花粉 F\E活性随贮
藏时间的延长!呈现逐步升高后迅速下降的趋势!室
温保存至 )# Q时!F\E活性升至 ),8+ =0R/$!达到
最高!为原来的 $8& 倍!而后随着贮藏时间的增加!
耐冬山茶花粉自身的保护能力迅速下降!F\E合成
受到抑制!至贮藏 "+) Q!降为 #()b贮藏!耐冬山茶
花粉F\E活性最高峰出现在 ," Q!之后随着贮藏时
间的延长!F\E活性开始迅速降低!到 "+) Q 时!
F\E降为 #+ /"#b. /&#b 贮藏!耐冬山茶花粉
F\E活性变化基本一致!呈降低升高下降的趋
势!最高峰分别出现在 $&) Q 和 "+) Q!此时 F\E活
性分别为原来的 $8& 倍和 "8$) 倍!之后 F\E活性
开始下降+ +# Q时耐冬山茶花粉F\E仍保持较高
的活性!分别为原来的 #8,% 倍和 $8)$ 倍!这表明花
粉能及时分解自由基!进而保护花粉减少低温伤害!
保持较高的花粉活力+
图 !不同贮藏时间.贮藏温度对花粉F\E活性的影响
"88!对花粉-BD活性的影响!如表 " 和图 ) 所
示!不同贮藏方法对耐冬山茶花粉过氧化氢酶
"-BD#活性影响差异显著+ 室温.)b贮藏温度下!
耐冬山茶花粉的-BD活性随贮藏时间的延长!呈现
先升高后下降的趋势!最高峰分别在第 ").," Q!最
高峰值分别为原来的 $8& 倍和 倍+ 之后 -BD活
性快速下降!到 $"# Q时!室温下降至 $8" 1R0R/$!
为原来的 ""8+)I( /"#b./&#b贮藏温度下随贮
藏时间的延长!耐冬山茶花粉的 -BD活性呈现升
高下降再升高后的趋势!高低起伏较大!最高峰
值都出现在 +# Q ! 最高峰值分别为 "8) g0R/$和
"8+ g0R
/$
!为原来的 )8)$ 倍和 +8$% 倍+
耐冬山茶花粉经过不同时间和温度贮藏后!随
着贮藏时间的延长!花粉萌发率逐渐下降!保护酶活
性则表现出不同趋势+ 表 相关分析显示!耐冬山
茶花粉萌发率与 种保护酶活性之间均呈正相关+
花粉萌发率与过氧化物酶 "F\E#.过氧化氢酶
"-BD#活性呈正相关!与超氧化物歧化酶"C\E#活
性的正相关极显著"/m#8#$#!说明在耐冬山茶花
粉的贮藏过程中!超氧化物歧化酶"C\E#活性对花
粉萌发率起着主导作用!即超氧化物歧化酶"C\E#
活性对花粉萌发率的影响作用大于过氧化物酶
"F\E#和过氧化氢酶"-BD#+
图 )!不同贮藏时间.贮藏温度对花粉-BD活性的影响
表 HD耐冬山茶花粉萌发率与 H 种保护酶活性的相关分析
保护酶活性 相关方程 相关系数
超氧化物歧化酶"C\E#活性 Hl%F#)$ "Cy+,F&,)
#8&%"
!!
过氧化物酶"F\E#活性 Hl#F""& *Cy$+F$%$ #8&)
过氧化氢酶"-BD#活性 Hl#F$& *Cy%F*&" & #8)"
!!注$
!!
表示不相关性达到极显著水平+
!结论与讨论
H8CD离体培养法测定耐冬山茶花粉活力
离体萌发法适宜绝大多数植物花粉活力的测
定!能准确表现花粉萌发率,$" /"$- + 一般植物花粉萌
发的糖.硼酸质量浓度分别为 %I "# I.#8#$
#8$% R0N
/$,$, /"$-
+ 山茶科植物花粉萌发的蔗糖.硼
酸.-2"J
#
"
浓度分别为 $## "## R0N/$.#8#%
#8$# R0N
/$
.#8$ #8 R0N
/$ ,$" /$+-
+ 本试验结
果显示!耐冬山茶花粉萌发最适合的蔗糖.硼酸.-2
"J
#
"
浓度分别为 $%# R0N/$.#8#% R0N/$.#8* R
0N
/$
!与多数山茶科植物花粉萌发所需蔗糖.硼酸
浓度范围相一致!但要求较高的 -2"J
#
"
浓度+
王翔等,"-杨成利等,-采用 DD-染色法发现!耐冬山
茶/长柱耐冬/的花粉活力达到 *#8"*I!显著高于
本试验所得的 "%I!这表明 DD-法测定耐冬山
,,
林!业!科!学!研!究 第 "& 卷
茶花粉可能存在假阳性现象,""- + 综合考虑!$%# 1R
0N
/$蔗糖y#8#% R0N/$硼酸y$## 1R0N/$ PB

y
*##1R0N
/$
-2"J
#
"
适宜耐冬山茶花粉活力的
测定+
H8FD不同贮藏方法对花粉萌发的影响
花粉萌发率是表示花粉活力的常用指标!低温
贮藏可降低花粉的生理功能!适宜较长时间保持花
粉活力,)!$, /"$- + 本试验发现!经过不同温度.不同时
间贮藏处理的耐冬山茶花粉萌发率较初始萌发率均
有不同程度的降低!室温.)b贮藏的花粉萌发率下
降明显!室温保存的花粉 $"# Q 后完全丧失活力+
)b贮藏温度下!贮藏 )# Q 时花粉萌发率下降缓慢!
而后随贮藏时间的增加而迅速下降!贮藏 "+) Q 时!
花粉完全丧失活力+ 说明 )b贮藏温度只适合花粉
短期贮藏+ /&#b贮藏温度下!花粉贮藏前期活力
保持相对平衡状态!贮藏 ") Q 时达到最高值!之后
出现下降的趋势!贮藏 +# Q 的花粉萌发率仍达
)+L,#I+ 这表明耐冬花粉在超低温贮藏条件下能
保持较高的活力+ 不同山茶种间花期相差很大!且
经常进行远距离授粉杂交!贮藏耐冬山茶花粉作为
父本!对于种间杂交.解决花期不遇.培育新品种具
有重要意义+ 耐冬山茶花粉 /"#b. /&#b贮藏
+# Q 仍有较高的萌发率!且保护酶活性较高!这表
明适宜的耐冬山茶花粉贮藏方法可满足全年杂交育
种的需要+ 耐冬山茶花粉适宜的贮藏温度为
/&#b!但代价较高!从经济的角度来看! /"#b不
失为实用的贮藏方法+
H8HD花粉萌发率与 H 种保护酶活性
花粉贮藏后花粉活力和保护酶活性是评价贮藏
方法好坏的 " 个重要指标,, /&- + 采用 /"#b.
/&#b低温贮藏耐冬山茶花粉!贮藏 +# Q 后!其花
粉萌发率为 )+8,#I.+8%#I!分别达到原来的
%&L#$I和 )%8)I!超氧化物歧化酶"C\E#.过氧化
物酶"F\E#.过氧化氢酶"-BD# 种保护酶活性基
本在原来的 %#I以上!说明贮藏 +# Q 后花粉生命
力旺盛!对活性氧的清除能力强!仍能通过自身的协
调作用来抑制花粉的衰老和失活+
研究证实$正常条件下!植物细胞自由基的产生
和清除处于动态平衡!逆境"温度等#等破坏了这种
平衡!导致活性氧在体内积累!膜脂双分子层中的不
饱和脂肪酸易于被氧化分解!造成膜整体的破坏和
过敏性死亡!植物通常可以提高保护酶活性!清除过
多的活性氧!维持代谢平衡!保持膜系统的稳定!从
而避免或减少伤害," /")- + 降低贮藏期间耐冬山茶
花粉含水量以及贮藏温度有利于降低贮藏时的生理
活动!减少营养消耗!随着贮藏时间的延长!自由基
增多!出现膜脂过氧化作用!花粉为了避免或减少伤
害!启动 种保护酶进行保护!清除活性氧自由基!
维持细胞膜稳定+ 但随着贮藏时间的增加!花粉细
胞水分胁迫加重!自由基出现累积!花粉细胞衰老出
现氧化胁迫!耐冬山茶花粉的 种保护酶活性不足
以消除因胁迫而造成的伤害!致使花粉活力逐渐下
降!最后死亡+ 本试验发现$花粉萌发率下降最快时
期"室温下 ") ," Q!)b贮藏 )# $"# Q!/"#b.
&#b下 )# $&) Q#!-BD.F\E.C\E活性迅速增高!
先后出现高峰值!之后又逐渐下降!其中 -BD活性
随着贮藏时间的进一步延长!又出现升高的趋势+
这表明在花粉贮藏过程中!萌发率下降最快期间!
种保护酶活性迅速增高!出现最高峰值!活性增强!
协同作用以抵抗胁迫!在此前后花粉萌发率出现大
幅度下降!推测 种保护酶活性不足以消除因胁迫
而造成的伤害!花粉也会逐渐死亡!表现出花粉活力
迅速下降+
花粉活力在贮藏过程中逐渐降低!花粉细胞内
部的生理代谢活动与加速和抑制其衰老.失活的诸
多因子紧密相关!花粉萌发率是花粉内部保护机制
效果的外在表现+ 本试验显示$室温下耐冬山茶花
粉F\E.-BD较为敏感!室温不适合花粉的长期贮
藏+ )b贮藏温度下 C\E敏感!适合花粉 $ 个月
的短期保存( /"#b. /&#b贮藏温度下 -BD为低
温敏感性保护酶! /&#b适合耐冬山茶花粉的长期
保存+
参考文献!
,$- 中国树木志编委会8中国树木志$ 第 " 册, -`8北京$ 中国林业
出版社!$**)$$+#" /$+#8
,"- 王!翔!刘庆华!王奎玲!等8耐冬山茶"-(B$J6(!W(D"76)( N8#花
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$#,& /$#
,- 杨成利!刘庆华!王奎玲!等8耐冬山茶"-(B$J6( W(D"76)( N8#花
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